2. 南京农业大学动物医学院, 南京 210014
2. College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)是一种单股正链RNA病毒，基因变异率高，严重危害世界养猪业健康发展[1]。目前商品化猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫保护效力有限，给我国养猪业带来了巨大损失[2-3]。近20多年来，国内外学者对该病毒致病和免疫机制做了广泛研究，揭示了多种宿主拮抗蛋白分子，但PRRSV感染和致病机制尚不十分清楚，临床上尚无有效治疗药物。N蛋白是PRRSV编码的核衣壳蛋白，在病毒的致病和免疫机制中发挥重要作用，但其与宿主蛋白的相互作用机制也不十分全面[4-5]。深入研究PRRSV N蛋白与宿主细胞蛋白相互作用机制，对揭示该病毒致病机制、预防和控制该病毒感染具有重要理论意义和应用前景。
酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system，Y2H)是研究蛋白质相互作用的一种重要技术手段[6-7]。本研究构建PRRSV天然靶器官——猪肺酵母双杂交cDNA文库，继而以PRRSV N蛋白为诱饵蛋白，利用Y2H方法筛选猪肺酵母双杂交cDNA文库，研究核糖体蛋白S20 (ribosomal protein S20，RPS20)与N蛋白的相互作用，确定RPS20对PRRSV复制的影响，为N蛋白在PRRSV感染中的功能及宿主蛋白RPS20在PRRSV复制中发挥的作用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料1.1.1 细胞、病毒和肺组织 本试验选用MARC-145细胞(非洲绿猴肾上皮细胞)及高致病性PRRSV毒株BB0907(由南京农业大学姜平教授馈赠)。仔猪肺组织和PAMs(猪肺泡巨噬细胞)采自4周龄健康仔猪，其PRRSV、PCV2、PRV和CSFV病毒核酸和抗体均为阴性。
1.1.2 主要试剂 RNA提取试剂TRIzol Reagent购自Invitrogen公司；cDNA文库构建试剂盒Make Your Own “mate & plate” Library System kit、酵母感受态制备及转化试剂盒YeastmakerTM Yeast Transformation System 2、LD-PCR试剂盒Advantage 2 Polymerase Mix、文库质粒插入片段检测试剂Matchmaker Insert Check PCR Mix 2、酵母菌株Y2HGold和Y187、酵母表达质粒pGBKT7、pGADT7、pGADT7-T、pGBKT7-p53(阳性对照质粒，p53蛋白与T蛋白互作)和pGBKT7-Lam(阴性对照质粒，Lam蛋白不与T蛋白互作)以及各种酵母培养基均购自Clontech公司。Flag单抗购自Abmart公司；HA单抗购自巴傲德公司；IRDye 800CW的山羊抗小鼠/兔IgG(H-L)购自LI-COR公司。
本试验所用的三对siRNA是根据NCBI中猪源RPS20基因序列(DQ629171.1)基因设计，由吉玛基因公司合成，具体序列如表 1。
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表 1 干扰RPS20序列 Table 1 siRNA sequence |
1.2.1 猪肺酵母双杂交cDNA文库的构建 采取4周龄健康仔猪(PRRSV、PCV2、PRV和CSFV核酸和抗体均为阴性)肺组织，提取总RNA，以SMART技术合成第一条cDNA链，通过LD-PCR技术扩增成双链DNA，并将纯化后的双链DNA和线性化的酵母表达载体pGADT7载体一起转化入酵母Y187菌株，利用酵母细胞内的同源重组酶活性，完成二者的连接重组。最终收集转化外源基因的酵母菌。对文库的插入片段和文库库容量进行检测。
1.2.2 重组质粒的构建与鉴定 根据GenBank中公布的猪源RPS20基因序列(DQ629171.1)和PRRSV BB0907 ORF7(HQ315835.1)的基因序列设计引物。利用TRIzol抽提猪肺泡巨噬细胞和PRRSV接种细胞的总RNA，反转录成cDNA后，利用RT-PCR方法分别扩增RPS20基因和ORF7基因，并将其分别克隆至pcDNA3.1(+)中。
将ORF7基因构建入酵母表达质粒pGBKT7中。获得重组质粒经序列比对鉴定正确后命名为pcDNA3.1-RPS20-HA、pcDNA3.1-N-Flag和pGBKT7-N。所有得到的重组质粒均经测序验证。所用引物见表 2。
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表 2 重组质粒引物 Table 2 Primers for recombinant plasmid |
1.2.3 文库筛选 将pGBKT7-N质粒转化至酵母Y2HGold中，涂布于SD/-Trp琼脂培养基平板上，挑取形态规则的单菌落接种至50 mL SD/-Trp液体培养基，过夜，培养液离心去上清，将酵母沉淀用SD/-Trp液体培养基重悬，加入猪肺酵母双杂交cDNA文库进行杂交，显微镜下观察到三叶草形状酵母菌(酵母菌杂交)时，将杂交产物涂布在QDO(SD/-His/-Trp/-Leu)培养基上，将QDO培养基上生长出的粉白色菌落，挑取于QDO/X/A(SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA)平板划线培养，对生长状态良好的蓝色单菌落进行提取质粒并测序，经NCBI的BLAST数据库比对分析所得到的基因序列，以确定捕获的宿主蛋白。
1.2.4 免疫共沉淀 将MARC-145细胞铺于24孔板中，37 ℃，5% CO2恒温培养箱中培养至细胞汇合度达80%，共转染0. 5 μg pcDNA3.1(+)-RPS20-HA和0.5 μg pcDNA3.1(+)-N-Flag，24 h后收集蛋白样品，加入1 μg鼠抗HA单克隆抗体，4 ℃摇床中孵育8 h。加入50 μL的Protein A+G琼脂糖珠，4 ℃摇床中继续缓慢摇动孵育3 h。2 500 r·min－1离心5 min，PBST洗涤，重复该过程4次。加入5×Loading Buffer，沸水煮10 min，进行Western blot。
为确定内源PRRSV N蛋白与RPS20蛋白的互作。待生长在24孔细胞板中的MARC-145细胞的汇合度达到80%，转染0.5 μg的RPS20-HA真核表达质粒，12 h后接种0.1 MOI PRRSV，接毒24 h后用鼠抗HA单克隆抗体进行Co-IP试验。
1.2.5 激光共聚焦试验 将MARC-145细胞接种在细胞爬片上，待汇合度达到60%时，转染1 μg pcDNA3.1(+)-N-Flag，24 h后用4%多聚甲醛固定15 min；0.1% Triton X-100对细胞进行透膜30 min；加入特异性抗体鼠抗Flag(1∶1 000稀释)和兔抗RPS20(1∶500)，孵育1 h；经PBST充分洗涤后加入对应荧光二抗，37 ℃孵育45 min；弃二抗充分洗涤后，加入终浓度为1 mmol·L-1 DAPI/PBS孵育10 min，用中性树脂封片后至共聚焦显微镜下观察结果。
1.2.6 过表达RPS20对PRRSV增殖影响的测定 将MARC-145细胞以每孔105个·500 mL-1铺于24孔板中，37 ℃ 5% CO2培养箱中培养，待细胞长至70%~80%时依据LipofectamineⓇ 3000说明书进行转染。37 ℃温箱培养36 h后可收取细胞及上清，分别通过病毒滴度测定、荧光定量PCR或Western blot进行检测。
1.2.7 siRNA转染及筛选 参照LipofectamineⓇ 2000说明书转染48 pmol·L-1干扰片段至MARC-145细胞中，于24和36 h收集细胞进行实时荧光定量PCR测定RPS20的表达水平，筛选效果最好的沉默基因进行Western blot，验证其对内源性RPS20蛋白的干扰效果。
1.2.8 相对荧光定量PCR 每孔MARC-145细胞加入200 μL TRIzol收集细胞，按照总RNA提取试剂盒提取细胞中的总RNA，依据HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis进行RNA反转录，以得到的cDNA为模板，依据qPCR SYBE Green Master Mix说明书配制反应体系及设置反应程序。设定阴性对照，获得Ct值。目的基因的mRNA的相对表达采用2-ΔΔCt法分析[8]。所有处理组均重复检测3次。所用引物见表 3。
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表 3 重组质粒引物 Table 3 Primers for quantitative fluorescence |
本研究中Western blot所得蛋白条带使用Image J软件对灰度值进行三次扫描，进行统计分析。使用GraphPad prism 8.0软件(One-way ANOVA test)进行统计学分析绘图，所有数据都被表示为平均值±标准差(x±s)，P < 0.05(*)表示差异显著，P < 0.01(**)和P < 0.001(***)表示差异极显著。
2 结果 2.1 猪肺酵母双杂交cDNA文库的构建及筛选为了筛选与PRRSV N蛋白互作的宿主蛋白，本试验通过采取4周龄健康仔猪(PRRSV、PCV2、PRV和CSFV核酸和抗体均为阴性)肺组织构建cDNA文库。将所构建文库稀释涂布于SD/-Leu平板(图 1A)，经两次稀释涂板计算得到文库滴度为5 × 106 CFU·mL-1，cDNA文库容量为7.5×107 CFU，符合酵母双杂交筛选要求。进一步挑取15个单菌落进行PCR鉴定，结果显示：扩增产物长度大小主要集中在300~2 000 bp(图 1B)，平均长度约为500 bp，且同源重组率达到87%。上述结果表明，cDNA文库质量合格，可用于后续酵母双杂交试验。
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A.酵母双杂交文库总容量数的测定；B. 随机挑选15个菌落PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析结果(1~15. 随机挑取的15个菌落的PCR产物；M1. DS2000 DNA相对分子质量标准；M2. DL10000 DNA相对分子质量标准)；C. 电子显微镜观察下的三叶草结构；D. 在QDO和QDO/X/A平板上酵母双杂交结果电子显微镜观察结果 A. Determination of the total volume number of yeast two-hybrid libraries; B. Agarose gel electrophoresis of PCR products from 15 colonies randomly selected(1-15. Normalized effect of 15 PCR products randomly selected; M1. DS2000 DNA marker; M2. DL10000 DNA marker); C. The structure of a cloverleaf under electron microscopic observation; D. Results of yeast two-hybridization on QDO and QDO/X/A plates 图 1 猪肺酵母双杂交cDNA文库构建及筛选 Fig. 1 Construction and screening of porcine lung yeast two hybrid cDNA library |
以PRRSV N蛋白作为诱饵，与猪肺cDNA酵母文库进行杂交，在显微镜下观察到三叶草型二倍体酵母菌，表明诱饵酵母Y2HGold与文库酵母Y187发生了杂交融合(图 1C)。将Y2HGold [pGBKT7-p53]和Y187[pGADT7-T]的混合菌液分别涂布于QDO(SD/-His/-Trp/-Leu)及QDO/X/A(SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA)培养基，并将Y2HGold[pGBKT7-Lam]和Y187[pGADT7-T]的混合菌株设为阴性对照。结果显示，试验组及阴性对照组在QDO培养基上生长均呈现粉白色，试验组在QDO/X/A培养基中生长呈现蓝色而阴性对照组在QDO/X/A培养基上无菌落生长，证明本杂交系统成立。将试验组在QDO平板上生长出的粉白色菌落进一步接种于QDO/X/A平板上，生长出三个蓝色菌落并将其扩大培养，提取酵母质粒进行测序，其中两个菌落内质粒包含片段与40S核糖体蛋白S20(RPS20)的第87—357位氨基酸序列相似性达到100%(图 1D)。初步判定PRRSV N蛋白能够与RPS20第87—357位氨基酸在酵母细胞内发生互作关系。
2.2 确定N蛋白与RPS20互作关系为进一步验证N蛋白与RPS20蛋白之间的相互作用，构建真核表达质粒pcDNA3.1-RPS20-HA和pcDNA3.1-N-Flag，共转染至MARC-145细胞，进行免疫共沉淀试验。结果显示N蛋白与RPS20蛋白在细胞内存在互作(图 2A)。同时将pcDNA3.1-RPS20-HA转染至MARC-145细胞，感染0.1 MOI PRRSV，24 h后收集蛋白样品进行免疫共沉淀，结果显示RPS20蛋白可以与病毒感染后的细胞内的N蛋白相互结合(图 2B)。
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A. RPS20与PRRSV N蛋白互作的鉴定；B. RPS20与内源性PRRSV N蛋白互作的鉴定；C. 激光共聚焦试验检测过表达的N和细胞内源RPS20亚细胞定位 A. Identification of the interaction between RPS20 and N; B. Identification of interaction between RPS20 and endogenous PRRSV N protein; C. Detection of the subcellular localization of exogenous RPS20 and N protein 图 2 RPS20与PRRSV N蛋白互作的验证 Fig. 2 The interaction between RPS20 and PRRSV N protein was identified |
采用激光共聚焦检测N蛋白与RPS20蛋白在MARC-145细胞内的亚细胞定位。在转染了pcDNA3.1-N-Flag细胞中，N蛋白主要定位于细胞质中；RPS20定位在细胞核与细胞质中，N与内源性RPS20共定位于细胞质中(图 2C)。
2.3 过表达RPS20对PRRSV在MARC-145中复制的影响为验证RPS20蛋白对PRRSV复制的影响，首先将不同剂量pcDNA3.1-RPS20-HA转染MARC-145细胞，24 h后检测细胞活力，结果显示质粒转染量≤1 μg时对MARC-145细胞并无细胞毒性(图 3A)。转染pcDNA3.1-RPS20-HA和pcDNA3.1-HA空载后24 h感染PRRSV(0.1 MOI)，分别于感染后24和36 h收集细胞和上清，分别测定病毒滴度和ORF7 mRNA表达水平。结果显示，转染pcDNA3.1-RPS20-HA的细胞组病毒滴度低于空载组(图 3B)，ORF7 mRNA表达量低于空载组(图 3C)。进而将0、0.5、1.0 μg pcDNA3.1-RPS20-HA转染MARC-145细胞，24 h后感染0.1 MOI PRRSV，通过荧光定量PCR、Western blot、TCID50方法检测RPS20蛋白对PRRSV复制的影响。结果显示，随着pcDNA3.1-RPS20-HA转染量的增加，病毒滴度(图 3D)、PRRSV ORF7 mRNA表达量(图 3E)和N蛋白表达水平(图 3F)均显著降低，表明过表达RPS20降低PRRSV在MARC-145中的复制水平，且呈剂量依赖性。
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A. CCK-8法测定质粒对细胞的毒力影响；B. TCID50法测定RPS20对PRRSV毒力的影响；C. qPCR法测定RPS20对PRRSV复制的影响；D. 不同剂量RPS20对PRRSV滴度的影响；E. qPCR法测定不同剂量RPS20对PRRSV复制的影响；F、G. Western blot法及蛋白灰度值统计测定不同剂量RPS20对PRRSV复制的影响。*.P < 0.05；**.P < 0.01；***.P < 0.001；****.P < 0.000 1 A. The effect of RPS20 on cell viability was detected by CCK-8 method; B. The effect of RPS20 on PRRSV virulence was detected by TCID50 method; C. The effect of RPS20 on PRRSV replication was detected by qPCR method; D. The effect of different doses of RPS20 on PRRSV virulence; E. The effect of different doses of RPS20 on PRRSV replication was detected by qPCR method; F, G. The effect of different doses of RPS20 on PRRSV replication determined was detected by Western blot method and statistics of protein band gray value. *.P < 0.05; **. P < 0.01; ***. P < 0.001; ****. P < 0.000 1 图 3 过表达RPS20对PRRSV在MARC-145中复制的影响 Fig. 3 Effect of overexpression of RPS20 on replication of PRRSV in MARC-145 |
将48 pmol·L-1的siRPS20和无关对照NC转染至MARC-145细胞中，分别在24和36 h收集细胞，通过qPCR测定细胞中的RPS20 mRNA表达量。图 4A结果显示，siRNA-129在24和36 h均能降低RPS20 mRNA表达量。转染siRPS20-129后36 h收集细胞蛋白，结果显示siRNA-129可有效降低细胞内RPS20蛋白表达量(图 4B、C)。
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A. 通过荧光定量PCR筛选出有效的siRPS20；B、C. 使用siRNA-129后RPS20的蛋白质表达及蛋白灰度值统计图；D.通过qPCR检测siRNA-129对PRRSV复制的影响；E.通过TCID50试验检测siRNA-129对PRRSV的影响；F~H.通过Western blot及蛋白灰度值统计检测siRNA-129对PRRSV复制的影响。*.P < 0.05；**.P < 0.01；***.P < 0.001；****.P < 0.000 1 A. Screening of the effective siRPS20 by fluorescence quantitative PCR; B, C. Protein expression of RPS20 after using siRNA-129 and statistical diagram of protein band gray value; D. The effect of siRNA-129 on PRRSV replication was detected by qPCR; E. The effect of siRNA-129 on PRRSV was detected by TCID50assay; F-H. The effect of siRNA-129 on PRRSV replication was detected by Western blot and statistics of protein band gray value. *.P < 0.05; **. P < 0.01; ***. P < 0.001; ****. P < 0.000 1 图 4 干扰RPS20对PRRSV在MARC-145中复制的影响 Fig. 4 Effect of siRPS20 on PRRSV replication in MRAC-145 |
为了验证干扰RPS20蛋白对PRRSV复制的影响，将siRNA-129转染MARC-145细胞，同时转染siRNA-NC为对照组；24 h后感染0.1 MOI PRRSV，36 h后分别收取核酸及蛋白样品。通过荧光定量PCR、病毒滴度测定和Western blot检测病毒的复制水平。结果显示，转染siRNA-129可以显著增多PRRSV感染细胞内ORF7的mRNA拷贝数(图 4D)、病毒蛋白的表达量(图 4F~H)，并增高病毒的滴度(图 4E)。以上结果说明干扰细胞内RPS20蛋白的表达，可以促进PRRSV在MARC-145中的复制。
2.5 RPS20对PRRSV在PAMs中复制的影响猪是PRRSV的天然宿主，PAMs是其天然靶细胞，通过对NCBI公布的猪源(NP_001123426.1)与猴源(XP_007998872.1)RPS20蛋白的氨基酸序列进行序列比对，RPS20蛋白在猪与非洲绿猴的相似性高达99.16%。提示在PAMs内RPS20可能对PRRSV复制发挥作用。首先探究PRRSV增殖是否影响PAMs内RPS20蛋白的表达，试验采用0.01MOI、0.1MOI和1MOI PRRSV感染PAMs，24 h后收集细胞蛋白，通过Western blot方法及灰度值统计分析测定RPS20的蛋白表达量。结果显示PAMs中不同剂量PRRSV感染并不改变细胞内RPS20的蛋白表达(图 5A~C)。
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A.通过Western blot方法测定不同感染剂量PRRSV对PAMs内RPS20蛋白表达的影响；B、C.图A蛋白条带灰度值统计图；D.通过Western blot检测siRNA-129对PRRSV复制的影响; E、F.图D蛋白条带灰度值统计图。*.P < 0.05；**.P < 0.01；***.P < 0.001；****.P < 0.000 1 A. The effect of different infection doses of PRRSV on the expression of RPS20 protein in PAMs was determined by Western blot; B, C. statistical diagram of protein band gray value in Figure A; D. The effect of siRNA-129 on PRRSV replication was detected by Western blot; E, F. statistical diagram of protein band gray value in Figure D. *.P < 0.05; **. P < 0.01; ***. P < 0.001; ****. P < 0.000 1 图 5 RPS20对PRRSV在PAMs中复制的影响 Fig. 5 Effect of RPS20 on PRRSV replication in PAMs |
为了进一步验证RPS20蛋白对PRRSV在PAMs中复制的影响，将siRNA-129转染PAMs，同时转染siRNA-NC为对照组；24 h后感染0.1 MOI PRRSV，24 h后收取蛋白样品。通过Western blot方法及灰度值统计分析测定PRRSV N蛋白和RPS20蛋白表达量。结果显示，干扰RPS20会增强PRRSV在PAMs的复制(图 5D~F)。以上结果说明干扰细胞内RPS20蛋白的表达，可以促进PRRSV在PAMs中的复制。
3 讨论PRRSV在病毒的传播和进化过程中易发生变异，传统的疫苗保护效果不佳，迫切需要新的研究思路来降低该病毒对养殖行业的影响[2, 9]。以宿主蛋白为靶向的抗病毒药物能够避免病毒耐药性的发生，因此针对PRRSV复制的互作宿主蛋白的筛选至关重要。PRRSV核衣壳蛋白N的基本功能是形成病毒衣壳，并封装病毒基因组，其在动物体内具有高度的免疫原性，是病毒感染后产生水平最高且最久的蛋白[10]。它与多种宿主细胞蛋白相互作用，如原纤维蛋白[11]、PARP-1[12]、S100A9[13]、TRIM25[14]和TSG101[15]，通过与以上细胞因子互作能够调节PRRSV感染。继续筛选与N蛋白互作的宿主蛋白，将为PRRSV的感染机制及宿主靶向的PRRSV药物提供新的理论基础。
Y2H是一种蛋白互作的研究方法，在建立宿主细胞或组织酵母cDNA文库的基础上，构建表达目的蛋白诱饵质粒，使其与文库杂交，通过在选择培养基上的不断筛选，筛选出能够与目的蛋白在酵母细胞内互作的宿主蛋白[16]。PRRSV感染后，首先入侵肺泡巨噬细胞，经胞吞作用进入细胞后，激活炎症因子的释放，并在巨噬细胞内迅速增殖繁衍，最终导致其破裂、溶解[17]。感染猪呈现出典型的间质性肺炎，肺是猪最重要的靶器官[18]。因此选择仔猪肺组织构建酵母cDNA文库更容易筛选到与病毒蛋白互作且与病毒致病性相关的宿主蛋白。本研究筛选PRRSV、PCV2、PRV和CSFV核酸和抗体均为阴性的4周龄健康仔猪，无菌采取其肺组织，使用Make Your Own “Mate & PlateTM” Library System cDNA文库构建系统，利用SMART技术和同源重组技术，构建了猪肺酵母cDNA文库，所构建文库插入片段和文库库容量均符合SMART建库要求。
本试验通过Y2H系统筛选出在酵母细胞中与N蛋白相互作用的宿主蛋白——RPS20，并通过免疫共沉淀证明RPS20蛋白与PRRSV感染细胞内的N蛋白存在互作。通过激光共聚焦证实N蛋白与内源RPS20蛋白存在亚细胞共定位。RPS20在PRRSV复制过程中的作用尚未明确，故本试验采用荧光定量PCR、Western blot、TCID50等方法检测干扰或过表达RPS20对ORF7 mRNA、N蛋白和病毒滴度的影响。结果发现过表达RPS20能够降低PRRSV的复制水平，反之，干扰RPS20后病毒的复制水平提高，说明RPS20对PRRSV的复制过程存在一定的影响。
核糖体蛋白(ribosomal protein，RP)是核糖体的重要组成部分，对蛋白质的合成、细胞的分裂、增殖、分化和凋亡具有重要调节作用[19]。核糖体蛋白被病毒“策反”会导致功能异常，因此核糖体蛋白已经成为许多疾病治疗中的潜在宿主靶点[18]。RPS20属于核糖体蛋白S10P家族，是细胞核糖体蛋白的重要组成部分。研究表明RPS20与猪脑心肌炎病毒VP1蛋白存在互作[20]，与草鱼呼肠孤病毒VP7蛋白相互作用[21]；RPS20可以减少早期的细胞凋亡，其在乙型流感病毒的复制过程中起到重要的作用[22]。另有研究者发现在缺乏干扰素应答的细胞系中RPS20参与痘病毒的复制和特异性蛋白的合成[23]。在本研究中，RPS20不仅能够与PRRSV N蛋白相互作用，还影响PRRSV的天然靶细胞内的PRRSV的增殖。可见RPS20在PRRSV复制过程中起着重要作用。另外在激光共聚焦试验中，在转染了pcDNA3.1-N-Flag的细胞中，N蛋白主要定位于细胞质中；RPS20定位在细胞核与细胞质中，N蛋白与内源性RPS20共定位于细胞质中，推测RPS20对PRRSV增殖的影响可能与其蛋白质的合成有关，具体机制还需进一步探究。RPS20能够参与细胞的增殖并与细胞凋亡有关[24]。而在PRRSV体外感染的PAM细胞中，前期PRRSV趋向于抗凋亡，后期趋向于促进凋亡[25]。PRRSV感染仔猪的肺组织和胸腺中也能够检测到细胞凋亡[26]。因此，RPS20是否参与到PRRSV对猪体的凋亡调控，也有待进一步研究。
综上，本研究通过构建猪肺酵母cDNA文库，采用酵母双杂交、免疫共沉淀、激光共聚焦、过表达试验和干扰试验等手段，证实PRRSV N蛋白与宿主蛋白RPS20蛋白相互作用，且RPS20对PRRSV的复制存在明显影响。提示RPS20可作为潜在宿主靶点进行深入研究，为PRRSV抗病毒研究提供新思路和新方向。
4 结论本研究通过酵母双杂交发现了与PRRSV N蛋白互作的宿主蛋白RPS20，并确定RPS20对PRRSV的增殖具有抑制作用。
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(编辑 白永平)