2. 河南农业大学 河南省动物生长发育调控重点实验室, 郑州 450046;
3. 河南农业大学 动物免疫学国际联合研究中心, 郑州 450046
, LIU Taoxue1,2,3, YU Haishen1,2,3, ZHANG Chao1,2,3, LU Weifei1,2,3, WANG Jiang1,2,3, CHU Beibei1,2,3
, ZHANG Gaiping1,2,3
2. Key Laboratory of Animal Growth and Development, The Education Department of Henan Province, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450046, China;
3. International Joint Research Center of National Animal Immunology, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450046, China
非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是一种复杂和高度致命的出血性疾病，能够感染不同品种和年龄的家猪和野猪。已被世界动物卫生组织(OIE)定义为最危险和最持久的动物疾病之一[1]，临床症状主要表现为持续性发热，伴随有呼吸困难、心跳加速、分泌物增加、胃肠道黏膜和淋巴结出血等表现[2]。非洲猪瘟疫情最早于20世纪20年代在肯尼亚暴发，目前在中欧、东欧和亚洲广泛流行，给全球养殖业造成了严重经济损失[3-4]。尽管对非洲猪瘟已进行了广泛的研究，但是仍然缺乏有效的疫苗或抗病毒策略[5]。
非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)是非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属的唯一成员，也是唯一已知的DNA虫媒病毒[6]。ASFV具有20面体形态，由中心核仁、核壳、内层包膜和衣壳及外包膜组成[7-8]，基因组是一个线性双链DNA分子，长度为170~193 kb，有151~167个开放阅读框[9-10]，编码54种结构蛋白和100多种非结构蛋白，参与病毒基因组的复制、DNA修复、转录、病毒组装及免疫逃逸等[11-12]。
p54蛋白是ASFV的重要结构蛋白之一，由E183L基因编码，位于病毒的内囊膜，在病毒感染细胞时，与细胞质动力蛋白轻链结合，参与病毒的运输[13]。p54蛋白是ASFV的主要抗原蛋白之一，被鉴定为潜在的血清学诊断抗原。血清中的p54抗体抑制病毒对猪巨噬细胞的黏附，抑制率约为60%[14-16]。因此，p54蛋白具有较好的抗原性，是理想的免疫抗原，可制备针对ASFV的中和抗体。
本研究对ASFV p54蛋白膜外区域序列(53—184 aa)进行原核密码子优化，利用大肠杆菌表达系统获得可溶性重组p54蛋白，将其作为抗原免疫BALB/c小鼠，制备了6株针对p54蛋白的单克隆抗体，具有良好的特异性，对其抗原表位进行鉴定，并在预测的三级结构中进行标注。
1 材料与方法 1.1 试验材料小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)为本实验室保存、人宫颈癌细胞(HeLa，CRM-CCL-2)、人胚胎肾细胞(HEK 293T/17，CRL-11268)购自美国ATCC。感受态细胞BL21 (DE3) 购自北京全式金公司；ASFV E183L基因由金斯瑞公司优化并合成；引物由上海生工生物工程有限公司合成。pET-30a-His-p54和pCAGGS-Flag-p54为本实验室构建保存。聚偏二氟乙烯膜(PVDF)购自Millipore公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、IPTG、HAT/HT培养基、融合剂PEG1450、小鼠抗Flag单抗、FITC标记的山羊抗鼠IgG均购自Sigma公司；小鼠抗His单抗购自中杉金桥公司；灭活ASF标准阳性血清购自中国兽医药品监察所；DAPI染色试剂购自Servicebio；HRP标记山羊抗鼠、猪IgG购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；蛋白质Marker购自Thermo Fisher公司；Ni-NTA Agarose购自QIAGEN公司；ProteinIsoⓇProtein G Resin购自北京全式金生物技术有限公司；IgG抗体亚型鉴定试剂盒购自Sino Biological公司。
SPF(Specific Pathogen Free, SPF)级BALB/c小鼠购自郑州大学实验动物中心。
1.2 试验方法1.2.1 密码子优化 基于NCBI(MK128995.1) 中China/2018/AnhuiXCGQ-ASFV毒株E183L基因序列，通过在线软件Racc (http://nihserver.mbi.ucla.edu/RACC)进行大肠杆菌稀有密码子分析，根据原核表达密码子偏嗜性进行优化，基因序列由南京金斯瑞公司合成，并克隆至pET-30a载体。
1.2.2 重组蛋白的诱导表达及可溶性分析 将pET-30a-His-p54转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达，在37 ℃，220 r·min-1条件下的恒温摇床上震荡培养至OD600 nm达到0.6左右时，加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol·L-1的IPTG，再分别置于140 r·min-1条件下37 ℃诱导4 h、15 ℃诱导16 h，确定诱导p54重组蛋白表达的最佳条件。将诱导的菌液富集菌体，在低温条件下进行超声破碎，10 000 r·min-1、4 ℃离心，分别收集上清和沉淀。用SDS-PAGE胶进行电泳后再经考马斯亮蓝染色鉴定其可溶性。
1.2.3 重组蛋白的纯化及Western blot鉴定 最佳诱导条件大量诱导表达p54重组蛋白，参照Ni-NTA Agarose操作技术手册进行纯化，通过SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色鉴定蛋白纯度。BCA法测定p54蛋白浓度，定量为1 mg·mL-1后分装保存于-80 ℃备用。纯化后的p54蛋白经Western blot，使用小鼠抗His单克隆抗体(1∶1 000稀释)、ASF标准阳性血清为一抗，HRP标记的山羊抗鼠、猪IgG(1∶5 000稀释)为二抗进行孵育显色，鉴定重组p54蛋白。
1.2.4 免疫小鼠 将p54蛋白按照100 μg·只-1的剂量与弗氏完全佐剂1∶1乳化，背部多点皮下注射6周龄BALB/c雌鼠。2周后，用弗氏不完全佐剂与p54蛋白1∶1乳化，按照100 μg·只-1剂量连续免疫小鼠2次，间隔2周免疫1次。第3次免疫后2~3 d，对免疫小鼠进行尾静脉采血，选取血清抗体效价高的小鼠进行冲击免疫1次。
1.2.5 间接ELISA方法的建立 采用方阵滴定法，将不同浓度(5、2.5、1.25、0.625、0.312、0.156 μg·mL-1)的p54蛋白100 μL·孔-1包被于96孔酶标板，将免疫小鼠血清以不同比例(1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600、1∶51 200)稀释作为一抗加入酶标板，未免疫小鼠血清作为阴性对照，37 ℃孵育1 h；将HRP标记山羊抗鼠IgG(1∶5 000)作为二抗加入酶标孔，37 ℃孵育1 h；单组份TMB显色液显色10 min；终止液终止反应；用酶标仪测定各孔OD450 nm值。确定ELISA检测方法的抗原最佳包被浓度[17]，建立间接ELISA检测方法。
1.2.6 细胞融合及筛选 分离冲击免疫小鼠的脾细胞，与SP2/0细胞10∶1进行融合。用间接ELISA方法筛选分泌抗p54抗体的阳性杂交瘤细胞，对筛选到的阳性杂交瘤细胞通过有限稀释法进行4次亚克隆，获得分泌p54单克隆抗体的细胞株。
1.2.7 单克隆抗体亚型的鉴定 使用Sino Biological小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒对p54单克隆抗体进行亚型鉴定。
1.2.8 腹水的制备及纯化 取12周龄BALB/c雌鼠，腹腔注射0.3 mL弗氏不完全佐剂，1周后，取约5×106个处于对数增殖期的6株单克隆细胞分别注入小鼠腹腔。待小鼠腹部明显膨大，抽取腹水并10 000 r·min-1离心10 min收集上清，采用硫酸铵沉淀法对获得的小鼠腹水进行纯化。
1.2.9 Western blot检测 以pCAGGS-Flag-p54转染HEK 293T/17细胞，24 h后，收取蛋白样品，进行SDS-PAGE电泳，湿转至PVDF膜，5%脱脂奶室温封闭1 h；p54单克隆抗体(1∶1 000稀释)为一抗，4 ℃孵育12 h；HRP标记的山羊抗鼠IgG(1∶5 000稀释)为二抗室温孵育1 h，显色并分析试验结果。
1.2.10 间接免疫荧光(IFA)检测 以pCAGGS-Flag-p54转染HeLa细胞，24 h后弃上清，用预冷的4%多聚甲醛于室温固定细胞20 min，0.1%Triton-X 100通透10 min；使用含10%胎牛血清的PBS于室温封闭1 h；p54单克隆抗体(1∶1 000)为一抗室温孵育1 h；FITC标记的山羊抗鼠IgG(1∶1 000) 为二抗室温避光孵育1 h；DAPI避光染色10 min；PBS、ddH2O分别洗3次后加入封片剂封片，避光晾干；置于共聚焦显微镜下观察。
1.2.11 单克隆抗体效价测定 以每孔1.25 μg·mL-1 p54蛋白包被于96孔酶标板，采用间接ELISA法测定单克隆抗体效价，将6株单克隆抗体分别进行倍比稀释，作为一抗进行孵育[18]。酶标仪测定各孔OD450 nm值，阴性对照OD450 nm < 0.2时试验成立，待检抗体OD450 nm/阴性对照OD450 nm(S/N)≥2.1的最大稀释倍数作为抗体效价。
1.2.12 交叉反应性试验 将p54重组蛋白、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪细小病毒(PPV)、猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)、猪圆环病毒2型(PCV2)1.25 μg·mL-1包被酶标板，以ASFV阴性血清、ASFV阳性血清作为对照，间接ELISA法对p54单克隆抗体进行交叉反应性检测[19]。
1.2.13 抗原表位鉴定 利用NetSurfP Ver.1.1 (http://gps.biocuckoo.cn/online_full.php) 预测p54蛋白的二级结构，将p54蛋白进行逐步截短并克隆至pGEX-4T-3载体中，分别命名为Δ1、Δ2、Δ3、Δ4。以制备的单克隆抗体(1∶1 000)作为一抗，通过Western blot鉴定p54单克隆抗体所识别的抗原表位区域[20-22]。
1.2.14 ASFV p54蛋白三级结构预测 使用I-TASSER (https://zhanggroup.org/I-TASSER/) 在线预测ASFV p54蛋白三级结构[23]，在PyMOL软件中标注出p54单克隆抗体所识别抗原表位区域。
2 结果 2.1 原核密码子优化对优化后合成的E183L基因序列进行测序，与原始序列比对发现碱基序列发生改变(以红色字体表示)，但氨基酸未改变(图 1)。
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A. “Optimized”为E183L密码子优化后序列，“Original”为E183L原始序列，优化的碱基标为红色；B. “Optimized”为密码子优化后p54蛋白的氨基酸序列，“Original”为原始p54蛋白氨基酸序列 A. 'Optimized' refers to the optimized E183L gene sequence, 'Original' refers to the original E183L gene sequence, and the optimized bases are marked in red color; B. 'Optimized' refers to the p54 protein amino acid sequence encoded by optimized codon, and 'Original' refers to the p54 protein amino acid sequence encoded by original codon 图 1 E183L基因优化后序列比对 Fig. 1 Sequence alignment after E183L gene optimization |
采用不同浓度IPTG和温度诱导p54蛋白表达，经SDS-PAGE电泳分析，结果显示19.9 ku的目的蛋白，IPTG浓度为0.6~0.8 mmol·L-1，温度为37 ℃，4 h诱导效果最佳；p54蛋白大部分以可溶性的形式存在于上清液中(图 2)。
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A. 37 ℃诱导4 h重组蛋白表达情况；B. 15 ℃诱导16 h重组蛋白表达情况；C. 重组蛋白的可溶性分析；M. PageRuler预染蛋白相对分子质量标准 A. Expression of recombinant protein induced at 37 ℃ for 4 h; B. Expression of recombinant protein induced at 15 ℃ for 16 h; C. Solubility analysis of recombinant protein; M. PageRuler prestaining protein marker 图 2 重组蛋白的诱导表达及可溶性分析 Fig. 2 Induced expression and solubility analysis of recombinant protein |
使用Ni-NTA Agarose纯化重组p54蛋白，以不同浓度的咪唑进行洗脱，收集每步骤洗脱液进行SDS-PAGE电泳分析，得到高纯度的p54蛋白，浓度为1 mg·mL-1，并进行Western blot鉴定。结果显示p54重组蛋白的最佳咪唑洗脱缓冲液浓度为100 mmol·L-1；纯化的His-p54重组蛋白能与His单克隆抗体、ASF标准阳性血清特异性结合，蛋白大小为19.9 ku(图 3)。
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A.重组蛋白His-p54纯化结果；B. His单克隆抗体；C. ASF标准阳性血清；M. PageRuler预染蛋白相对分子质量标准 A. The purification results of recombinant His-p54 protein; B. His monoclonal antibody; C. ASF standard positive serum; M. PageRuler prestaining protein marker 图 3 蛋白纯化及鉴定结果 Fig. 3 Protein purification and identification results |
以阳性血清OD450 nm接近于1、阴性血清OD450 nm < 0.2、阳性血清OD450 nm/阴性血清OD450 nm(P/N)最大值组合的p54包被含量为最佳。结果显示当抗原浓度为1.25 μg·mL-1，血清稀释度为1∶1 600时，血清OD450 nm为1.020，阴性对照OD450 nm为0.091，抗体OD450 nm/阴性对照OD450 nm(P/N)为11.147，该组合为最佳，即抗原最佳包被浓度为1.250 μg·mL-1(表 1)。
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表 1 ASFV p54蛋白最佳包被浓度 Table 1 The optimal coating concentration of ASFV p54 protein |
p54单克隆抗体28G12-1、31G7-1、31G7-2重链均为IgG2a型，35F10-1、35F10-2、38D3-1重链均为IgG1型；轻链均为κ链。
2.6 Western blot检测经Western blot检测结果显示pCAGGS-Flag-p54成功表达，获得的6株p54单克隆抗体均能与p54蛋白发生特异性反应，蛋白大小约为25 ku(图 4)。
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Vector. pCAGGS-Flag真核表达空载蛋白；Flag-p54. pCAGGS-Flag-p54真核表达p54蛋白 Vector. pCAGGS-Flag eukaryotic expression of empty carrier protein; Flag-p54. pCAGGS-Flag-p54 eukaryotic expression of p54 protein 图 4 Western blot鉴定p54单克隆抗体的特异性 Fig. 4 Western blot analysis of the specificity of monoclonal antibodies of p54 protein |
经IFA检测，共聚焦显微镜结果显示pCAGGS-Flag-p54成功表达，6株单克隆抗体均能与p54蛋白发生特异性反应，在显微镜下可见绿色荧光，定位于细胞质中(图 5)。
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图 5 IFA鉴定p54单克隆抗体的特异性 Fig. 5 IFA analysis of the specificity of monoclonal antibodies against p54 |
经间接ELISA检测p54单克隆抗体效价，结果显示28G12-1、31G7-1、31G7-2单克隆抗体进行1∶409 600稀释时仍为阳性，35F10-1、35F10-2、38D3-1单克隆抗体的效价分别达到1∶102 400、1∶51 200、1∶25 600(图 6)。
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图 6 ASFV p54单克隆抗体效价 Fig. 6 Titer of monoclonal antibodies against ASFV p54 |
通过对阴性对照组OD450 nm值进行计算，得出平均值x为0.103，标准差s为0.004 34，临界值x+3 s为0.116，即小于x+3s判定为阴性，大于x+3s判定为阳性。经间接ELISA方法检测，结果显示制备的6株p54单克隆抗体与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪细小病毒(PPV)、猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)、猪圆环病毒2型(PCV2)不发生交叉反应(图 7)，特异性良好。
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图 7 ASFV p54单克隆抗体交叉反应性试验 Fig. 7 Cross reaction assay of monoclonal antibodies against ASFV p54 |
ASFV p54蛋白二级结构由无规卷曲、α螺旋、β折叠构成(图 8)；对p54肽段进行截短，保证每段α螺旋、β折叠的完整，进一步Western blot分析，结果显示肽段53—184 aa、53—126 aa、108—184 aa、127—163 aa、147—184 aa表达成功，6株单克隆抗体可识别p54蛋白C端肽段Δ3(127—163aa)，不识别Δ4(147—184 aa)，故抗原表位区域为127—146 aa，氨基酸序列为“VMATGGPAAAPAAASAPAHP”(图 9)。
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图 8 ASFV p54蛋白二级结构预测 Fig. 8 Secondary structure prediction of ASFV p54 protein |
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A. ASFV p54蛋白截短示意图；B. p54蛋白抗原表位鉴定 A. Truncation schematic diagram of ASFV p54 protein; B. Identification of p54 protein epitopes 图 9 ASFV p54蛋白抗原表位鉴定 Fig. 9 Epitopes identification of ASFV p54 protein |
在p54蛋白三级结构可视化的基础上，标注出p54单克隆抗体识别抗原表位区域127—146 aa(图 10，以红色区域表示)。
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图 10 ASFV p54蛋白的三级结构 Fig. 10 Tertiary structure of ASFV p54 protein |
ASFV是一种使家猪和野猪高度致命的病毒，自2007年传入高加索地区以来，继续在东欧和俄罗斯传播，目前蔓延至西欧、中国和东南亚等多个国家和地区，对全球养猪业构成了严重的威胁[23-24]。针对非洲猪瘟的各种疫苗策略已经进行了研究，早期侧重于以抗原为基础的方法，旨在诱导中和血清学反应，以CD2v为抗原不能引起机体足够的免疫保护，此后，许多亚单位疫苗的方法都集中在p54和p30，数据结果显示p54和p30同时免疫机体可延缓ASF临床症状，因此深入对ASFV蛋白质组和单个蛋白质功能的研究，对合理设计靶向疫苗方法具有重要意义[25-27]。
早期准确诊断ASFV具有重要的价值，目前检测的方法大部分是以p72、p30等作为检测对象，经研究发现p54蛋白也可以作为诊断抗原用于ASFV感染中期或者后期的血清学诊断。因此本研究通过原核表达系统，建立了获得可溶性p54蛋白的体系，且蛋白纯度高，经ASFV标准阳性血清鉴定，具有良好的反应原性，可用于间接ELISA来检测ASFV的感染，对p54蛋白结晶的解析也具有潜在的研究价值[28]。进一步利用p54蛋白免疫小鼠，制备了高特异性的p54单克隆抗体，可用应用于阻断ELISA方法的建立，为血清学检测方法的进一步发展提供了材料[29-33]。
p54是位于病毒粒子内膜的Ⅱ型跨膜蛋白，其C端具有多个糖基化和磷酸化位点，有动力蛋白结合域(DBD)，以往对p54抗原区域的研究仅限于DBD中149—161 aa之间的一个线性表位[34]。现已有研究证明p54蛋白的抗原表位区域还有：23—29 aa、36—45 aa、65—75 aa、72—94 aa、93—113 aa、114—120 aa、118—127 aa、137—150 aa、175—185 aa[35-36]。表位是决定病毒结构蛋白抗原性和诱导体液免疫反应的关键因素，表位的研究有助于提高检测试剂的检测效率及亚单位疫苗的研发，本研究鉴定出一个新的p54蛋白抗原表位区域127—146 aa，有望为改进ASFV检测、监测和疾病控制提供有价值的新靶点，在ASFV疫情监测和控制中具有潜在的应用价值[37-39]，也为针对p54的表位疫苗的研制提供了基础。目前已有研究报道ASFV病毒颗粒[8]和p72蛋白的结构解析[40]，但是没有关于p54蛋白结构解析的报道，故本研究通过I-TASSER软件在线预测ASFV p54蛋白三级结构，并标注出p54单克隆抗体识别的抗原表位区域，为ASFV p54蛋白结构的可视化提供了帮助。
4 结论本研究成功获得p54重组蛋白和6株具有不同亚型的p54单克隆抗体，鉴定出p54抗原表位区域为127—146 aa，为后续p54蛋白在ASFV发病机制中功能的研究奠定了基础，也为ASFV p54多肽疫苗的研发提供了帮助。
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(编辑 白永平)