2. 贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室, 贵阳 550025;
3. 贵州大学动物科学学院, 贵阳 550025
2. Key Laboratory of Animal Genetics and Breeding of Guizhou Province, Guiyang 550025, China;
3. School of Animal Science, Guizhou University, Guiyang 550025, China
香猪是一种原始小型猪种，经济早熟，肉嫩味鲜，皮薄骨细，是加工高档猪肉产品的优质原料；香猪耐粗饲，抗病力强，对气候变化具有较强的适应性，是抗病育种的良好素材；小型猪的生理值与人类相似，是一种理想的实验动物。毛色作为香猪重要的表型特征之一，它在确定品种纯度、亲缘关系和杂交组合以及评价产品质量等方面均有很强的参考价值。随着猪杂种优势的广泛应用，为使商品猪具有理想的毛色，亲本的毛色也成为一个需要认真考虑的性状[1]。因此，揭示猪毛色的遗传机制及其影响毛色的相关基因的遗传规律，对于猪的育种具有重要意义。
猪毛色的形成机制较复杂，是由一系列与黑色素的形成与种类有关的生理、生化反应决定的[2-6]。动物体内的黑色素主要有两种：真黑素和褐黑素，真黑素主要形成黑、褐两种毛色，褐黑素主要形成红色和黄色的毛发[7]。哺乳动物的毛色是由多个基因决定的，这些基因影响着黑色素的生成或黑素细胞的生成、增殖和迁移，如MC1R、TYR家族(TYR、TYRP1、TYRP2)、KIT和MITF等基因可以调节黑色素的沉积而决定动物毛发的颜色。黑色素细胞又称黑素细胞(melanocyte cell, MC)，是合成黑色素的细胞，起源于胚胎神经嵴细胞，主要分布于哺乳动物皮肤(表皮基底层)、毛发基质、黏膜和中枢神经系统(软脑膜)、眼睛(视网膜色素上皮、葡萄膜束)、耳朵(血管纹)中[8]。黑色素生成是一种酶的级联调控，由酪氨酸酶(tyrosinase，TYR)、酪氨酸相关蛋白酶1(tyrosinase-related protein 1，TYRP1)和酪氨酸酶相关蛋白2(tyrosinase-related protein 2，TYRP2)共同调控[9]。TYRP1是黑色素生成过程中的关键酶，哺乳动物皮肤色素的沉着程度取决于它的催化活性[10-11]。Dell′angelica[12]研究发现，TYRP1基因在人黑色皮肤黑素细胞中的表达明显高于白色皮肤。Manga等[13]发现, TYRP1基因突变会引起南非人种产生白化病。Cargill等[14]研究表明，TYRP1基因可能与犬白色背部皮肤上的黑色和褐色斑点的形成有关。覃海等[15]发现, TYRP1基因在剑白香猪黑色被毛皮肤中的表达量显著高于白色被毛皮肤。TYRP1是影响黑色素生成的重要候选基因之一，通过对黑色素生成相关基因的表达调控以及在体内表达产物间相互作用从而调控黑色素的生成。
本研究以香猪表皮黑素细胞为模型，探究敲降TYRP1基因后对香猪表皮黑素细胞TYR基因家族mRNA和蛋白表达及黑色素生成的影响，为研究猪黑色素生成调控机制和毛色相关性状的选育提供有关理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验动物及处理试验动物为贵州大学香猪育种场的3月龄健康香猪3头，具有头部和尾部为黑色、其他部位均为白色被毛的“两头乌”外貌特征。用耳钳和钻孔器分别采集香猪耳朵和背部的皮肤组织，使用75%乙醇消毒后，用含双抗的PBS冲洗3次后放入含双抗的DMEM培养基中并置于冰盒，在2 h内带回实验室进行后续处理。
1.2 主要试剂和器材乙醇、二甲苯、石蜡、4%多聚甲醛(天津市科密欧化学试剂有限公司)、苏木素-伊红染色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)、胎牛血清(FBS)、DMEM培养基(Gibco)、MelM培养基(ScienCell)、0.25% 胰蛋白酶-EDTA(Gibco)、青链霉素混合液(Solarbio)、DispaseⅡ(Gibco)、磷酸盐缓冲液(PBS)、多巴(L-Dopa，Sigma)、逆转录试剂盒(CWBIO)、荧光定量试剂(MagicSYBR Mixture，CWBIO)、2×Taq MasterMix(CWBIO)、LipofectamineTM 2000转染试剂盒(Invitrogen)、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(CWBIO)、PVDF膜、脱脂奶粉、Tween-20(博士德)、蛋白彩虹Maker(Thermo)、甲醇、兔抗多克隆一抗：TYR、TYRP1、TYRP2和MITF (Abcam)，兔抗β-actin多克隆一抗(Abcam)，山羊抗兔二抗(Abcam)等均购自卓一生物技术有限公司。超高速台式冷冻离心机(Thermo SL40)购自德国Thermo Electron公司，PCR扩增仪(C1000 TouchTM)、实时荧光定量PCR仪(Bio Sens SC710)购自美国BIO-RAD公司, CO2细胞培养箱(SERIES Ⅱ WATER JACKET)购自美国Thermo Scientific公司, 倒置荧光显微镜(Nikon C-SHG1)购自日本NIKON尼康公司, 酶标仪(Synergy Mx)购自美国伯腾公司, 超净工作台(SW-CG-1F)购自苏州净化设备有限公司。
1.3 试验方法1.3.1 皮肤组织苏木素-伊红(HE)染色 将采集的皮肤组织放入4%多聚甲醛溶液中过夜固定，用解剖刀修成0.5 cm×0.5 cm的正方形进行脱水、透明。将皮肤组织包埋后修整蜡块，用切片机从蜡块上切下适当长度的蜡带并展片，用载玻片将蜡片捞起置于烘箱中65 ℃烘烤过夜。HE染色前对片子进行脱蜡水化，按照苏木素-伊红(HE)染色试剂盒说明书进行染色。最后用中性树脂进行封片，自然风干后用二甲苯将玻片上多余残留的中性树脂擦掉，再次风干后在显微镜下观察。
1.3.2 香猪表皮黑素细胞培养 在超净台中用剪刀将耳组织多余毛发剪掉，去掉皮下脂肪，用75%乙醇和含1%双抗的PBS交替清洗3次。将清洗好的皮肤剪小至2 mm×5 mm，放入盛有0.15%Dispase Ⅱ酶消化液的离心管中，使消化液没过皮肤组织，37 ℃培养箱中消化2~4 h，期间更换消化液一次。在超净工作台内取出新的培养皿，加入含双抗的PBS溶液，依次洗涤皮肤组织，然后用镊子轻轻将表皮与真皮分离，收集并剪碎表皮并放入15 mL离心管，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液使其没过皮肤组织，置37 ℃水浴锅中消化8~12 min，用倒置荧光显微镜观察细胞消化情况。在消化液中迅速加入等量的含10%胎牛血清的培养基终止消化，200目筛网过滤后400目筛网再次过滤，然后将滤液转移至15 mL离心管中，4 ℃ 1 000 r ·min-1离心10 min。弃上清液，取适量MelM培养基(含1%黑素细胞生长因子、10%胎牛血清、1%双抗)加入离心管中，吹打混匀后形成细胞悬液。将细胞悬液放入培养瓶中，置37 ℃、含5% CO2培养箱中培养，72 h首次换液，之后每2~3 d换液1次，传至4~5代时可获得较纯的黑素细胞。
1.3.3 香猪表皮黑素细胞生长曲线的测定 取处于对数生长期的第4代香猪表皮黑素细胞，将细胞浓度调整为4×104个·mL-1后按200 μL每孔接种于96孔板，置37 ℃、含5% CO2培养箱中培养。24 h后，每日在96孔板上随机选取3个孔做MTT比色试验，共10 d，剩余细胞每2 d换液1次。做MTT比色试验时每个待测孔加入20 μL浓度为0.5%的MTT，培养4 h后吸弃液体，每孔加入100 μL DMSO，置于37 ℃细胞培养箱中孵育30 min，待细胞内结晶充分溶解后，在自动酶标仪490 nm波长下测得吸光度(OD)。以时间(d)为横坐标，OD值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。
1.3.4 香猪表皮黑素细胞的生物学鉴定1.3.4.1 L-Dopa染色 取融合度达80%的第4代黑素细胞，弃去培养瓶中原有培养基，PBS清洗细胞3次后使用4%多聚甲醛固定30 min。固定完成后弃去固定液，PBS清洗3次，使用0.3% TritonX-100对细胞进行通透30 min。PBS对细胞冲洗3次后使用0.1% L-Dopa染色液对细胞进行染色，放入37 ℃培养箱孵育，2 h时更换染液，接着再孵育2 h。染色结束后PBS冲洗细胞，显微镜观察，细胞胞浆内观察到黑色或棕色的色素颗粒，说明该细胞为黑素细胞。
1.3.4.2 实时荧光定量PCR鉴定 黑素细胞内有特异基因表达，如：TYR、TYRP1、TYRP2、MITF、KIT等，运用实时荧光定量PCR技术检测细胞中毛色相关基因的表达水平，以此来鉴定黑素细胞。取融合度达80%的第4代细胞，利用Trizol试剂盒提取细胞总RNA，并反转录cDNA。以RPS18作为内参基因，根据美国国立生物技术信息中心(NCBI)GenBank中公布的野猪(Sus scrofa)序列，用Premier 5.0软件设计引物，引物由北京擎科生物技术有限公司合成，序列见表 1。
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表 1 引物序列信息 Table 1 Primers sequence information |
1.3.4.3 Western Blot鉴定 检测细胞中毛色相关蛋白TYR、TYRP1、TYRP2和MITF的表达水平，以此来鉴定黑素细胞。将融合度达80%的第4代黑素细胞用PBS洗涤3次后使用蛋白裂解液分离提取香猪黑素细胞的总蛋白，并使用BCA法检测蛋白浓度，调整蛋白浓度后100 ℃水浴锅中水浴3 min使蛋白变性。按照SDS-PAGE凝胶试剂盒操作说明配胶，电泳使蛋白分离，每组设置3个重复。按照蛋白Marker说明切下含有目的蛋白的胶条，将目的蛋白转移到PVDF膜上后使用含5%脱脂奶粉的TBST封闭3 h，然后与兔抗TYR、TYRP1、TYRP2和MITF及内参兔抗β-actin在4 ℃垂直摇床上孵育过夜。用TBST洗涤3次后，将膜与HRP标记的山羊抗兔抗体在37 ℃下孵育2 h。采用均匀涂抹超敏ELC发光液，采集图像后胶片曝光。
1.3.5 小干扰RNA(siRNA-TYRP1)的合成 根据香猪TYRP1基因(GenBank No.: 537161)全序列，由上海吉玛生物科技有限公司合成5个siRNA序列，如表 2所示。
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表 2 siRNAs片段详细信息 Table 2 Fragment details for siRNAs |
1.3.6 细胞转染 将培养瓶内的黑素细胞用胰酶消化后铺至细胞6孔板中继续培养，待细胞贴壁后更换培养基。在倒置荧光显微镜下观察细胞，待细胞生长密度达80%时开始进行转染，将5种小干扰RNA和一组对照组(NC)转染进细胞，每组处理设置3个重复。按照转染试剂盒操作说明进行转染。
1.3.7 实时荧光定量PCR检测毛色相关基因表达 转染48 h后，用Trizol法提取RNA并反转录为cDNA，运用实时荧光定量PCR技术检测香猪黑色素细胞转染TYRP1-siRNA后TYR、TYRP1和TYRP2基因在mRNA表达水平的变化。实时荧光定量PCR反应的引物序列见表 1。
1.3.8 Western Blot检测毛色相关蛋白表达 转染48 h后提取黑素细胞总蛋白，调整蛋白浓度并变性后进行Western Blot试验检测TYR、TYRP1和TYRP2的蛋白表达水平，内参选用兔抗β-actin，每组设置3个重复。
1.3.9 黑素细胞中总黑色素含量的测定 转染48 h后，PBS吹洗并消化计数。细胞悬液4 ℃，12 000 r ·min-1离心10 min后弃上清，PBS清洗3次后再次离心，弃去PBS。在沉淀中加入300 μL的1 mol ·L-1 NaOH溶液，充分溶解后，80 ℃金属浴裂解30 min。取溶解后的样品，10 000 r ·min-1离心10 min，取上清，设3个重复，酶标仪475 nm波长下测其OD值，记录数据，分析计算黑色素含量的变化。
1.4 数据统计分析通过2-ΔΔCt法对实时荧光定量PCR数据进行计算分析。对获得的目的蛋白图像利用Image J软件测定灰度值并进行半定量分析。Excel表格分析处理数据，数据用“Means±SD”表示，采用SPSS 19.0统计软件进行单因素方差分析检验。单独两样品之间利用t检验法检测差异显著性；*.P < 0.05为差异显著，**.P < 0.01为差异极显著；样本重复数n=3，最后利用prism软件绘图。
2 结果 2.1 香猪皮肤黑素细胞的组织学形态分析对黑色和白色香猪皮肤进行横切和纵切，经过HE染色观察到香猪不同颜色被毛皮肤中黑素细胞的分布特征，并观察到完整的毛囊结构。图 1显示, 黑素细胞主要分布在香猪黑色被毛皮肤中的毛囊外根鞘部位以及表皮，黑色素颗粒主要在皮肤表皮的基层、毛囊的毛干以及毛乳头部位沉积，香猪白色被毛皮肤组织中并未观察到黑色颗粒的沉积。
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A、D. 黑色和白色皮肤毛囊横切图(200×)；B、E. 黑色和白色皮肤毛囊纵切图(200×)；C. 成熟的黑色毛发毛囊结构图(100×)；F. 成熟的黑色毛发毛囊的纵切结构图(100×)。1. 黑色素颗粒；2.黑素细胞；3.毛乳头；4.毛根；5.毛干 A, D. The transverse sections of hair follicles of black and white colors (200×); B, E. The longitudinal map of hair follicles of black and white colors(200×); C. The structure of mature black hair follicles (100×); F. The longitudinal structure of mature black hair follicles (100×). 1. Melanin granules; 2. Melanocytes; 3. Hair papilla; 4. Hair root; 5. Hair shaft 图 1 香猪不同颜色皮肤HE染色 Fig. 1 HE staining of skin with different colors of Xiang pigs |
使用倒置显微镜对细胞形态进行观察，原代培养2 h后，培养基中黑素细胞和角质形成细胞交叉分散，少部分细胞开始贴壁(图 2A)；12 h后，基本贴壁完全，在角质形成细胞中散在分布椭圆形、三角形或两极树突状细胞(图 2B)；24 h后，大部分细胞胞体椭圆，含2个对称树突；少数细胞胞体呈多角形或不规则形，含2个或以上树突(图 2C)。培养约10 d后可初次传代，传至第4代时，可分离出密度较大较纯的香猪表皮黑素细胞(图 2D)。
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A. 培养2 h的黑素细胞；B. 培养12 h的黑素细胞；C. 培养24 h的黑素细胞；D. 第4代黑素细胞。↑为黑素细胞 A. The melanocytes cultured for 2 h; B. The melanocytes cultured for 12 h; C. The melanocytes cultured for 24 h; D. The 4th generation melanocytes. ↑ showed the melanocytes 图 2 体外培养的香猪表皮黑素细胞 Fig. 2 Cultured Xiang pig skin melanocytes in vitro |
由图 3可知，第4代黑素细胞生长曲线呈“S”型，符合细胞生长规律。培养第1~3天时细胞增殖缓慢，处于潜伏期；第4~8天大量生长，进入对数生长期；第8天后生长开始减缓甚至停滞，进入平台期。
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图 3 香猪表皮黑色素细胞生长曲线 Fig. 3 The growth curve of the Xiang pig skin melanocytes |
2.4.1 L-Dopa染色 第4代原代表皮黑素细胞多巴染色呈阳性，细胞质及细胞核被染成棕黑色，细胞质内可见黑色色素颗粒(图 4)。
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图 4 第4代香猪表皮黑素细胞多巴染色 Fig. 4 The Xiang pig skin melanocytes of passage 4 stained by L-Dopa |
2.4.2 香猪表皮黑素细胞标志基因的实时荧光定量PCR检测 对第4代香猪表皮黑素细胞进行TYR、TYRP1、TYRP2、MITF和KIT基因的实时荧光定量PCR检测，结果显示，第4代细胞中TYR、TYRP1、TYRP2、MITF和KIT基因均有表达(图 5)。说明香猪表皮黑素细胞系在第4代保持着特有的基因和生物学活性。
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图 5 TYR、TYRP1、TYRP2、MITF和KIT在香猪表皮黑素细胞中的表达 Fig. 5 Expression levels of TYR, TYRP1, TYRP2, MITF and KIT in Xiang pig epidermis melanocytes |
2.4.3 Western Blot鉴定 对第4代香猪表皮黑素细胞中TYR、TYRP1、TYRP2和MITF的蛋白表达水平进行检测，结果显示，第4代细胞中TYR、TYRP1、TYRP2和MITF蛋白均有表达(图 6)。说明香猪表皮黑素细胞系在第4代保持着特有的蛋白和生物学活性。
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图 6 香猪表皮黑素细胞中TYR、TYRP1、TYRP2和MITF蛋白的表达 Fig. 6 TYR, TYRP1, TYRP2 and MITF proteins expression in Xiang pig epidermis melanocytes |
将TYRP1基因的5条siRNAs和对照组NC分别转染香猪黑素细胞，培养细胞48 h后进行干扰效率检测。结果表明，TYRP1基因的mRNA表达量较对照均显著下降(P < 0.01)，其中si-TYRP1-4干扰效率最高，达到76.99%(P < 0.01)(图 7)。因此选择si-TYRP1-4用于后续试验。
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图 7 黑素细胞中TYRP1基因的沉默效率检测 Fig. 7 Detection of silencing efficiency of TYRP1 gene in melanocytes |
实时荧光定量PCR结果显示, 与NC转染组相比，si-TYRP1转染组中TYR、TYRP1、TYRP2基因的mRNA相对表达水平均显著下降(P < 0.01, 图 8)。
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图 8 转染TYRP1-siRNA后黑素细胞内TYR、TYRP1、TYRP2基因的表达 Fig. 8 Expression of TYR, TYRP1 and TYRP2 genes in melanocytes after transfection of TYRP1-siRNA |
Western Blot结果显示, 与NC转染组相比，si-TYRP1转染组中TYR、TYRP1、TYRP2蛋白相对表达水平均显著降低(P < 0.01, 图 9)。
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图 9 转染TYRP1-siRNA后黑色素细胞内TYR、TYRP1、TYRP2蛋白的表达 Fig. 9 Protein expression of TYR, TYRP1 and TYRP2 in melanocytes after transfection of TYRP1-siRNA |
黑色素含量测定结果显示，与NC转染组相比，si-TYRP1转染组的黑色素含量降低了24.78%(P < 0.01, 图 10)。说明敲降TYRP1基因可抑制黑色素的生成。
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图 10 转染TYRP1-siRNA后黑素细胞内黑色素含量的变化 Fig. 10 Changes of melanin content in melanocytes after transfection of TYRP1-siRNA |
黑素细胞主要有3类，第一类分布在表皮中，很少增殖分化，主要功能为生成黑色素抵御紫外线的伤害；第二类是分布在毛囊中的黑素细胞，每个毛发生长周期中都会重复的增殖分化，不生成黑色素颗粒，主要是体内黑素细胞的来源；第三类是分布在毛球部位，这类黑素细胞不能增殖分化，但是能产生大量的黑色素颗粒，是由毛囊中的黑素细胞分化而来的[16]。高泽成等[17]研究发现，在牦牛皮肤中，黑色素颗粒主要分布在黑色被毛的毛干中，其次在毛乳头、毛囊外根鞘、皮肤表皮基底层也有分布，黑素细胞主要分布在皮肤表皮、毛囊与毛囊周围。谢光跃等[18]发现，在乌骨山羊中，黑色被毛毛囊外根鞘一周的黑色素细胞呈高度空泡状, 周围分布着大量黑色素颗粒，和周围细胞区分明显；而白色被毛毛囊外根鞘部位的黑色素细胞树突不明显，与周围细胞很难以肉眼区分，周围没有明显的黑色素颗粒。张建等[19]提到有色毛猪的毛根和毛囊中的成熟黑素细胞中充满黑色素颗粒；而白毛猪的毛囊中没有黑素细胞，且毛囊细胞较小。本研究结果显示, 黑素细胞主要分布在香猪黑色被毛皮肤中的毛囊外根鞘部位以及表皮。黑色素颗粒主要在皮肤表皮的基层，毛囊的毛干以及毛乳头部位沉积，而香猪白色被毛皮肤组织中并未观察到黑色颗粒的沉积。黑素细胞合成色素颗粒是动物毛色形成的基础，黑色素的数量和种类决定了动物的毛色和肤色。本研究在参考前人研究方法的基础上加以改进，使用DispaseⅡ和胰酶-EDTA两步法在体外成功分离培养了香猪表皮黑素细胞，并对其生长特性、特异基因及编码蛋白表达、多巴染色进行了观察，结果与前人[20-22]对黑素细胞的鉴定结果一致，表明培养的黑素细胞保持了正常的生物学特性。为后续试验提供了细胞模型。
TYRP1是第一个克隆成功的色素基因，在黑色素生物的形成途径中起到了关键作用[23]。由于TYRP1基因编码蛋白与酪氨酸酶同源，因而被称为酪氨酸酶相关蛋白1[24]。此前有报道称，TYRP1在内质网中充当TYR的伴侣，这增加了TYR的稳定性，并表明这两种蛋白质在黑素体内形成二聚体[25-26]。TYRP1基因有二硫氧基吲哚酸氧化酶的功能，在黑素细胞合成黑色素的下游途径中发挥重要作用，并影响了黑素细胞的增殖凋亡、黑色素小体的成熟、黑色素的超微结构、黑色素合成过程、黑色素瘤细胞的生长、形态和TYR的活力等[27]。在黑色素合成过程中，TYRP1影响真黑色素与伪黑色素的转换，高活性TYRP1导致真黑色素的产生，反之则产生伪黑色素[28-29]。到目前为止，TYRP1已经在常见动物，如绵羊、小鼠、禽类、水产动物鱼类等多个物种中参与色素的沉积，但在猪上的研究则比较匮乏。Wu等[30]发现, 五指山猪黑色皮肤和白色皮肤中TYRP1的表达存在差异。Ren等[31]发现, 凉山猪的金色表型与TYRP1的显性突变有关；TYRP1基因中6 bp缺失导致中国本土猪棕色表型[32]。
Small interfering RNA (siRNA)是一类长约21~25 bp的小RNA分子，能够激发与之互补的靶mRNA的沉默[33-34]。Li等[35]发现, 在体外敲降TYRP1能促进MHC1的表达，并作为治疗黑色素瘤的一个潜在靶点。Gilot等[36]在体外敲降TYRP1后恢复了miR-16的黑色素瘤抑制功能。为了证明TYRP1与香猪黑色素生成有关，本试验通过siRNA敲降，降低TYRP1基因在香猪黑素细胞中的表达，进一步研究了TYRP1与毛色相关基因表达之间的关系。结果表明, 敲降TYRP1后会抑制黑色素生成相关基因TYR、TYRP1和TYRP2及其编码蛋白的表达，从而抑制香猪表皮黑素细胞中黑色素的生成。TYRP1基因及其编码蛋白的表达下调是由于TYRP1的直接敲降引起的，TYRP1表达降低会导致TYR和TYRP2的表达降低。虽然TYRP1能够影响黑素细胞中黑色素的生成，但其调控机制还需进一步试验加以验证。
4 结论本研究通过HE染色观察香猪皮肤毛囊结构及黑素细胞的分布特征，利用两步法体外分离培养香猪表皮黑素细胞并进行了鉴定，为香猪毛色基因功能研究提供细胞模型。结果表明，干扰TYRP1后香猪表皮黑素细胞中TYR、TYRP1和TYRP2基因mRNA及其编码蛋白的表达下调，并且抑制了黑色素的生成。本研究结果为进一步探究TYRP1对黑色素生成及沉积的调控机制提供了试验参考和基础数据。
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(编辑 郭云雁)