2. 广东科贸职业学院动物科技学院, 广州 510430;
3. 华南农业大学兽医学院, 广州 510642;
4. 佛科院附属动物医院, 佛山 528225
, LI Guizhen2, YUAN Yaoxian1,4, LI Kangjian1,4, MA Chunquan1,4, LI Shoujun3, HUANG Liangzong1,4
, MA Jun1,4
2. Guangdong Polytechnic of Science and Trade, College of Animal Science and Technology, Guangzhou 510430, China;
3. College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China;
4. Foshan University Veterinary Teaching Hospital, Foshan 528225, China
甲型流感病毒(influenza A virus, IAV)是指属于正黏病毒科A型流感病毒属的病毒。该类病毒的基因组是由8个负链的RNA节段组成，根据其表达的蛋白功能，8个基因节段分别被命名为PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS1[1]。IAV可在包括人在内的多个物种间进行跨宿主传播，这既对公共卫生安全造成了威胁，也增加了对该疫病防控的难度[2]。犬流感病毒(canine influenza virus, CIV)是一种适应犬类宿主的IAV，是引起犬流感(canine influenza, CI)的主要病原[3]，其感染可引起犬的咳嗽、流鼻涕、打喷嚏、发热等临床症状。CIV感染对犬的危害不大，少有死亡的案例，但感染后易继发其他病原微生物感染，使患病犬的病情加重，严重时可致死亡[4-5]。
目前在犬群中流行的CIV主要有H3N8和H3N2两种亚型，H3N8 CIV主要在美洲犬群中流行，而H3N2 CIV主要在亚洲的犬群中流行[6]。2004年，研究者自美国佛罗里达州一只患有CI的赛犬身上成功分离出了一株CIV，经验证，该病毒与H3N8马流感病毒的基因组高度相似，这是H3N8 CIV在世界范围内的首次报道[7]。随后经调查发现，H3N8 CIV已在美国多个州的犬群中广泛流行[8-9]。2007年，韩国研究者首次报道了H3N2 IAV感染犬的案例，经系统发育树分析发现，该病毒的基因组与H3N2禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)的相似度最高，说明H3N2 CIV可能是由H3N2 AIV感染犬而形成的[10-13]。2010年，李守军等[14]在中国地区分离并报道了H3N2 CIV，说明H3N2 CIV已在东亚地区广泛传播。
PA-X蛋白是近期发现的具有独特合成机制的一种新型IAV蛋白。研究表明，有多种IAV的PA片段在翻译蛋白质的时候，由于其mRNA连续使用了稀有密码子UCC UUU CGU C(丝氨酸、苯丙氨酸和精氨酸)，导致核糖体在该位置的翻译出现延迟，从而有概率跳过一个核糖核苷酸U，使核糖体将该序列翻译为UCC UUC GUC(丝氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸)，并继续合成多肽链，从而形成PA-X蛋白[15-16]。因此，这些IAV的PA序列在宿主细胞中既可以正常表达PA蛋白，也可以错位表达具有232或252个氨基酸(amino acid, aa)的PA-X蛋白[16-18]。经研究发现，PA-X蛋白具有核苷酸切割活性和抑制宿主细胞的蛋白质合成的功能[19-21]。并且在IAV由禽类动物向哺乳类动物传播的过程中，PA-X基因很多都发生了长度的改变，其编码的多肽发生了大小由252 aa向232 aa的转变[19]。因此，PA-X基因可能在IAV跨宿主感染的过程中发挥了重要作用。
犬作为人的伴侣动物，其既能感染哺乳动物流感，也能感染禽流感，这增加了犬将动物流感重组并传播给人的风险[8]。但在CIV的研究中，少有涉及PA-X基因的研究。因此，本研究利用CIV的反向遗传操作平台分别拯救了3株表达不同长度PA-X基因的H3N2 CIV重组病毒，并通过比较3株重组病毒的聚合酶活性、复制效率及对小鼠的致病性，初步探索了PA-X基因的长度变化对H3N2 CIV的影响，为H3N2 CIV与宿主的相互作用及致病机制的研究提供了初步的研究基础。
1 材料与方法 1.1 病毒、细胞、质粒和菌株H3N2 A/canine/Guangdong/02/2011(H3N2 CIV) (GenBank No.: JX195340-JX195347)；犬肾上皮细胞(MDCK)、人胚胎肾细胞293T(293T)、H3N2 CIV 8质粒操作系统(pCIV-PB2、pCIV-PB1、pCIV-PA(本研究中也称pCIV-PA-X-232)、pCIV-HA、pCIV-NP、pCIV-NA、pCIV-M、pCIV-NS)为华南农业大学兽医学院外产科教研室馈赠。
1.2 实验动物和主要试剂9日龄SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术公司；SPF级4~6周龄雌性BALB/c小鼠，购自广东省医学实验动物中心。TRIzol和转染试剂LipofectamineTM 3000 Transfection购自Invitrogen公司。双荧光素酶检测试剂盒购自Promega公司。
1.3 引物的设计合成和质粒的测序根据参考文献[22]中IAV的8个节段的扩增引物对，以PA序列的扩增引物对为基础，利用Primer Premier 6.0软件设计2对突变引物(下划线表示突变位置)。PA-X_Knock-F：TATGGGATTCCTTCAGACAGTCCGAAAGA；PA-X_Knock-R：TCTAAGGAATCCCATAGCCCCCTGCTG；PA-X_252 W-F：TTAGAGCCTATGTGGATGGATTTGAAC；PA-X_252 W-R：CCACATAGGCTCTAAAATTTTCAAGGC。8质粒操作系统在使用前进行测序验证，测序及引物合成由上海生工生物技术服务有限公司完成。测序正确的质粒保存备用。
1.4 重组病毒CIV_PA-X_252及CIV_PA-X_Knock的拯救以操作质粒pCIV-PA为模板，利用PA-X_252 W-F/R引物对，将PA片段+1编码区的第232位氨基酸由终止密码子突变为色氨酸(W)，从而使H3N2 CIV的PA-X基因表达大小为252 aa的PA-X蛋白。将突变后的PA质粒进行测序并与原序列对比，确认获得目的突变质粒，命名为pCIV-PA-X-252。根据参照文献[23]的反向遗传操作技术，将质粒pCIV-PA-X-252与其他7个操作质粒共转染至293T细胞，随后置于37 ℃，5% CO2环境中培养48 h。收取细胞培养液，并将其接种至9日龄SPF鸡胚，37 ℃培养48 h。随后，收取尿囊液，用1%鸡红细胞进行血凝试验(hemagglutination test, HA)验证。提取有血凝效果的尿囊液RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板扩增出病毒的全基因组。测序并与原序列进行比对，确认结果无误后，将重组病毒命名为CIV_PA-X_252。
以操作质粒pCIV-PA为模板，利用PA-X_Knock-F/R引物对进行操作，在不改变编码氨基酸的前提下，将PA片段编码区的第191、192位氨基酸的稀有密码子替换为常用密码子，使H3N2 CIV的PA片段不再因存在稀有密码子而表达PA-X蛋白。将突变后的PA质粒测序并与原序列比对，确保获得目的突变质粒，并命名为pCIV-PA-X_Knock。使用质粒pCIV-PA-X_Knock和其他7个操作质粒，以相同的操作拯救出重组病毒，而后扩增其全基因组，进行测序鉴定，确定结果无误后将该重组病毒命名为CIV_PA-X_Knock。
使用pCIV-PA-X-232和其他7个操作质粒，以相同的操作拯救出重组病毒，而后扩增其全基因组，进行测序鉴定，确定结果无误后将该重组病毒命名为CIV_PA-X_232。
1.5 重组病毒聚合酶活性的测定分别将质粒pCIV-PA-X-232、pCIV-PA-X-252、pCIV-PA-X_Knock与操作质粒pCIV-PB2、pCIV-PB1，荧光素酶报告质粒pPolI-Luci-NP(各250 ng)以及作为内参的海肾荧光素酶表达质粒(25 ng)共转染至12孔板中的293T细胞中，每组3个重复，转染步骤按说明书进行。孵育48 h后按照双荧光素酶检测试剂盒说明书进行检测，按照公式(RLU1/RLU2) 来计算双荧光素酶的比值，其中RLU1为荧光素酶反应强度，RLU2为海肾荧光素酶荧光强度。
1.6 重组病毒在MDCK细胞中生长曲线的测定以MOI=0.1的感染剂量将3株重组病毒分别接种到12孔板的MDCK细胞中，每组3个重复，置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养。分别在感染后的第12、24、36、48小时收集细胞上清液。将收集的上清使用DMEM进行十倍倍比稀释，以10-12~10-1稀释度分别接种到96孔板上的MDCK细胞中，每孔接种100 μL。孵育48 h后通过HA进行验证，根据Reed-Muench算法测定病毒的TCID50，并绘制重组病毒的生长曲线。
1.7 小鼠致病性试验按照“1.6”中方法测定重组病毒TCID50。将BALB/c小鼠随机分成4组，每组15只。使用无菌DMEM将3株重组病毒分别稀释至106TCID50·50 μL-1。使用CO2麻醉小鼠后，通过鼻腔接种50 μL病毒液，Control组接种同等量的无菌DMEM。每天定时称量小鼠体重，并观察各组小鼠的临床症状。
在攻毒后第1、3、5天，每组随机选择3只小鼠进行安乐死，并通过剖检获取小鼠的心、肝、脾、肺、肾等脏器，将其置于无RNA酶的离心管内；将获得的组织样品称重，按照1 mL·g-1的剂量在无菌条件下加入含1%双抗的DMEM进行研磨，而后放入-80 ℃进行反复冻融，随后4 ℃，12 000 r·min-1离心15 min，收集上清液并使用0.22 μm滤膜进行过滤，使用不含血清的DMEM对过滤后的上清液进行十倍倍比稀释，以10-8~10-1稀释度分别接种到96孔板上的MDCK细胞中，每孔接种100 μL，孵育48 h后收集上清液并进行HA验证，根据Reed-Muench算法测定各组织器官中感染病毒的TCID50。
在攻毒后的第5天，每组随机选择3只小鼠，安乐死后进行解剖，采集其肺并观察其剖检病变，随后用4%多聚甲醛对采集的肺固定24 h。处理好的样品送由武汉塞维尔生物科技有限公司进行组织病理切片的制作。每组余下的3只小鼠称量体重至第12天。在试验过程中，若小鼠体重下降超过自身原本体重的20%，则判定为死亡。
1.8 数据分析所有统计分析均使用GraphPad Prism 8.0进行。病毒聚合酶活性的测定采用Student’s t-test方法进行比较；生长曲线的测定采用Two-way ANOVA方法进行两两比对。当P < 0.05时，则认为具有统计学意义上的差异。
2 结果 2.1 重组病毒的拯救及鉴定使用“1.1”中的8质粒操作系统，以“1.4”中的操作流程拯救重组亲本病毒CIV_PA-X_232。使用质粒pCIV-PA-X-252和其余7个操作质粒以相同流程拯救重组病毒CIV_PA-X_252。使用质粒pCIV-PA-X_Knock和其余7个操作质粒以相同流程拯救重组病毒CIV_PA-X_Knock。扩增3株重组病毒的全基因组序列进行测序，并与H3N2 CIV的基因组进行比对。结果显示，CIV_PA-X_232与H3N2 CIV基因组相一致；CIV_PA-X_252的PA序列显示，第807位碱基由A突变为G，PA编码区+1阅读框的第232位氨基酸由终止密码子突变为W，其它序列与H3N2 CIV的一致；CIV_PA-X_Knock的PA序列显示，第680、681、683位碱基分别由T、C、T突变为C、A、A；其他序列与CIV_PA-X_232的一致(图 1)。结果表明，重组病毒CIV_PA-X_232，CIV_PA-X_252和CIV_PA-X_Knock拯救成功。
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虚线部分表示PA蛋白的翻译过程不受影响，不形成PA-X蛋白；下划线处表示突变位点 The dot line means the PA protein is normally expressed, thus not express the PA-X protein. The mutation sites were marked with underline 图 1 重组病毒中PA-X蛋白长度的示意图 Fig. 1 The PA-X protein length in different recombinant virus |
为探究不同长度的PA-X基因对H3N2 CIV聚合酶活性的影响，以双荧光素酶法测定3株重组病毒的聚合酶活性。结果显示，CIV_PA-X_252和CIV_PA-X_Knock的聚合酶活性均显著(P < 0.05)高于CIV_PA-X_232，其中，CIV_PA-X_252约为CIV_PA-X_232的4倍，约为CIV_PA-X_Knock的2倍(图 2)。结果表明，PA-X基因的长度变化能影响H3N2 CIV的聚合酶活性，且表达大小为252 aa多肽的PA-X基因能显著增强H3N2 CIV的聚合酶活性。
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*.P < 0.05；ns.差异不显著 *.P < 0.05; ns.Not significant 图 2 重组病毒的聚合酶活性 Fig. 2 Polymerase activity of recombinant viruses |
3株重组病毒均以MOI=0.1的感染量接种MDCK细胞。感染后每隔12 h收集12孔板中的细胞上清液，并测定病毒的TCID50。结果显示，三个重组病毒在接种后12~36 h的病毒滴度均呈逐渐上升趋势，但CIV_PA-X_252和CIV_PA-X_Knock病毒滴度均高于CIV_PA-X_232；而在36~48 h的病毒滴度则呈下降趋势，其中CIV_PA-X_252和CIV_PA-X_Knock在48 h的病毒滴度均显著(P < 0.05)高于CIV_PA-X_232(图 3)。结果表明，PA-X基因表达大小为252 aa的PA-X蛋白或不表达PA-X蛋白时能增强H3N2 CIV在MDCK细胞中的复制能力。
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突变病毒与亲本病毒之间的显著性差异(P < 0.05)用a、b、c进行标注，a表示CIV_PA-X_232与CIV_PA-X_252；b表示CIV_PA-X_252与CIV_PA-X_Knock；c表示CIV_PA-X_232与CIV_PA-X_Knock Significant differences (P < 0.05) between infected groups are marked by a, b, c (a. CIV_PA-X_232 and CIV_PA-X_252; b. CIV_PA-X_252 and CIV_PA-X_Knock; c. CIV_PA-X_232 and CIV_PA-X_Knock) 图 3 重组病毒在MDCK细胞中的生长曲线 Fig. 3 The growth curve of recombinant viruses on MDCK cells |
2.4.1 小鼠攻毒后体重变化的测定 使用无菌的DMEM将CIV_PA-X_252，CIV_PA-X_232和CIV_PA-X_Knock分别稀释至106TCID50·50 μL-1，并通过鼻腔攻毒小鼠。随后，每天定时称量各组小鼠的体重并观察小鼠临床症状。在12 d试验期内，各组别小鼠均无死亡，存活率为100%。攻毒后的小鼠表现出被毛粗乱，精神不振，食欲减退等现象，Control组各小鼠均表现正常。体重变化曲线图显示，3株重组病毒小鼠体重在攻毒后5 d内总体呈下降趋势，随后体重逐渐增加；CIV_PA-X_252组的体重下降速率稍大于CIV_PA-X_Knock组和CIV_PA-X_232组(图 4)。结果表明，不同长度的PA-X基因对H3N2 CIV影响小鼠体重的变化较弱，且3株重组病毒对小鼠均不具有致死性。
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图 4 攻毒后的小鼠体重变化曲线 Fig. 4 Body weight change of mice infected with recombinant viruses |
2.4.2 小鼠感染重组病毒后各脏器病毒滴度的测定 通过对小鼠感染后不同脏器在感染不同时间的病毒滴度进行测定，结果表明，3株重组病毒感染小鼠后，仅有肺在1 dpi能检测出病毒滴度(表 1)；与CIV_PA-X_232感染小鼠后肺病毒滴度相比，重组病毒CIV_PA-X_252和CIV_PA-X_Knock感染小鼠后肺的病毒滴度均略有升高，但3组数据之间无显著性差异(P>0.05)。说明在本研究中，PA-X基因的长度改变对H3N2 CIV在小鼠肺中复制能力的影响不存在显著差异。
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表 1 攻毒后的小鼠肺的病毒滴度 Table 1 Virus titers of recombinant viruses in infected mouse lung |
2.4.3 重组病毒对小鼠肺造成的组织病理学变化 为比较3株重组病毒对小鼠肺所造成的病理损伤，在小鼠攻毒后的第5天，每组随机选择3只小鼠进行安乐死，采集其肺并制作病理切片。结果显示，Control组无明显的病理变化(图 5A )；CIV_PA-X_252组能观察到气管、血管周边的炎性细胞增多，肺泡壁增厚且能观察到大量的红细胞，同时还有肺泡融合现象的出现(图 5B )；CIV_PA-X_ 232组观察到肺泡间质增宽，炎性细胞增加且发现有肺泡融合现象(图 5C)；CIV_PA-X_Knock组观察到有肺泡融合现象，并伴有少量的充血、出血的现象(图 5D)。结果表明，3株重组病毒均能对小鼠肺造成病理损伤，其中CIV_PA-X_252对小鼠肺的病理损伤强于CIV_PA-X_232，而CIV_PA-X_Knock弱于CIV_PA-X_232的致病性，表明PA-X基因的长度变化能够影响H3N2 CIV对小鼠的致病能力。
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病理变化用黑色箭头标记 Pathological changes were marked by black arrows 图 5 攻毒后小鼠肺的病理组织变化 Fig. 5 Histopathological changes of mice lungs infected with recombinant viruses |
IAV能够通过突变或重组的方式改变自身的毒力，而PA-X蛋白是其毒力因子之一[24]。PA-X蛋白具有一定的宿主特异性，Shi等[21]通过对不同来源的IAV的PA-X氨基酸序列进行系统发育树分析，发现在10 164个PA-X氨基酸序列中有2 279条序列大小为232 aa，这些序列主要来源于人流感病毒pdm09、H1N1猪流感病毒、H3N2 CIV及H3N8 CIV等哺乳动物流感病毒，而大多禽源流感病毒的PA-X蛋白大小都为252 aa。这说明PA-X蛋白的缩小主要发生于AIV在猪群和犬群中进行传播和适应的过程中，意味着PA-X基因的长度变化可能与IAV适应新宿主的过程相关，并且可能在病毒的跨宿主传播的过程中发挥了重要作用[19]。
为明确PA-X基因的长度改变对IAV的影响，多位研究者通过反向遗传技术对不同毒株的PA-X基因进行了延长或截短。Gao等[25]研究发现，表达大小为252 aa PA-X蛋白的IAV毒株在A549细胞中的复制效率高于不表达PA-X蛋白的IAV毒株；在另一个研究中，Gao等[26]发现不表达PA-X蛋白的pdm09毒株和H3N2 AIV毒株对小鼠和家禽有更强的致病力。李鲁兆等[27]研究发现，在抑制H9N2亚型禽流感病毒的PA-X基因表达后，其病毒聚合酶活性显著提高。Wang等[28]通过对A/Swine/Guangdong/1/2011(H1N1)毒株的PA-X基因进行研究，发现表达252 aa PA-X蛋白的重组毒株，在多种细胞上的复制能力、聚合酶活性和致病性均显著高于表达232 aa PA-X蛋白的重组毒株。以上研究说明了PA-X基因能影响IAV的致病力及复制能力，那么PA-X基因是如何产生这些作用的？Khaperskyy的研究表明，PA-X蛋白可以选择性切割由宿主RNA聚合酶Ⅱ转录的未成熟mRNA，从而降低宿主细胞表达蛋白质的效率，进而抑制宿主细胞的天然免疫反应，而IAV本身基因组的合成则受PA-X蛋白的影响较小，这一作用也称为宿主细胞关闭作用(host shut off)[29]。然而，不同宿主，不同毒株，不同大小的PA-X蛋白所产生的“host shut off”的效果并不一致，其原因还有待进一步的研究。
H3N8 CIV和H3N2 CIV都是近期IAV成功实现跨宿主传播的例子，但目前尚缺乏研究。Liu等[30]研究发现，在PA-X基因表达长为232 aa PA-X蛋白时，H3N8 CIV(A/canine/Colorado/6723-8/2008)和H3N2 CIV(A/canine/Beijing/362/2009)在MDCK细胞上的复制能力和对犬的致病能力均高于表达252 aa PA-X蛋白，而聚合酶活性变化却不明显。为进一步探究PA-X基因长度对H3N2 CIV的影响，本研究利用CIV的8质粒操作系统，通过反向遗传技术拯救了3株表达不同长度PA-X蛋白的CIV重组病毒，并开展相关研究进行探索。结果显示，PA-X基因的延长和不表达均能显著(P < 0.05)提高H3N2 CIV病毒在MDCK细胞上的复制能力和聚合酶活性。而在致病性试验中，PA-X基因的延长略微增强了H3N2 CIV对小鼠的致病性，而PA-X基因的表达缺失则略微削弱了H3N2 CIV对小鼠的致病性。本研究的结果与Liu等[30]的结果并不一致，这可能是由PA-X基因的毒株特异性造成的。后续可进一步对这几株CIV的PA-X基因序列进行比较研究，探索影响PA-X基因毒株特异性的因素。
犬的呼吸道内皮细胞内同时具有α-2, 3-Gal和α-2, 6-Gal受体，这表明犬具有成为流感病毒“混合器”的潜力[31-32]。因此，对犬流感病毒进行监控与研究有助于流感的防控与治疗。随着H3N2 CIV在犬群中的快速传播，PA-X基因发生突变的概率也会升高，若PA-X基因表达缺失，可能会增加H3N2 CIV对新宿主的适应性，若PA-X基因的长度延长，则可能增加H3N2 CIV的致病性。本研究的结果为探索PA-X蛋白对IAV的作用提供了参考，也为H3N2 CIV致病机制的研究提供初步的研究基础。
4 结论PA-X基因的延长能够提高H3N2 CIV在MDCK细胞中复制能力和对小鼠肺造成病理损伤的能力，但该变化可能对H3N2 CIV在小鼠肺内的复制能力没有影响。
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(编辑 白永平)