脊椎动物胚胎发育从一个单细胞到一个独立的个体，是通过高度复杂而又协调的机制在时间和空间上共同发挥作用的，其中一个关键阶段就是脊椎轴向骨骼的形成。在胚胎发育过程中，体节是轴向骨骼形成的前提，最初的体节是由中胚层分化形成，并在形态上是相似的，但它们具有沿体轴方向的解剖学特征。最终形成具有复杂特征的枕骨、颈椎、胸椎、腰椎、荐椎和尾椎[1-3]。在物种内每个域中的椎骨数量是固定的，但在物种之间每个域中的椎骨数量各不相同，从而产生了特定于物种的轴向公式[4]。而猪是为数不多的胸、腰椎数可变的经济动物之一[5]。猪胸、腰椎总数与胴体性状相关性较强，研究表明随着胸、腰椎数的增加，胴体长[6]和胴体重[7]也随之增加。
体节作为脊椎形成最重要的前体结构，在形成过程中受到多个基因及基因家族的调节，包括时钟基因Hes7[8]和Lfng[9]，以及Hox基因家族[10]等。其中Homeobox(Hox)基因在组织特性规范中起关键作用，其表达受到严格的时间调控，赋予了轴向特性，还可以控制肢芽的位置，形成侧板中胚层，因此，Hox基因的表达指定了解剖学上不同的脊柱亚型[2]。Hox基因被认为在脊椎动物胚胎发生过程中参与前后轴(a-p)模式[11]，在生物体的轴向发育模式中起着重要作用[12]。哺乳动物有将近40个Hox基因家族成员，分成4个簇：HoxA、HoxB、HoxC和HoxD，这些基因的形成主要是通过祖先簇的重复以及随后的基因丢失或重复引起[13]。Hox基因具有相似的序列和相对位置被划分为13个组，13组基因在簇内的位置具有功能相关性，反映了基因在前后轴上的时间和空间表达顺序，这一特征称为共线性[14]。脊椎动物的Hox簇在组中是紧凑的，具有统一的转录方向，共线Hox基因的激活被翻译成沿轴的空间表达模式[15]。其中HoxB簇基因在不同发育阶段和多个组织中的表达存在空间共线性[16]。HoxB簇基因共包含10个基因(HoxB1-9和HoxB13)。前期本团队对北京黑猪进行GWAS和GO富集分析将HoxB1-7、HoxB9和HoxB13作为影响脊椎数的候选基因[17]。
北京黑猪是1960年由巴克夏、大白和中国地方猪种杂交形成的一个培育猪种[18]，在北方猪肉市场中占有重要地位，但是北京黑猪在Hox基因多态性与性状的关联分析方面未见报道。本研究对HoxB簇中9个基因所有外显子区进行PCR及测序检测突变位点并将其与表型进行关联分析，以期探索影响性状变异候选基因功能位点，为性状变异遗传机理的阐释奠定基础。
1 材料与方法 1.1 试验群体北京黑猪群体均饲养在北京黑六牧业科技有限公司，共251头个体，所有猪健康状况良好。管理方式和饲喂方式均一致。251头北京黑猪于220日龄在北京二商集团有限责任公司进行屠宰，在屠宰中收集其组织样本并记录脊椎数和胴体性状(胴体长、胴体斜长、胴体直长和胴体重)。
1.2 DNA提取及检测使用QIAamp DNA Mini Kit试剂盒进行组织样品的DNA提取，使用IMPLEN超微量分光光度计进行DNA质量检测(DNA浓度、核酸与蛋白及酚类物质最高吸收峰的吸收波长比值(OD260 nm/OD280 nm)、核酸与碳水化合物最高吸收峰的波长比值(OD260 nm/OD230 nm)的检测)，并用2%琼脂糖凝胶进行DNA质检，检测合格的DNA样品用于后期试验。
1.3 引物设计及合成本试验的引物均使用Primer Premier 5.0软件设计，引物序列均由赛默飞(ThermoFisher)合成。本研究设计9个基因(HoxB1 (ENSSSCT0000 0019086.4)、HoxB2 (ENSSSCT00000019087.4)、HoxB3 (ENSSSCT00000019088.4)、HoxB4 (EN SSSCT00000019089.5)、HoxB5 (ENSSSCT00000 019094.5)、HoxB6 (ENSSSCT00000019093.5)、HoxB7 (ENSSSCT00000019092.4)、HoxB9 (ENS SSCT00000101474.1)、HoxB13 (ENSSSCT00-000019095.5))共45对引物，其中检测到SNPs的引物有6对(表 1)。
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表 1 引物信息 Table 1 Information of primers |
使用诺唯赞(Code：P505-d1，Vazyme)的高保真酶进行PCR，本试验对251头北京黑猪个体采用25 μL反应体系(2×Phanta Max Buffer 12.5 μL，0.5 μL聚合酶，0.5 μL dNTP，1 μL上游引物，1 μL下游引物，8.5 μL无菌水，1 μL模板)进行PCR。程序如下(ABI, Singapore)：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，57~62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30~90 s，35个循环；72 ℃延伸2 min。PCR产物通过切胶回收单一条带在北京六合华大基因科技有限公司平台进行双向Sanger测序。
1.5 基因分型及数据统计分析将测序结果使用SeqMan进行基因分型，使用Microsoft Excel 2016进行基因型频率和等位基因频率的统计。采用SAS软件的GLM程序，以基因型为固定效应，采用单因素方差分析(ANOVA)分析基因型效应。动物模型如下: Y=μ+基因型+e，其中Y为表型值，μ为共同均值，e为随机误差。采用Duncan’s多重检验估计不同基因型间最小二乘均值(LSM)的差异。数据使用“平均值±标准误”表示，P < 0.05判定为差异显著。
2 结果 2.1 北京黑猪脊椎数和胴体性状的表型统计251头北京黑猪个体的表型值(脊椎数和胴体性状)见表 2，脊椎数的均值为20.95节，变异系数为2.67%；胴体长的均值为98 cm，变异系数为5.19%；胴体直长的均值为89.74 cm，变异系数为4.83%；胴体斜长的均值为76.06 cm，变异系数为4.38%；胴体重的均值为64.37 kg，变异系数为12.47%。
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表 2 脊椎数和胴体性状的表型值统计 Table 2 Statistics of phenotypic values of the vertebral number and carcass traits |
通过对HoxB簇中9个基因的mRNA序列进行变异位点检测共发现12个SNPs(表 3)均在UTR区，其中1个5′UTR突变(HoxB2)，11个3′UTR突变分别在HoxB5、HoxB9、HoxB13中(表 3)。这12个突变位点的等位基因频率变化范围为4%~96%，其基因型频率变化范围为1%~93%。
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表 3 北京黑猪HoxB2、HoxB5、HoxB9和HoxB13的基因型频率及等位基因频率统计 Table 3 Statistics of genotype and allele frequencies of HoxB2, HoxB5, HoxB9 and HoxB13 in Beijing black pigs |
本研究将HoxB簇中的9个基因通过PCR扩增及变异检测筛选到12个(1个HoxB2基因5′UTR，2个HoxB5基因3′UTR，2个HoxB9基因3′UTR，7个HoxB13基因3′UTR)SNPs与脊椎数和胴体性状进行关联分析，结果见表 4。HoxB2上的1个5′UTR突变c.40 C>T、HoxB5上的2个3′UTR突变c.1766 A>G、c.1767 A>G与性状关联不显著；HoxB9上的2个3′UTR突变中c.2743 C> T与胴体性状关联显著，其中CT基因型对应的胴体性状有优势，而c.2254 A>G与性状关联不显著；HoxB13上的7个3′UTR突变中c.1863 G>A、c.1440 A>C与脊椎数性状显著关联，两个位点中AA基因型对应的脊椎数更有优势，而c.1736 G> A、c.1444 G>C、c.1433 A>C、c.1310 A>G及c.1221 G>A与性状关联不显著。
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表 4 HoxB2、HoxB5、HoxB9和HoxB13基因5个SNPs与脊椎数和胴体性状的关联分析 Table 4 The association analysis of 5 SNPs of HoxB2, HoxB5, HoxB9 and HoxB13 genes with vertebral number and carcass traits |
猪的脊椎数作为一个高遗传力的有重要经济价值的优良性状，一直以来都受到研究者的高度青睐。研究者利用QTL定位和GWAS技术在猪的多个经济性状进行检测，发现了大量的QTLs[19]。猪QTL数据库共记录34 333个QTLs(http://www.animalgenome.org/cgi-bin/QTLdb/index，2021年12月27日)，其中对于脊椎数的研究显示，QTLs主要集中在SSC1和SSC7上，而对于胴体长和胴体重每条染色体上都存在QTL。Mikawa等[20]通过对3个F2群体进行最小二乘区间映射分析，发现SSC1和SSC7上存在与脊椎数相关的QTL。大量的研究表明，影响脊椎数变异的QTL主要集中在SSC7上[21]。对于胴体性状也进行了大量的QTL定位和GWAS研究，发现QTL在SSC7上也有定位[22-24]。但在北京黑猪的GWAS结果中除了SSC7上出现了经典的QTL以外，在SSC12上出现了一个新的QTL，并且在QTL中定位到了HoxB簇的9个基因为影响脊椎数变异的候选基因[17]。
每簇的3′端Hox基因首先表达，而更多的5′端Hox基因在稍后时间表达，这种现象被称为“时间共线性”[25]。Hox基因在动物胚胎发育过程中调节轴向区域特征，最初在原肠胚形成期间被激活。HoxB簇包含10个基因，HoxB1-9和HoxB13。HoxB簇基因中缺失90 kb的小鼠表现出一系列有序的沿颈椎和胸椎柱的单节前部同源异位转化以及胸骨形态发生缺陷[26]。在鸡胚中，对HoxB簇基因的研究表明，HoxB1-3基因均在原始条纹附近表现出更高水平的表达，而在周围细胞中表达水平逐渐降低[16]；HoxB5基因表达模式与其他HoxB簇基因显著不同，它始于后原始条纹，随后沿条纹向前延伸；HoxB8基因沿原始条纹和Hensen节点表达，偶尔以不对称方式表达；且HoxB9与HoxB8基因表达非常相似。研究表明，HoxB9基因在Alpha5亚基缺陷小鼠的胚胎中表达减少，Alpha5beta1纤连蛋白的互作对于中胚层衍生物的维持以及某些神经嵴细胞的存活至关重要，影响了中胚层的发育[27]。并且HoxB9基因还对体节发育中胸腔的形成以及前肢的发育有重要作用[28-30]。HoxB13基因在主动终止沿前后轴的后延伸中至关重要[31-34]。此外，HoxB13基因敲除对于小鼠体节的增加有显著影响[35]。同时将其启动子进行过表达，发现小鼠胚胎缺失大部分甚至全部尾巴[31]。因此，先前大量的研究均表明Hox家族在发育中发挥着重要作用，从原肠胚形成阶段开始，到胚胎前后轴的形成、肢体发育以及器官形成都起到关键作用[15, 30, 36-37]。因此，本研究对北京黑猪SSC12上HoxB簇的9个基因进行多态性分析，发现在mRNA的5′和3′UTRs存在SNPs。其中，有个通常高度保守的从几个到几百个核苷酸不等的3′UTRs[38]。储存在3′UTRs中的遗传信息可以通过3′UTRs介导的蛋白质互作(PPI)的形成传递给蛋白质[39]。高度保守的序列特征表明3′UTRs具有重要的调控作用，如mRNA的定位、mRNA的稳定性和翻译等占有重要地位；另一方面，3′UTRs存在异构体，可以用来区分高度相似的蛋白质功能[40]。
先前对于HoxB簇基因进行了多态性研究，对东亚人HoxB簇基因多态性与牙齿和咬合特征进行关联性分析[41]。对HoxB13基因的多态性进行探索也发现了与前列腺癌关联的SNPs[42]。对肺癌的研究中，在HoxB2基因中也发现了与其关联显著的SNPs[43]。在本研究中，发现3′UTRs存在与脊椎数和胴体性状显著相关的SNPs。本研究在HoxB9基因的3′UTR中通过关联分析发现1个SNP(c.2743 C>T)与胴体性状关联显著。因此，HoxB13基因对前后轴的完成有至关重要的作用，主要是在主动终止沿前AP轴的后延伸[31-34]。但在本研究中对其两个外显子进行PCR扩增及关联分析发现，3′UTR中2个SNPs(c.1863 G>A、c.1440 A>C)与脊椎数性状关联显著，与胴体性状关联不显著。
4 结论在北京黑猪群体中，HoxB9基因上的c.2743 C> T位点与胴体性状关联显著，HoxB13基因中c.1863 G>A、c.1440 A>C与脊椎数性状关联显著。这3个位点的发现为猪脊椎数和胴体性状的分子标记辅助选育工作提供了基础。
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(编辑 郭云雁)