2. 江苏省农业科学院畜牧研究所, 南京 210014
2. Institute of Animal Science, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China
毛囊的形态发生和生长发育受到多种信号通路的共调控，并在多种细胞的调控下，经历生长期(anagen)、退行期(catagen)和休止期(telogen)[1]。在此过程中，角蛋白(keratin，KRT)在毛囊生长发育中扮演重要角色。角蛋白属于中间丝蛋白，是上皮细胞重要组成部分，对上皮细胞具有重要保护作用[2]。除了保护作用，角蛋白家族还参与调节细胞内多种信号传导途径及生物反应，如细胞生长、迁移、凋亡、增殖等[3]。其中，KRT17能够调节TNFα信号，从而影响毛囊生长周期[4]；而KRT81、KRT83、KRT85、KRT86和KRT2-25的缺失导致SD大鼠出现无毛表型，这体现了角蛋白基因对毛发生长的重要性[5]。此外，KRT1和KRT4基因突变会引起皮毛颜色变化，表明角蛋白还能调节皮肤色素沉着[6-8]。
角蛋白16(keratin 16，KRT16)属于一大类酸性Ⅰ型角蛋白，已有研究表明，KRT16是皮肤的重要保护屏障，与一些皮肤疾病有着紧密联系[9]。如银屑病、先天性厚甲症和掌跖脚皮症。在银屑病的研究中，过表达KRT16后，角质形成细胞过度增殖，从而导致银屑病的发生[10]。另外，KRT16表达的沉默能够抑制VEGF分泌，而VEGF通过影响血液生成进而影响毛囊循环和生长[11]。本研究克隆得到兔KRT16基因的编码序列，对KRT16编码序列(CDS)的生物学特性初步进行生物信息学分析。在毛乳头细胞(dermal papilla cell，DPC)中过表达和敲低KRT16，探究KRT16对毛囊生长发育相关基因的调控作用，以及对DPC细胞增殖的影响。该研究有助于我们进一步了解KRT16在兔毛囊生长发育中的作用。
1 材料与方法 1.1 材料1.1.1 试验动物 皖系长毛兔由安徽省农业科学院提供，共12只。饲养在相同环境下，给予充足的水和饲料。耳缘静脉注射Zoteil-50麻醉，采集毛囊不同时期的长毛兔背部皮肤，每组一式三份，对伤口进行碘伏消毒[12]。
1.1.2 试验试剂 Zoteil-50购自法国维克宠物保健公司；HiScript Ⅱ Q Select RT SuperMix for qPCR、ChamQTM SYBRⓇ qPCR、ClonExpressⓇ Ⅱ One Step Cloning Kit、HiScript Ⅲ 1 st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper)和CCK-8 Cell Counting Kit购自南京诺维赞；Trizol试剂和无内毒素质粒大量提取试剂盒购于天根；限制性内切酶Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ、TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit胶回收试剂盒、DH5α感受态细胞购自TaKaRa; PBS购于HyClone；MSCM培养基购于Sciencell；LipofecctamineTM3000购自赛默飞。
1.2 长毛兔皮肤组织总RNA的提取与反转录Trizol法提取兔皮肤组织总RNA，并用NanoDrop 2000检测RNA浓度和纯度，再经1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。通过HiScript Ⅲ 1 st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper)合成第一链cDNA。
1.3 引物设计根据GenBank数据库提供的KRT16基因的CDS序列(XM_002719157.3)，使用Primer 5.0设计扩增引物，同时设计实时荧光定量PCR(qRT-PCR)引物，并送至擎科生物公司进行合成(表 1)。
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表 1 引物信息 Table 1 Primers information |
提取兔背部皮肤总RNA，进行长链第一链cDNA合成，根据NCBI数据库中编码序列(XM_002719157.3)设计KRT16 CDS引物，构建pcDNA3.1(+)过表达载体，引物序列如表 1所示。pcDNA3.1载体经Hind Ⅲ和EcoR I双酶切后，切胶回收，利用ClonExpressⓇ Ⅱ One Step Cloning Kit进行一步克隆试验，将连接产物转化至感受态细胞，培养过夜后挑选阳性克隆进行鉴定。小干扰RNA(small interference RNA, siRNA)和siRNA-NC购自上海吉玛制药有限公司，siRNA序列见表 2。
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表 2 siRNA序列信息 Table 2 Sequences of the siRNAs |
DPC在MSCM培养基中生长，并在37 ℃含有5% CO2细胞培养箱中培养。转染前，将DPC接种于24孔板中，待细胞的汇合度达80%时，使用LipofecctamineTM3000转染试剂转染，具体操作根据试剂盒说明书进行。
1.6 细胞增殖试验细胞计数后，将定量的细胞接种于96孔板中，每孔总体积100 μL，培养24 h后，在每个测定时间向每孔中加入10 μL CCK8 Solution，避光孵育3 h，酶标仪检测450 nm处吸光值。
1.7 生物信息学分析通过MegAlign软件(https://en.freedownloadmanager.org/Mac-OS/MegAlign.html)进行多序列比对[13]；使用ExPASy在线软件(http://au.expasy.org/)预测KRT16的理化性质[14]；使用SPOMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/)和SWISS-MODEL软件(http://www.swissmodel.expasy.org)预测蛋白质二级和三级结构[15]。使用UniProt在线软件(https://www.uniprot.org/)预测KRT16的亚细胞定位，并通过ProtoScale在线软件(http://expasy.org/tools/protscale.html)分析蛋白质疏水性[16-17]。使用NetPhos 3.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)、NetOGlyc 4.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetOGlyc-4.0)和NetNGlyc 1.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)预测磷酸化位点和糖基化位点[12, 18-19]。使用SignalP-4.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/)和TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)进行蛋白质信号肽和跨膜区预测[19]。STRING数据库(https://string-db.org/cgi/input.pl)对蛋白进行交联分析[20]；使用MEGA X软件进行进化树分析[21]。
1.8 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)收集转染后的DPC，用Trizol法提取总RNA，并通过HiScript Ⅱ Q Select RT SuperMix for qPCR合成cDNA第一链，cDNA反转录产物用于qRT-PCR试验，使用ChamQTM SYBRⓇ qPCR Master Mix配置PCR体系，由QuantStudioⓇ5上机操作，引物序列见表 1。
1.9 统计分析使用Excel 2019整理数据，2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。利用SPSS 25.0进行差异分析，P < 0.05为差异显著，P < 0.01为差异极显著，试验中至少设计3个生物学重复，结果使用“平均值±SD”表示。
2 结果 2.1 KRT16的克隆和生物信息学分析由试验结果可知，KRT16基因CDS为1 431 bp，共编码476个氨基酸，其分子式为C2207H3544N652O749S18，分子量为51.77 ku，理论等电位为5.08。不稳定系数为63.48，表明该蛋白为不稳定蛋白。利用ProtoScal在线软件对蛋白进行亲/疏水性分析，结果见图 1A。由图 1A可知，第93位的苯丙氨酸疏水性最强，第150位的谷氨酰胺亲水性最强，亲水系数均值为－0.545，说明KRT16为亲水蛋白。UniProt预测KRT16蛋白主要定位于细胞骨架。NetPhos 3.1 Server预测结果如图 1B所示，KRT16蛋白存在69个磷酸化位点：52个丝氨酸(Ser)，12个苏氨酸(Thr)，5个酪氨酸(Tyr)。NetOGlyc 4.0预测KRT16蛋白O-糖基化位点有21个。NetNGlyc 1.0 Server预测KRT16蛋白不存在N-糖基化位点(图 1C)。SignalP 4.0和TMHMM 2.0预测，KRT16蛋白不包含跨膜区(图 1D)和信号肽(图 1E)。
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A. KRT16蛋白的亲水性预测；B. KRT16蛋白的磷酸化位点预测；C. KRT16蛋白的N-糖基化位点预测；D. KRT16蛋白的跨膜结构域预测；E.KRT16蛋白的信号肽预测 A. Prediction of hydrophilicity of KRT16 protein; B. Prediction of phosphorylation sites of KRT16 protein; C. Prediction of N-glycosylation sites of KRT16 protein; D. Transmembrane domain prediction of KRT16 protein; E. Signal peptide prediction of KRT16 protein 图 1 KRT16蛋白的生物信息学分析 Fig. 1 Bioinformatics analysis of KRT16 protein |
KRT16的二级结构预测表明，α-螺旋占61.76%，延伸链占7.77%，β转角占3.15%，无规则卷曲占27.31%(图 2A)。KRT16三级结构预测为一条螺旋链(图 2B)。KRT16蛋白的交联作用利用STRING数据库进行分析(图 2C)，结果表明KRT16与KRT1、KRT5、KRT17、DSG1蛋白等存在互作关系。
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A. KRT16蛋白的二级结构预测；B. KRT16蛋白的三级结构预测；C. KRT16及其相关蛋白的相互作用网络 A. Secondary structure prediction of the KRT16 protein; B. Tertiary structure prediction of KRT16 protein; C. Interaction network of KRT16 and its related proteins 图 2 KRT16蛋白的结构预测及互作蛋白 Fig. 2 KRT16 structural prediction and PPI network |
利用MEGA X软件，将家兔KRT16基因序列与中国仓鼠(Cricetulus griseus)、小鼠(Mus musculus)、河狸(Castor canadensis)、北美鼠兔(Ochotona princeps)、人(Homo sapiens)、家猫(Felis catus)、狗(Canis lupus familiaris)及水牛(Bubalus bubalis)的KRT16基因序列进行系统发育树的构建(图 3)。结果显示，兔和北美鼠兔形成一个分支，同源性达到76%。
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图 3 不同物种间KRT16基因的系统进化树 Fig. 3 Phylogenetic tree of KRT16 and other homologous sequences |
qRT-PCR结果显示(图 4)，KRT16在毛囊周期同期化后的生长期表达量最高，显著高于退行期(P < 0.05)，极显著高于休止期(P < 0.01)，由此说明KRT16在毛囊生长期高表达。KRT16的表达水平随时间变化而变化，提示其参与毛囊周期性发育。
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*.表示差异显著(P < 0.05)，**.表示差异极显著(P < 0.01)，下同 *.indicates the significant difference (P < 0.05), **. indicates the extremely significant difference (P < 0.01), the same as below 图 4 KRT16在长毛兔不同毛囊发育周期中的表达量变化 Fig. 4 The expression level of KRT16 mRNA during the hair follicle cycle and skin development in Angora rabbits |
将pcDNA3.1-KRT16过表达载体和siRNA-KRT16转染至DPC中，qRT-PCR结果表明pcDNA3.1-KRT16能够极显著上调KRT16基因的表达量(P < 0.01，图 5A)，siRNA-KRT16能够极显著下调KRT16基因的表达量(P < 0.01，图 5C)，提示过表达载体和siRNA转染成功。同时发现(图 5B、5D)，过表达KRT16后，SFRP2和TGFβ1基因的mRNA表达量极显著下降(P < 0.01)，BCL2、CCND1、EGF、LEF1和CTNNB1基因的mRNA表达量极显著提高(P < 0.01)；而敲减KRT16后，SFRP2和TGFβ1基因的表达量极显著提高(P < 0.01)，BCL2、CCND1、EGF、LEF1和CTNNB1基因的表达量极显著下降(P < 0.01)。由此可知，KRT16基因能够调控毛囊生长发育相关基因表达。
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A. pcDNA3.1-KRT16极显著上调DPC中KRT16 mRNA表达水平；B. pcDNA3.1-KRT16对毛囊发育相关基因的影响；C. siRNA-KRT16极显著下调DPC中KRT16 mRNA表达水平；D siRNA-KRT16对毛囊发育相关基因的影响 A. pcDNA3.1-KRT16 significantly increased the expression of the KRT16 mRNA level in DPC; B. Effects of pcDNA3.1-KRT16 on the expression levels of hair follicle development related genes; C. siRNA-KRT16 significantly reduced the expression of the KRT16 mRNA level in DPC; D. Effects of siRNA-KRT16 on the expression levels of hair follicle development related genes 图 5 KRT16对毛囊发育相关基因表达的影响 Fig. 5 Effects of KRT16 on the expression levels of hair follicle development related genes |
DPC中过表达和敲减KRT16，通过CCK8法检测细胞增殖情况。结果表明，在细胞处理后的0和24 h，细胞增殖无明显差异。转染48 h后，与对照组相比，过表达KRT16极显著促进DPC增殖(P < 0.01)，而敲低KRT16显著抑制DPC的增殖(P < 0.05)(图 6)。
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A. pcDNA3.1-KRT16对DPC细胞增殖的影响；B. siRNA-KRT16对DPC细胞增殖的影响 A. Effects of pcDNA3.1-KRT16 on DPC proliferation; B. Effects of siRNA-KRT16 on DPC proliferation 图 6 KRT16对DPC增殖的影响 Fig. 6 Effects of KRT16 on DPC proliferation |
角蛋白作为上皮细胞骨架的主要成分，最初仅被认为参与维持细胞的结构，而随着对角蛋白研究的深入，越来越多的研究表明角蛋白参与细胞增殖、迁移、凋亡等多种生命活动[22]。KRT16在疾病中的研究较为广泛，与银屑病、先天性厚甲症和掌跖角化症有着密切联系[23-24]。已有研究表明，KRT16受到miR-31的靶向调控，调节皮肤和毛囊基因的表达与毛囊周期变化[25]；EGF可以通过转录因子Sp1和c-Jun诱导KRT16表达，而EGF可以促进DPC增殖，并通过调控细胞信号途径改变细胞周期，进而影响毛发的生长[26]；Hox13与KRT16互相作用，有研究表明Hoxc13通过调节角蛋白分化影响毛囊生长[27]。
本研究中，KRT16的表达量在生长期最高，由此说明KRT16在生长期处于高表达水平。获取完整的兔KRT16 CDS后，对其进行生物信息学分析显示，KRT16 CDS包含一个1 431 bp的ORF，编码476个氨基酸。KRT16是一种亲水蛋白，主要存在于细胞骨架中，且由α螺旋结构构成。通过预测发现，KRT16蛋白磷酸化和糖基化位点丰富，说明KRT16可能参与细胞增殖，细胞凋亡，化学信号传导等重要过程。此外，系统发育树分析表明，兔KRT16在进化树上最接近于北美鼠兔。另外，KRT16与KRT17、KRT1和KRT5等蛋白存在互作关系。已有研究表明，KRT1和KRT5在毛囊生长期表达量最高，可能促进毛囊生长发育[28]。KRT17同样对毛囊生长有着重要作用，在小鼠中敲除KRT17出现脱毛现象[29]。在本研究中，过表达KRT16能够显著上调BCL2、CCND1、CTNNB1、LEF1、和EGF表达，敲减KRT16能够显著下调它们表达；过表达KRT16显著下调TGFβ1和SFRP2表达，敲减KRT16显著上调它们的表达。其中，SFRP2作为Wnt调节剂，在毛囊发育中有着重要作用，并且可以通过抑制Wnt活性来抑制角质形成细胞的增殖[30]。TGFβ1是一种多功能因子，对大多数细胞的生长起到抑制作用，并且已有研究发现TGFβ1在毛囊退行期高表达[31-32]。Wnt/CTNNB1信号通路是经典的信号通路，主要参与毛囊生长调节，CTNNB1还是细胞膜标志蛋白质，可以调节细胞生长和细胞间黏附[33]。LEF1被认为是毛囊正常发育以及促进毛母质细胞分化所必需的转录因子[33-34]。EGF因子大量分布在表皮、真皮与表皮结合处，是一种外源性调节因子，具有调控毛囊生长的作用，促进上皮细胞繁殖，并且有研究表明EGF可以诱导KRT16表达[34-35]。CCND1是细胞周期调节因子，同时也是抑凋亡基因，对细胞增殖起到促进作用。BCL2也同样是抑凋亡基因，有研究表明BCL2能够在毛囊各个时期皆有表达，并能调节毛囊细胞的凋亡[36-40]。KRT16能够上调CCND1与BCL2的表达，提示KRT16能够促进细胞增殖。另外，KRT16的敲低能够降低肺腺癌癌胞的体外迁移、侵袭和增殖能力，并能降低角质形成细胞的存活率[41]。本研究中，KRT16能够促进DPC增殖，说明KRT16能够调控DPC的细胞活动，从而影响毛囊周期性再生。
4 结论本试验成功克隆得到了兔KRT16基因，KRT16基因的编码序列全长1 431 bp，可编码476个氨基酸，预测KRT16蛋白为亲水蛋白，存在69个磷酸位点和21个O-糖基化位点。在毛囊发育周期中，KRT16在毛囊生长期高表达，并能调控毛囊生长发育相关基因，促进毛乳头细胞增殖。本研究通过对KRT16基因功能的初步研究，为毛囊发育的基础研究提供参考，同时为长毛兔毛囊发育相关基因的功能研究提供依据。
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(编辑 郭云雁)