2. 中国农业大学动物科学技术学院, 高原畜禽遗传资源研究中心, 北京 100193
2. Plateau Animal and Poultry Genetic Resources Research Center, College of Animal Science and Technology, China Agricultural University, Beijing 100193, China
雪域白鸡，原名拉萨白鸡，于2020年通过国家畜禽遗传资源委员会新品种审定，并正式命名为“雪域白鸡”。雪域白鸡是由白来航鸡和藏鸡杂交选育而来，兼具藏鸡的高原适应性和白来航的高产蛋性能，属于高海拔地区轻型良种蛋鸡品种[1]，为西藏养鸡业带来了较高的经济效益。低氧适应研究一直深受人们的关注。有关低氧感应过程的研究成果获得了2019年的诺贝尔医学或生理学奖。低氧与人类的一些疾病紧密相关，例如心脑血管疾病、缺血性损伤、高原反应等[2-3]，还是肿瘤微环境的重要指标[4]。世居青藏高原等高海拔地区的人类和动物，经过多年的自然选择和遗传变异，形成了独特的生理特征，能够耐受高寒、低氧、低压的环境[5-6]。
鸟类的生殖方式是卵生，胚胎体外发育，对氧气含量的变化非常敏感[7]。已有研究证明，胚胎期是低氧适应的关键时期[8]。雪域白鸡经过多年的选育，已经适应了高原低氧的环境，在海拔3 780 m的环境条件下受精蛋孵化率高达81.33%，而北京油鸡仅为1.00%[9]。心脏是鸡胚适应低氧环境的关键器官，低海拔鸡种在受到低氧刺激时，心脏发育异常，心室壁变薄，心室容积增大，不利于泵血，而青藏高原本土鸡种藏鸡的心脏发育正常[10-11]。本研究选取低海拔鸡种白来航鸡作为对照，将种蛋在高海拔地区(西藏拉萨)进行孵化，采集孵化第16天的鸡胚心脏组织进行转录组测序，鉴定雪域白鸡适应高原低氧环境的关键基因及其调控途径。
1 材料与方法 1.1 试验材料白来航和雪域白鸡的种蛋均在西藏拉萨(平均海拔高度3 650 m)进行孵化，温度37.8 ℃，相对湿度55%，每天翻蛋12次。选取孵化第16天的白来航鸡胚10个(WL-D16, n=10)和雪域白鸡胚10个(XYW-D16, n=10)，采集心脏组织，迅速放置于液氮速冻，然后置于-80 ℃冰箱进行保存。
1.2 总RNA提取及质控取适量心脏组织，研磨棒研磨后，使用Trizol法提取鸡胚心脏总RNA，微量分光光度计NanoDrop 2000 (Thermo, 美国)检测其OD260 nm/OD280 nm值鉴定RNA样品浓度。使用Agient2100/LabChip GX检测RNA的完整性。
1.3 文库构建及测序样品检测合格后，进行文库构建，每组测序文库设3个生物学重复。用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA；加入Fragmentation Buffer将mRNA进行随机打断；以mRNA为模板，合成第一条cDNA链及二链，并进行cDNA纯化；对纯化的双链cDNA进行末端修复、加A尾，并连接测序接头；然后用AMPure XP beads选择380 bp左右的片段；最后通过PCR得到cDNA测序文库。使用Qubit 3.0荧光定量仪库对文库进行初步定量，浓度需达到1 ng·μL-1以上，随后用Qsep400高通量分析系统对文库的插入片段进行检测。文库质检合格后，使用Illumina Nova Seq6000测序平台进行PE150模式测序。
1.4 测序数据处理及差异表达基因筛选对原始数据进行质控，去除含有接头和低质量的reads得到clean reads。使用HISAT2软件将clean reads与参考基因组进行快速精确的比对。利用Stringtie对mapped reads进行组装和定量，采用FPKM (fragments per kilobase of transcript per Million fragments mapped)进行标准化[12]，斯皮尔曼相关系数r (Spearman′s correlation coefficient)作为评估样本间基因表达重复性的指标。以白来航为对照组，采用DESeq2进行基因表达量差异分析[13]，将Fold Change≥2且FDR < 0.05作为筛选标准。
1.5 差异表达基因的功能分析对筛选到的DEGs进行功能富集分析，Gene Ontology(GO)在百迈克在线网站(https://international.biocloud.net/)完成，KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析使用KOBAS在线网站(http://bioinfo.org/kobas/)完成。使用R包ggplot2进行GO和KEGG富集分析可视化。
1.6 转录因子筛选和靶基因预测在线网站AnimalTFDB(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/AnimalTFDB4/#/)可下载鸡的转录因子(TF)列表，与筛选的DEGs进行对比，找到测序数据中差异表达的转录因子。在线网站JASPAR(https://jaspar.genereg.net/)下载转录因子的基序(motif)，选定DEGs转录起始位点(transcription start site，TSS)上游5 000 bp为启动子序列，最后在MEME(https://meme-suite.org/meme/doc/meme.html)网站对基序和启动子序列进行靶向预测，建立TF-targets网络。
1.7 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证选取5个DEGs，肌动蛋白γ2(actin γ2, ACTG2)、钾钙激活通道亚家族M α1(potassium calcium-activated channel subfamily M α1，KCNMA1)、叉头框P2(forkhead box P2，FOXP2)、同源框A2(homeobox A2，HOXA2)、肌动蛋白α2 (actin α2，ACTA2)，在NCBI网站设计引物(表 1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。选取GAPDH为内参基因，对白来航鸡和雪域白鸡样本进行qRT-PCR验证，以检测测序结果及数据分析的准确性。采用2-ΔΔCT法计算基因相对表达量。采用GraphPad Prism 9.5.1软件作图。
|
表 1 qRT-PCR引物 Table 1 qRT-PCR primers |
白来航和雪域白鸡共6个样品的转录组测序数据经过质量控制，共得到38.53 Gb clean data，每个样品的clean data均达到了5.97 Gb及以上，Q30碱基百分比在92.85%及以上。将clean reads与鸡参考基因组CRCg7b进行比对，比对率在92.01%到93.64%之间(表 2)。在白来航和雪域白鸡胚胎心脏组织中共鉴定20 291个阳性表达基因，其中共同表达的基因18 258个。
|
|
表 2 测序样品与参考基因组的序列比对 Table 2 Sequence alignment between the sequenced samples and the reference genome |
白来航与雪域白鸡胚胎心肌组织中筛选到253个DEGs，其中在雪域白鸡中122个基因显著上调，131个基因显著下调(图 1)。差异表达的253个基因主要富集于心肌组织发育调节、心肌细胞增殖、心肌组织生长、肌原纤维、细胞外基质、苹果酸脱氢酶(脱羧)(NADP+)活性、MAP激酶磷酸酶活性、钙释放通道活性和钙离子结合等GO条目(图 2)。
|
灰色是表达差异不显著的基因；红色是表达上调的基因；蓝色是表达下调的基因 Non-differentially expressed genes are showed in grey color; red show upregulated genes; blue show downregulated genes 图 1 差异表达基因的火山图 Fig. 1 Volcanic map of differentially expressed genes |
|
图 2 差异表达基因的GO功能注释 Fig. 2 GO functional annotation of differentially expressed genes |
利用KOBAS数据库分析DEGs功能，发现它们(TENM2、NOG、SMOC1、CCBE1、END2、ACTG2、和MMP2等)主要参与血管平滑肌收缩、MAPK信号通路、血管内皮生长因子信号通路和心肌收缩等途径，这些途径可能参与心脏形态发生和功能。此外DUSP5、UPB1、LPIN2、PLA2G4A和PDGFC等差异表达基因还参与多种代谢途径，包括淀粉和蔗糖代谢、泛酸和辅酶A的生物合成以及甘油磷脂代谢等(图 3)，这些能量代谢途径可能为机体生存和心脏起搏提供能量。
|
图 3 差异表达基因的KEGG通路富集分析 Fig. 3 KEGG pathway enrichment analysis of differentially expressed genes |
经过筛选，差异表达基因中含有2个转录因子，分别是FOXP2和HOXA2。由于motif的每个位点碱基分布频率不同，转录因子和靶基因可能存在一个或多个结合位点(表 3)。通过将motif与启动子序列比对，构建了转录因子与靶基因网络(图 4)，值得注意的是，其中一些靶基因(MMP2、ACTA2、ACTG2和KCNMA1等)的功能富集在血管内皮生长因子信号通路、应对低氧和血管生成等途径，提示与心脏发育和功能有关(图 5)。
|
|
表 3 转录因子与部分靶基因结合位点预测 Table 3 Predicted binding sites of transcription factors to some target genes |
|
红色三角形代表转录因子；蓝色方形代表靶基因(差异表达基因) The red triangles represent transcription factors; The blue squares represent target genes (DEGs) 图 4 转录因子-靶基因预测网络 Fig. 4 Transcription factor-target gene prediction network |
|
蓝色圆形代表转录因子；绿色三角形代表靶基因(差异表达基因)；橙色方形代表通路 Blue circles represent transcription factors; Green triangles represent target genes (DEGs); The orange squares represent the pathways 图 5 转录因子与部分靶基因及通路预测网络 Fig. 5 Transcription factors and partial target genes and pathways prediction network |
选取5个差异表达基因，取白来航和雪域白鸡样品进行qRT-PCR分析，通过log2 (fold change)对差异倍数进行转换。结果如图 6所示，qRT-PCR结果与RNA-seq测序结果表达趋势一致，表明转录组测序结果的真实性和准确性。
|
图 6 qRT-PCR基因表达量结果 Fig. 6 qRT-PCR gene expression results |
氧气是决定胚胎正常发育的关键因素之一，包括心脏发生[14]。心脏发生是一个复杂而精妙的过程，很容易受到自身基因表达变化和外界环境因素的影响而发育异常[15-16]。有研究指出，胎儿在母体子宫内的异常缺氧会对心脏发育产生不利影响，改变心肌结构，导致心功能下降[17]。长期暴露于高海拔地区提高了牦牛对低氧的生理反应，较大的心脏有利于它们适应低氧环境[18]。低氧孵化第16天的藏鸡胚胎心脏组织表达谱显示，藏鸡与低地鸡种差异表达基因主要为FGFR1、CTGF、ADAM9、JPH2、SATB1、BMP4和HYAL1等，这些基因可能参与心肺系统发育[19]。本研究对高海拔孵化第16天的白来航鸡和雪域白鸡胚胎心脏组织进行基因表达谱分析，鉴定出的差异表达基因主要为TENM2、NOG、SMOC1、CCBE1、END2、ACTG2、和MMP2等，这些基因富集在心脏发育和血管发育等通路。这些结果表明，鉴定到的差异基因可能参与鸡胚心血管发育和功能，是研究雪域白鸡适应低氧环境的候选基因。
氧气与能量代谢有紧密的关系，机体生存和运动都离不开ATP供能，而ATP的产生依赖于氧气参与的氧化磷酸化[20]。因此当机体处于低氧环境时，能量代谢也会受到影响。先前的研究将高海拔地区的代谢适应归因于肌肉氧化能力的降低，其中乳酸脱氢酶(LDH)是厌氧糖酵解的关键酶，催化丙酮酸和乳酸之间的转化，在能量代谢过程中起关键作用[21]。高原牦牛背最长肌中的LDH活性较高，能利用有限的氧气促进碳水化合物的利用从而释放能量[18]。还原性辅酶NADH在生化代谢反应中发挥重要作用，例如糖酵解和三羧酸循环等[22]。本研究鉴定的差异表达基因(DUSP5、UPB1、LPIN2、PLA2G4A和PDGFC等)也在能量代谢途径有富集，包括苹果酸脱氢酶(NAD+)活性和丙酮酸代谢等。表明能量代谢方面的差异可能是雪域白鸡适应低氧环境的原因。
转录因子指能够以序列特异性方式结合DNA并且调节转录的蛋白质[23]。转录因子与特异性DNA结合通常概括为“基序”(motif)，可用于扫描较长序列(例如启动子)以鉴定潜在的结合位点，转录因子在基因的启动子区有一个或多个结合位点[24]。转录因子与启动子结合，招募RNA聚合酶或其他因子，促进或者抑制基因的转录，从而调控生物功能[25]。低氧研究的明星基因HIF-1α，作为转录因子激活调控的靶基因表达[26-28]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是HIF的靶基因，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用，缺氧条件下HIF-1可以调节VEGF的表达[29-30]。本研究鉴定了2个重要的转录因子FOXP2和HOXA2，可以靶向调控KCNMA1、CACNG4、SCN4B、WNT2B、MMP2、CCBE1、ACTG2、ACTA2、PLA2G4A和TENM2等基因表达。其中MMP2属于基质金属蛋白酶家族，低氧可以刺激MMP2的表达上调[31]，参与多种生物学功能过程，包括血管平滑肌生长、增殖、迁移、松弛、血管生成和细胞凋亡等，与心血管发育密切相关[32-34]。ACTA2基因编码α-平滑肌肌动蛋白，通常在促进血管运动和收缩的血管平滑肌细胞中表达，参与血管收缩和血压稳态[35-36]。这些基因的功能均与心血管发育相关，参与心脏发育和功能相关通路。因此，本研究认为在低氧适应过程中，这些转录因子可能通过调控靶基因的转录表达而发挥作用，保证雪域白鸡胚胎期心脏正常发育，泵血功能正常，从而适应低氧环境。
4 结论雪域白鸡是西藏自主培育的品种，本研究通过高海拔孵化的鸡胚心脏转录组测序，发现了差异表达基因富集在心脏发育、血管发育和能量代谢途径，鉴定了转录因子FOXP2和HOXA2，它们可能通过调控靶基因的表达参与血管生成和心肌收缩等途径，为进一步研究鸡高原低氧适应分子机制提供了基础。
| [1] |
单增群佩. 拉萨白鸡选育历程的回顾[J]. 西藏农业科技, 2001, 23(3): 57-58. DAN Z Q P. A review of the selection and breeding process of Lhasa white chicken[J]. Tibet Journal of Agricultural Sciences, 2001, 23(3): 57-58. (in Chinese) |
| [2] |
NECHAEVA M V. Physiological responses to acute changes in temperature and oxygenation in bird and reptile embryos[J]. Respir Physiol Neurobiol, 2011, 178(1): 108-117. DOI:10.1016/j.resp.2011.04.003 |
| [3] |
张浩, 吴常信, 强巴央宗, 等. 氧气对低地鸡蛋胚胎死亡和孵化率的影响[J]. 畜牧兽医学报, 2006, 37(2): 112-116. ZHANG H, WU C X, QIANGBA Y Z, et al. Influences of oxygen on embryonic mortality and hatchability of chicken eggs[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2006, 37(2): 112-116. (in Chinese) |
| [4] |
冯静, 袁经纬, 臧蕾, 等. 高海拔环境下不同品种鸡种蛋孵化效果研究[J]. 畜牧与饲料科学, 2018, 39(8): 13-15. FENG J, YUAN J W, ZANG L, et al. Study on the hatching effect of different species of chicken eggs in high altitude area[J]. Animal Husbandry and Feed Science, 2018, 39(8): 13-15. DOI:10.16003/j.cnki.issn1672-5190.2018.08.004 (in Chinese) |
| [5] |
ZHANG H, BURGGREN W W. Hypoxic level and duration differentially affect embryonic organ system development of the chicken (Gallus gallus)[J]. Poult Sci, 2012, 91(12): 3191-3201. DOI:10.3382/ps.2012-02449 |
| [6] |
苟文钰. 鸡胚胎低氧适应表型及心脏组织差异表达基因鉴定[D]. 北京: 中国农业大学, 2015. GOU W Y. Identification of hypoxic adaptation phenotypes and the differential expression genes of myocardial tissue in chicken[D]. Beijing: China Agricultural University, 2015. (in Chinese) |
| [7] |
PERTEA M, PERTEA G M, ANTONESCU C M, et al. StringTie enables improved reconstruction of a transcriptome from RNA-seq reads[J]. Nat Biotechnol, 2015, 33(3): 290-295. DOI:10.1038/nbt.3122 |
| [8] |
LOVE M I, HUBER W, ANDERS S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2[J]. Genome Biol, 2014, 15(12): 550. DOI:10.1186/s13059-014-0550-8 |
| [9] |
YU B Q, WANG X, SONG Y T, et al. The role of hypoxia-inducible factors in cardiovascular diseases[J]. Pharmacol Ther, 2022, 238: 108186. DOI:10.1016/j.pharmthera.2022.108186 |
| [10] |
PENA E, EL ALAM S, SIQUES P, et al. Oxidative stress and diseases associated with high-altitude exposure[J]. Antioxidants (Basel), 2022, 11(2): 267. DOI:10.3390/antiox11020267 |
| [11] |
LI Y, ZHAO L, LI X F. Hypoxia and the tumor microenvironment[J]. Technol Cancer Res Treat, 2021, 20. DOI:10.1177/15330338211036304 |
| [12] |
SIMONSON T S, YANG Y Z, HUFF C D, et al. Genetic evidence for high-altitude adaptation in tibet[J]. Science, 2010, 329(5987): 72-75. DOI:10.1126/science.1189406 |
| [13] |
QI X B, ZHANG Q, HE Y X, et al. The transcriptomic landscape of yaks reveals molecular pathways for high altitude adaptation[J]. Genome Biol Evol, 2019, 11(1): 72-85. |
| [14] |
GIUSSANI D A. Breath of life: heart disease link to developmental hypoxia[J]. Circulation, 2021, 144(17): 1429-1443. DOI:10.1161/CIRCULATIONAHA.121.054689 |
| [15] |
SMITH K L M, SWIDERSKA A, LOCK M C, et al. Chronic developmental hypoxia alters mitochondrial oxidative capacity and reactive oxygen species production in the fetal rat heart in a sex-dependent manner[J]. J Pineal Res, 2022, 73(3): e12821. DOI:10.1111/jpi.12821 |
| [16] |
MENENDEZ-MONTES I, ESCOBAR B, GOMEZ M J, et al. Activation of amino acid metabolic program in cardiac HIF1-alpha-deficient mice[J]. iScience, 2021, 24(2): 102124. DOI:10.1016/j.isci.2021.102124 |
| [17] |
PATTERSON A J, ZHANG L. Hypoxia and fetal heart development[J]. Curr Mol Med, 2010, 10(7): 653-666. DOI:10.2174/156652410792630643 |
| [18] |
AYALEW W, CHU M, LIANG C N, et al. Adaptation mechanisms of yak (Bos grunniens) to high-altitude environmental stress[J]. Animals (Basel), 2021, 11(8): 2344. |
| [19] |
ZHANG Q, GOU W Y, WANG X T, et al. Genome resequencing identifies unique adaptations of Tibetan chickens to hypoxia and high-dose ultraviolet radiation in high-altitude environments[J]. Genome Biol Evol, 2016, 8(3): 765-776. DOI:10.1093/gbe/evw032 |
| [20] |
RADHAKRISHNAN K, LAMANNA J C, CABRERA M E. A quantitative study of oxygen as a metabolic regulator[M]//DUNN J F, SWARTZ H M. Oxygen Transport to Tissue XXIV. Boston: Springer, 2003: 547-554.
|
| [21] |
MARKERT C L. Lactate dehydrogenase.Biochemistry and function of lactate dehydrogenase[J]. Cell Biochem Funct, 1984, 2(3): 131-134. DOI:10.1002/cbf.290020302 |
| [22] |
WILSON D F, MATSCHINSKY F M. Metabolic homeostasis: oxidative phosphorylation and the metabolic requirements of higher plants and animals[J]. J Appl Physiol, 2018, 125(4): 1183-1192. DOI:10.1152/japplphysiol.00352.2018 |
| [23] |
LAMBERT S A, JOLMA A, CAMPITELLI L F, et al. The human transcription factors[J]. Cell, 2018, 172(4): 650-665. DOI:10.1016/j.cell.2018.01.029 |
| [24] |
TOGNON M, GIUGNO R, PINELLO L. A survey on algorithms to characterize transcription factor binding sites[J]. Brief Bioinform, 2023, 24(3): bbad156. DOI:10.1093/bib/bbad156 |
| [25] |
DE MATTOS K, VIGER R S, TREMBLAY J J. Transcription factors in the regulation of leydig cell gene expression and function[J]. Front Endocrinol (Lausanne), 2022, 13: 881309. DOI:10.3389/fendo.2022.881309 |
| [26] |
XU R F, WANG F, YANG H Q, et al. Action sites and clinical application of HIF-1α inhibitors[J]. Molecules, 2022, 27(11): 3426. DOI:10.3390/molecules27113426 |
| [27] |
PENG X F, GAO H, XU R, et al. The interplay between HIF-1α and noncoding RNAs in cancer[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2020, 39(1): 27. DOI:10.1186/s13046-020-1535-y |
| [28] |
WU F, TONG D D, NI L, et al. HIF-1α suppresses myeloma progression by targeting Mcl-1[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2020, 13(7): 1483-1491. |
| [29] |
TANG K C, BREEN E C, WAGNER H, et al. HIF and VEGF relationships in response to hypoxia and sciatic nerve stimulation in rat gastrocnemius[J]. Respir Physiol Neurobiol, 2004, 144(1): 71-80. DOI:10.1016/j.resp.2004.04.009 |
| [30] |
SADEGHI F, KARDAR G A, BOLOURI M R, et al. Overexpression of bHLH domain of HIF-1 failed to inhibit the HIF-1 transcriptional activity in hypoxia[J]. Biol Res, 2020, 53(1): 25. DOI:10.1186/s40659-020-00293-4 |
| [31] |
ZENG W, SU J, WU L, et al. CD147 promotes melanoma progression through hypoxia-induced MMP2 activation[J]. Curr Mol Med, 2014, 14(1): 163-173. DOI:10.2174/15665240113136660077 |
| [32] |
RAFFETTO J D, KHALIL R A. Matrix metalloproteinases and their inhibitors in vascular remodeling and vascular disease[J]. Biochem Pharmacol, 2008, 75(2): 346-359. |
| [33] |
SIEFERT S A, SARKAR R. Matrix metalloproteinases in vascular physiology and disease[J]. Vascular, 2012, 20(4): 210-216. |
| [34] |
WANG X, KHALIL R A. Matrix metalloproteinases, vascular remodeling, and vascular disease[J]. Adv Pharmacol, 2018, 81: 241-330. |
| [35] |
YUAN S M. α-smooth muscle actin and ACTA2 gene expressions in vasculopathies[J]. Braz J Cardiovasc Surg, 2015, 30(6): 644-649. |
| [36] |
KAW A, KAW K, HOSTETLER E M, et al. Expanding ACTA2 genotypes with corresponding phenotypes overlapping with smooth muscle dysfunction syndrome[J]. Am J Med Genet Part A, 2022, 188(8): 2389-2396. |
(编辑 郭云雁)