原生动物包含许多人兽共患和重大动物疫病寄生虫，严重影响人类和动物健康。由于生活史复杂，不少寄生虫缺乏完成整个生活史的体外培养技术，原虫的功能基因组学和分子生物学研究因此受阻。1993年，弓形虫[1-2]和疟原虫[3]被报道可以利用同源重组实现报告基因的表达，此后其他原虫的反向遗传学工作平台也逐步建立。最近20年，原虫的反向遗传学研究取得长足进展。通过设置同源臂的方法，同源重组技术为原虫的基因定位、功能研究、抗原筛选等研究提供有力支持[4]。但同源重组的基因编辑系统存在转染效率较低、需要的同源臂较长、筛选过程时间长的问题。有的原虫(如隐孢子虫)基因组小，缺乏同源重组修复系统，较难开发同源重组基因编辑体系。
CRISPR(成簇的规则间隔的短回文重复序列)是在细菌和古细菌中发现的一种天然存在的适应性免疫系统，其作用是破坏噬菌体和质粒等外源DNA序列[5-7]。最早研究的源自化脓链球菌的Cas9蛋白(SpCas9，最初被命名为CSN1)是目前最常用的Cas9蛋白。此外，2017年报道源自金黄色葡萄球菌的SaCas9蛋白在克氏锥虫基因编辑中达到几乎100%的基因敲除效率。2012年2个实验室的工作证明优化后的CRISPR/Cas9系统可用于生物的基因编辑，并将该系统工作所需的2条RNA进一步简化为一条向导RNA(gRNA)，实现人工设计靶向不同基因区域的gRNA和Cas9蛋白，完成定向高效的DNA双链切割[6-7]。CRISPR/Cas9系统被《Science》杂志评选为2013年度最重要的科学突破之一，自应用以来在生命科学领域大放异彩，在寄生虫研究上也从疟原虫和弓形虫，逐步推广到在利什曼原虫、隐孢子虫和艾美耳球虫等的应用。CRISPR/Cas9系统在人工设计的前提下，完成定向DNA双链断裂(DSB)，供体的模板质粒只需更短的同源臂，即可完成准确高效的基因编辑。该系统还可针对多基因家族[8]，利用少量的gRNA完成高通量全基因组筛查工作，是寄生虫的基因功能研究强有力的工具。本文将从CRISPR/Cas9系统的工作原理和目前在寄生原虫中的主要应用进行介绍。
1 CRISPR/Cas9系统工作原理在CRISPR/Cas9系统出现之前，原虫的基因编辑主要通过同源重组的方式实现。将带有一定长度(一般至少400 bp)同源臂的目的基因的质粒转入寄生虫，利用同源重组让目的基因插入原虫基因组同源臂中，从而实现基因编辑[9]。该方法所需时间长，转染效率低(双质粒共转染的效率更低)，药物筛选耗时较长，一般只能进行单基因的研究。
CRISPR/Cas9系统分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，其中Ⅲ型在基因编辑上应用最广泛——主要通过Cas9蛋白对目标DNA双链切割。2013年，CRISPR/Cas9系统被简化为只需要Cas9蛋白和20 bp的gRNA即可完成定向DNA编辑[6-7]。CRISPR/Cas9系统工作原理及修复机制如图 1所示，其中DNA双链断裂修复主要通过3个机制：1)同源直接修复(homologous direct repair，HDR)。当存在具有断裂位点上下游同源臂的DNA时，以此为模板进行修复。2)非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)。当缺少供体模板时，在两个断口直接连接。3)微同源末端连接(microhomology-mediated end joining，MMEJ)。利用微同源小片段切除非同源的单链DNA，断口处直接连接。
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图 1 CRISPR/Cas9系统工作原理及修复机制 Fig. 1 Principle and repair mechanism of the CRISPR/Cas9 system |
除常用的电转含有Cas9和gRNA质粒的方法外，还可以将Cas9蛋白和gRNA复合物直接转入寄生虫体内。后者在克氏锥虫中达到转染效率接近100%的效果[10]。CRISPR/Cas9系统显著提高原虫的转染效率，并且可通过建立gRNA文库的方式，完成双基因、甚至多基因的研究，为多基因家族功能研究提供高通量快速筛查的高效准确工具。
2 CRISPR/Cas9系统在原虫中的应用寄生原虫基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术开展较早，可追溯到20世纪80年代末、90年代初[1-3, 11-16]。2014年Shen等[17]和Zhang等[18]分别将CRISPR/Cas9技术引入弓形虫和克氏锥虫的反向遗传学研究，自此CRISPR/Cas9系统逐渐在研究原虫的基因定位、基因敲除、基因家族高通量筛选等方面崭露头角[19-60](部分原虫基因编辑技术发展情况见图 2)。与传统的同源重组技术相比，CRISPR/Cas9系统不仅具有转染效率更高、周期更短、准确性更高等优点，并且可在较短的时间内对同源性高的基因家族进行高通量筛选。此外，CRISPR/Cas9系统可结合多种反向遗传学研究策略，如利用CRISPR/Cas9系统标记关键基因[19]、结合类植物生长素诱导条件性降解系统(auxin-inducible degron，AID)[20]研究必需基因的功能和表型、利用改良的CRISPR/dCas9系统进行表观遗传学研究[21-22]等，显著扩展其应用领域，为假定基因的功能研究提供高效工具。
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月亮、太阳和星星标记分别代表瞬时转染、稳定转染和CRISPR/Cas9技术[1-3, 9, 11-13, 15-19, 23-24, 49-63] Moon, sun, and star shapes indicate transient, stable transfection, and CRISPR/Cas9-based editing, respectively[1-3, 9, 11-13, 15-19, 23-24, 49-63] 图 2 部分原虫基因编辑技术发展时间线 Fig. 2 Timeline of the development of genetic manipulation methods in some parasitic protozoa |
2014年，2个研究团队分别报道了CRISPR/Cas9系统在疟原虫上的应用。Wagner等[23]利用T7 RNA聚合酶产生的sgRNA和Cas9蛋白对恶性疟原虫的基因组进行编辑，分别靶向富含组氨酸的疣状突起相关蛋白基因(kahrp)和红细胞结合抗原175基因(eba-175)，证实该系统在恶性疟原虫上具有较高的基因编辑效率(50%~100%)。恶性疟原虫缺乏NHEJ途径，CRISPR/Cas9系统可显著提高疟原虫的基因编辑效率。
同年，Ghorbal等[24]同样构建对恶性疟原虫基因编辑的CRISPR/Cas9系统，利用Cas9质粒及含sgRNA和人二氢叶酸还原酶药筛基因(hdhfr)的供体模板质粒共转染的方案，敲除表达绿荧光的NF54株的egfp基因。此时Cas9蛋白为瞬时表达。3周内得到的WR耐药虫株PCR和荧光检测均证实egfp基因被成功敲除。供体模板质粒线性化后转染，证实与环形质粒几乎一致的转染效率，而且具有转染4 d后线性化模板自动丢失的优点，避免供体模板对整合效果检测的影响。除了靶向egfp基因，同样的方案应用在内源性的非必需基因kahrp上得到了相似的效果。后续研究利用该系统对orc1基因完成不带标签的定点突变，发现基因敲除的克隆株具有青蒿素抗性。
CRISPR/Cas9系统作为强大的基因编辑工具，为疟原虫的基因编辑研究提供有力支持。如2015年Nacer等[25]利用该系统鉴定PfVAP1(毒力相关蛋白1)是恶性疟原虫细胞黏附的关键因素。Mogollon等[26]2016年改良Ghorbal等团队的研究方法，重新设计sgRNA和供体质粒，证实PfVAP1在FCR3疟原虫的黏附过程中的作用。Bryant等[27]在2017年使用该系统完成恶性疟原虫var2csa基因编辑，发现缺失内含子不影响该基因对正常调控。2019年Xiao等[22]应用改良的CRISPR/dCas9系统对寄生虫入侵相关基因的转录进行表观遗传调控，并证明dCas9可以将融合的表观遗传调节因子[如组蛋白乙酰转移酶(HAT)或去乙酰化酶(HDAC)结构域]，完成恶性疟原虫基因过表达或转录敲低。同年Mohring等[28]实现CRISPR/Cas9系统在诺氏疟原虫基因组编辑上的应用，但存在同源重组修复效率低的问题。2021年Boltryk等[29]报道利用CRISPR/Cas9建立NF54诱导的配子体产生虫株，实现大规模同步产生定向分化的配子体，为疟疾传播阶段研究提供宝贵工具。
2.2 弓形虫弓形虫具有较为成熟且容易的体外培养和遗传研究系统，突变诱导、基因标记、基因敲除和基因替换等较其他原虫容易[8]。同时弓形虫具有活跃的NHEJ途径，DNA随机整合效率高，因此降低同源重组的精确性。
Shen等[17]早在2014年对CRISPR/Cas9系统进行改造，将含有靶向尿嘧啶磷酸核糖转移酶(UPRT)基因的sgRNA和Cas9-NLS-GFP的质粒电转入Ⅰ型RH株中，有20%~30%的弓形虫为Cas9-GFP阳性。UPRT失活可产生氟脱氧核糖(FUDR)抗性，故FUDR耐药性的噬斑试验证实约有10%的Cas9-GFP阳性弓形虫UPRT失活。FUDR耐药的单克隆虫株目标区域的基因测序结果证实UPRT存在短缺失或插入突变。重复上述转染试验时共转包含乙胺嘧啶耐药基因DHFR的供体质粒，同时用乙胺嘧啶筛选，观察到70%~100%的乙胺嘧啶抗性寄生虫同样抗FUDR。乙胺嘧啶抗性虫株的单克隆的PCR结果证实超过45%的虫株为DHFR的正确整合，说明该系统能有效增强gRNA靶向区域的局部重组，提高基因敲除频率。改变供体质粒后重复试验，成功删除UPRT基因，说明该系统可同样应用于较大基因区域的敲除。为研究该系统是否与同源重组的基因编辑相同、存在需要相对较长同源臂的局限性，该团队将长同源区域(750~900 bp)、20 bp侧翼区域和缺乏同源性的dhfr的靶向效率做比较，发现三者均显示高于50%的正确整合效率，表明该系统可用于提高特定位点的非同源整合效率。该团队用靶向丝氨酸苏氨酸激酶(ROP18)的质粒对Ⅰ型的GT1株的敲除及敲除虫株的回补试验，证实该系统可广泛地应用于弓形虫基因编辑。2017年该团队优化CRISPR/Cas9系统，通过引入突变降低Cas9蛋白毒性，并提供弓形虫CRISPR/Cas9系统应用操作指南[30]。
Sibley团队在2017年报道2篇CRISPR/Cas9系统和类植物生长素诱导的降解因子(AID)系统在弓形虫基因功能研究中的应用：Long等[31]检测类钙调蛋白(CaM)的功能，证实CaM与肌凝蛋白(MyoH)共定位，且与弓形虫入侵密切相关；Brown等[32]检测蛋白激酶(PKGs)的功能，证实PKG Ⅰ为弓形虫生长必需蛋白，而PKG Ⅰ存在的前提下，PKG Ⅱ为弓形虫的非必需蛋白。
Sidik等[33]在2014年构建包含靶向速殖子表面蛋白基因(sag1)的嵌合体RNA(chiRNA)和带flag标签带Cas9蛋白的质粒。在未经筛选的情况下，RH株的sag1敲除效率约为20%。用缺少NHEJ修复机制的ΔKU80株重复上述试验，寄生虫数量与RH株相比减少10倍，而转染效率相当。根据转染替换Cas9成dhfr的相似质粒的2种虫株的噬斑试验对比，进一步证明弓形虫在DNA双链断裂后依赖NHEJ修复。该研究还利用较短的同源臂(40 bp)定点插入模板DNA，实现对内源性基因cdpk3的标记。该团队在2016年设计gRNA文库，对弓形虫基因组进行高通量筛选[8]。
Cas9蛋白在弓形虫中存在内在毒性，传代过程中该基因频繁丢失，Markus等[34]在2019年发现优化表达载体和gRNA的设计能显著降低Cas9蛋白的毒性，认为gRNA同时具有基因组靶向、促进Cas9蛋白的整合和降低Cas9毒性、提高适应性的功能。
CRISPR/Cas9系统在弓形虫研究中应用以来，已成为弓形虫高通量筛选[8, 35-37]、基因功能验证[38-39]、致病机制[40-41]、免疫互作[35, 42-44]、代谢分析[45]、药物机制[36, 46]、疫苗开发[47]等研究必不可少的工具，并在此基础上开发的AID系统[20]、转录抑制(基因条件性敲低)[48]等新工具，为寄生虫研究提供更广阔的研究前景。
2.3 艾美耳球虫Tang等[57]报道CRISPR/Cas9系统在柔嫩艾美耳球虫高效基因编辑的应用。首先通过瞬时转染His4启动子介导的含有黄荧光基因(yfp)标记的Cas9质粒进入子孢子，体外培养24 h观察到球虫细胞核发黄荧光，证实His启动子介导的Cas9基因可在细胞核内表达。然后构建靶向黄荧光基因的sgRNA的质粒转染已有同时发黄荧光和红荧光的EtER虫株，在CRISPR/Cas9系统作用下，转染成功的球虫内因为黄荧光基因发生断裂而失去黄荧光。经过4次传代和流式细胞术筛选，发现黄荧光阳性比例减少到89.5%，说明缺少供体质粒的情况下，球虫偏向于利用NFEJ途径进行自我修复。另外还构建靶向mic2基因末端的sgRNA质粒和带有红荧光基因和药筛基因的供体质粒，对野生型球虫子孢子共转染，并利用PCR和IFA进行验证。试验证明CRISPR/Cas9系统可用于球虫内源性基因和外源性基因的基因编辑，但效率远低于弓形虫或疟原虫，推测可能是双质粒共转染或转染效率低所致。
Hu等[19]利用同源重组技术成功构建在生活史各阶段均能稳定表达Cas9蛋白的柔嫩艾美耳球虫株。该虫株转染不同sgRNA质粒，能进行高效的球虫单基因编辑。向该虫株转染含有靶向外源的黄荧光基因的sgRNA的质粒，证实该系统切割效率可达29%。接着转染针对内源性蛋白EtGRA9的sgRNA和供体质粒，为EtGRA9加上荧光标记，在共聚焦显微镜下发现EtGRA9标记信号存在于囊泡中而不是致密颗粒中，说明EtGRA9属于分泌蛋白。同时设计靶向AP2家族33个基因的sgRNA，经过6次转染试验，发现只有10个AP2家族的基因被靶向破坏，其中可检测9个gRNA(另一个有效读数较低，表明破坏该基因引起虫体生长缺陷)。该试验证明球虫AP2家族中，23个基因在球虫生长繁殖必不可少，为球虫AP2家族研究奠定基础，也证明该工具虫株可以对球虫进行高效的单基因编辑。
2021年Cheng等[64]报道FnCas12a/crRNA和RNP技术可用于柔嫩艾美耳球虫的基因编辑。该团队成功靶向组蛋白H4基因导致其DNA双链断裂，另外还利用eYFP标记内源性EtActin蛋白，观察不同时期肌动蛋白的定位情况。同年Mohsin等[65]报道体外试验中Cas9 mRNA与sgRNA结合可降低卵囊的孢子化率和存活率，为抗球虫试剂研发提供新思路。
2.4 锥虫克氏锥虫由于缺少RNAi的机制，故在功能遗传学研究中受到限制。因此，克氏锥虫的研究需要更强大的反向遗传学研究工具。
2014年Peng等[49]报道CRISPR/Cas9系统在克氏锥虫的首次应用。构建稳定表达绿荧光(GFP)和Cas9(源自化脓链球菌)的虫株后，再分别转入3种靶向gfp的sgRNA。在没有模板的情况下，克氏锥虫的Cas9诱导的DSB的修复缺乏NHEJ途径，只能通过MMEJ进行，产生各种大小的基因缺失。在提供模板tomato标记的情况下，CRISPR/Cas9的基因编辑效率比仅用模板质粒的同源重组方式更高。除外源性基因gfp的破坏外，还利用CRISPR/Cas9分别成功敲除内源性的α-微管蛋白基因、组氨酸裂合酶(HAL)基因和脂肪酸转运蛋白(FATP)基因。此外，还利用CRISPR/Cas9系统对同源性高的多基因家族进行研究，仅设计3个sgRNA即可靶向β-半呋喃糖基糖基转移酶(GAL)家族的65个基因，3次转染后，63%的gal基因获得至少1个靶位点突变，显著敲低该酶基因家族的表达，且未观察到脱靶现象。最后，该研究利用靶向Cas9的sgRNA对Cas9基因破坏，挽救表达Cas9的虫株生长缺陷。上述研究证明CRISPR/Cas9系统可快速高效敲除单拷贝或多拷贝基因，但存在虫株生长速度慢和Cas9活性随时间降低的问题。
Lander等[66]在2015年报道CRISPR/Cas9编辑系统对鞭毛杆蛋白1和2敲除研究，试验结果亦反映出该系统存在药物筛选时间长(数周)和无法研究必需基因的问题。
Soares等[10]在2017年采取源自金黄色葡萄球菌(SaCas9)的Cas9蛋白和gRNA复合物电转的方式，建立接近100%转染效率的克氏锥虫快速基因编辑的系统。首先利用SaCas9/eGFP sgRNA复合物对表达绿色荧光的克氏锥虫进行转染，7 d即达到超过97%寄生虫的敲除，且对照组gfp自发损失极小。其中基因敲除效率与gRNA选择、RNP复合物浓度及电转次数有关。接着构建具有SaCas9-egfp/gRNA复合物，该复合物大小与SpCas9大致相同且具有Cas9活性，用SaCas9-egfp复合物转染低于7%，远低于SaCas9/gRNA复合物转染效率(大于75%)，证实转染SgCas9/gRNA复合物无法进行基因敲除与Cas9-RNP较大有关。通过分别转染不同品系和生活史阶段的锥虫，证实SaCas9/gRNA复合物可转染锥鞭毛体，转染不同表型和基因型的虫株效率相当。单次转染靶向2个基因的RNP复合物，单敲除效率可高达90%，双敲除效率为55%。利用含有终止密码子的修复模板和RNP，可以使galf这类克氏锥虫必需单基因敲除时完成单等位基因敲除。利用RNP和修复模板分别对NTR和CYP进行敲除，再用对应的抗性药物处理，发现RNP介导的必须基因敲低可应用于寄生虫药物基因的研究。此外，还可以用RNP和携带表达标签(如HA)的修复模板对内源性基因标记，在标记的抗体染色和流式细胞术的配合下不需药物筛选，快速高效完成内源基因标记。SacCas9/sgRNA复合物可同样适用于布氏锥虫和利什曼原虫的研究。同年，Beneke等[67]报道建立稳定表达Cas9蛋白的布氏锥虫虫株，结合PCR扩增产物可用于基因高效快速的编辑。该技术亦可应用于利什曼原虫反向遗传学研究：该团队利用CRISPR/Cas9建立鞭毛突变体文库[68]，研究利什曼原虫鞭毛蛋白组功能和真核生物的鞭毛运动。
CRISPR/Cas9基因编辑技术在克氏锥虫上成功应用，极大加快锥虫反向遗传学研究进展。1993年用传统基因编辑技术成功敲除克氏锥虫[12]，此后20年仅20篇关于克氏锥虫的基因编辑报道。自CRISPR/Cas9基因编辑技术成功应用后至今，克氏锥虫完成基因编辑的基因超过67个[69]。
2.5 利什曼原虫Zhang等[18]在2015年利用杜氏利什曼原虫的rRNA启动子和肝炎三角洲病毒(HDV)核酶构建gRNA表达载体，与Cas9蛋白转入杜氏利什曼原虫中，靶向米替福新(MLF)转运蛋白(LdMT)。LdMT的两个等位基因均突变时，寄生虫表现为MLF耐药。从MLF耐药率可以看出，含有HDV核酶的gRNA质粒让gRNA质粒转染效率从0.5%增至12%。对转染后表现MLF耐药的利什曼原虫进行测序，发现利什曼原虫以MMEJ而不是NHEJ途径修复DSB。对比转染含有终止密码子的模板质粒，发现转染效率提高2~6倍，说明HDR途径可以显著改善定点插入的基因编辑能力。用该系统将ble基因定点替换Ldbpk_241510.1基因(一种多药抗性蛋白样基因)，博来霉素药物筛选的阳性虫株的PCR结果证明该系统可以定点插入外源蛋白和敲除非必需基因。用同样的方法靶向必需基因TOR1基因时，发现转染效率较低，并只能破坏其中一个等位基因，说明该系统能部分敲除利什曼原虫的必需基因。还利用该系统成功在LdMT蛋白的基因位点加上gfp标签，以精确标记内源性基因。最后，该研究利用锤头核酶和HDV核酶构建效率更高的双gRNA表达载体，提高利什曼原虫基因编辑效率。2017年该团队优化原有基因编辑技术，构建Cas蛋白和gRNA共表达载体，成功对杜氏利什曼原虫、硕大利什曼原虫及墨西哥利什曼原虫完成基因编辑，并且利用多靶向gRNA实现对杜氏利什曼原虫AP2家族的11个基因敲除[70]。
Sollelis等[51]在2015年构建稳定表达Cas9的硕大利什曼原虫株(命名为M756株)，再向M756株转入同时包含靶向鞭毛杆2基因pfr2(位于鞭毛杆，属于非必需基因)的gRNA和作为供体的DHFR-Ts药筛基因。PCR和FISH检测结果表明，转染后的M90株属于阳性和阴性虫株混合群体。从M90株筛选的8个克隆种，2个克隆被鉴定为成功转染的虫株。为分析CRISPR/Cas9系统的脱靶效应，接着对2个阳性克隆株进行全基因组测序，软件评估出的排名前十的潜在脱靶位点的20 nt内均未发现插入缺失标记，证明未出现脱靶现象。
虽然RNAi技术在利什曼原虫中已有广泛应用，但CRISPR/Cas9系统亦可作为与之互补的基因编辑工具，二者为不同目的和应用的研究提供重要技术支持。2019年Shrivastava等[71]利用CRISPR/Cas9系统建立LeishIF4E-3(+/-) 突变体，该突变体对巨噬细胞的感染性严重降低，且形态发生改变。2021年Baker等[72]用mNeonGreen荧光蛋白标记蛋白激酶以进行定位研究，同时建立ePK以及PIKK两种蛋白激酶突变虫株，评价蛋白激酶调节寄生虫的复制、分化等的作用。
2.6 隐孢子虫Vinayak等[53]在2015年报道CRISPR/Cas9系统在微小隐孢子虫的应用，该团队在2017年提供隐孢子虫转基因技术的详细试验方法[73]。首先在感染HCT-8细胞体外培养的条件下，利用同源重组将荧光素酶基因(nluc)插入烯醇酶基因(一种持家基因)后，利用荧光强度作为寄生虫计数指标。向野生虫株转染nluc缺陷质粒(在nluc基因中插入终止密码子)，在转染靶向nluc缺陷片段的gRNA和一小段DNA双链模板后表达荧光，证实CRISPR/Cas9系统可应用在微小隐孢子虫的基因编辑研究。为提高转染效率，选择氨基糖苷磷酸转移酶NEO(对巴龙霉素有抗药性)作为药筛基因，通过Nluc-Neo融合表达的方式，在巴龙霉素作用下筛选转染的寄生虫。通过对比试验可以发现，同时共转Nluc-Neo和Cas9质粒的寄生虫排卵囊量迅速恢复到与无药野生型组小鼠相似水平，而只转染Nluc-Neo或nluc的小鼠逐步被巴龙霉素治愈，这说明CRISPR/Cas9系统基因编辑效率高于同源重组。对小鼠传代后的Nluc-Neo的寄生虫分别加巴龙霉素进行小鼠体内培养和细胞体外培养，小鼠传代与野生型虫株排卵囊量对比，可明显看出Nluc-Neo虫株对巴龙霉素耐药，免疫印迹、IFA和荧光素试验均证实转染虫株是稳定的转基因虫株。同时，因为微小隐孢子虫具有两条合成dTMP的途径，其中一条为TK酶利用EdU合成dTMP。因此设计针对tk基因的gRNA和Nluc-Neo作为报告基因的供体模板，对隐孢子虫的内源性基因tk完成敲除。该报道中还优化电转程序和缓冲液体系，达到提高10倍电转效率的效果。此外，该团队根据基因组测序结果认为隐孢子虫缺少非同源末端连接的DNA修复途径，在使用CRISPR/Cas9系统时，必需要提供供体DNA。2020年该团队在双环氮杂环丁烷治疗隐孢子虫病的研究中，利用CRISPR/Cas9系统在隐孢子虫中插入苯丙氨酰-tRNA合成酶基因(pheRS基因)并使之产生药物抗性，证实苯丙氨酰-tRNA合成酶被鉴定为双环氮杂环丁烷的靶标[74]。同年，Choudhary等[75]报道基于大肠杆菌二氢叶酸还原酶降解结构域(DDD) 和甲氧苄啶(TMP)和CRISPR/Cas9系统建立第一个隐孢子虫条件性敲降技术，并完成cdpk1基因进行条件性敲除，有助于隐孢子虫的必需基因功能研究。
2021年Xu等[76]在INS1蛋白功能研究中使用CRISPR/Cas9系统标记或敲除ins1基因，发现INS1蛋白参与大配子体形成或成熟。同年，Hasan等[77]利用CRISPR/Cas9系统对隐孢子虫耐药性进行研究。该团队证实Cp MetRS合成酶发生突变后隐孢子虫能正常生长并对MetRS抑制剂2093药物产生抗性。
2.7 其他原虫CRISPR/Cas9系统在新孢子虫(Neospora caninum)的应用首次报道出现在2018年。Arranz-Solís等[63]首次在犬新孢子虫利用CRISPR/Cas9系统实现基因编辑，另外Nishikawa等[78]在同年也报道应用CRISPR/Cas9系统进行犬新孢子虫NcGRA7蛋白的敲除及功能鉴定。前者报道中利用原本用于弓形虫的质粒系统，成功应用于新孢子虫研究。该研究一方面设计2个针对Nc-1-GFP表达虫株中的GFP蛋白的gRNA，实现外源基因的敲除；另一方面针对新孢子虫的gra7基因设计2个gRNA及相应的供体质粒，完成内源基因gra7的敲除。此外，该团队证实CRISPR/Cas9系统可应用于犬新孢子虫的基因编辑。该团队在2022年报道弓形虫的生长素诱导条件性降解系统(AID)可在新孢子虫中成功应用[79]。
2019年Hakimi等[60]利用单个表达Cas9、gRNA和供体模板DNA的质粒，成功用于牛巴贝斯虫(Babesia bovis)的基因编辑。该团队用单质粒系统对牛巴贝斯虫SBP3蛋白末端融合表达myc标签实现蛋白定位，并在感染巴贝斯虫的红细胞表面呈现斑块状染色。该报道还设计针对细胞质抗氧化酶过氧还蛋白基因tpx-1实现单质粒的点突变，将49位的过氧化半胱氨酸突变为丝氨酸。另外，该团队还构建敲除tpx-1基因并替换为gfp基因的虫株。通过tpx-1的突变株和敲除株与原有的野生型的对比发现，前两者均表现出对药物硝普钠(SNP)敏感的特性。
3 展望CRISPR/Cas9系统可以对单基因甚至多基因进行高效、精确和快速的编辑，但在寄生原虫基因编辑的应用上仍存在部分问题。第一，CRISPR/Cas9系统应用时可能存在脱靶效应，应进一步完善gRNA的设计方法，在试验过程中注意对潜在脱靶位点的检查。第二，Cas9蛋白较大，整合到寄生虫基因组中较为困难，对于寄生虫稳定表达Cas9蛋白带来挑战。第三，Cas9蛋白对寄生虫有一定毒性，如克氏锥虫的Cas9蛋白表达株存在生长缺陷[49]，弓形虫表达的Cas9蛋白自发丢失[34]。可在表达Cas9蛋白的同时加入“陷阱sgRNA”的方式降低毒性[34]，或对Cas9蛋白优化，选择更高效安全的Cas9蛋白(如金黄色葡萄球菌的Cas9蛋白[10])。第四，与疟原虫和弓形虫相比，隐孢子虫、球虫等部分原虫可用转基因虫株筛选的抗性基因较少，限制转染效率的提高及基因编辑策略的发展。
CRISPR/Cas9系统在基因编辑应用的不到十年里中，已经在生命科学领域占有重要地位。除了高效的单基因编辑、精确的点突变外，在弓形虫等原虫中出现利用不同策略实现多基因家族编辑、全基因组编辑筛选的报道，展示CRISPR/Cas9系统功能的多样性。虽然仍存在上述的问题，但相信通过科研人员的努力，将来CRISPR/Cas9系统可作为高效便捷的遗传操作工具，可应用在多种寄生性原虫的基因家族功能研究、全基因组功能分析、数量性状研究、药物筛选与耐药基因研究、表观遗传学调控等深入研究之中，并具有应用在往日较难开展反向遗传学操作的寄生性原虫中的潜力，可以为原生动物的反向遗传学、基因功能和疫苗开发等研究提供强有力的技术支持，有望在寄生性原虫的基础研究与防控开展上大放异彩。
| [1] |
KIM K, SOLDATI D, BOOTHROYD J C. Gene replacement in Toxoplasma gondii with chloramphenicol acetyltransferase as selectable marker[J]. Science, 1993, 262(5135): 911-914. DOI:10.1126/science.8235614 |
| [2] |
SOLDATI D, BOOTHROYD J C. Transient transfection and expression in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii[J]. Science, 1993, 260(5106): 349-352. DOI:10.1126/science.8469986 |
| [3] |
GOONEWARDENE R, DAILY J, KASLOW D, et al. Transfection of the malaria parasite and expression of firefly luciferase[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1993, 90(11): 5234-5236. DOI:10.1073/pnas.90.11.5234 |
| [4] |
ZIRPEL H, CLOS J. Gene replacement by homologous recombination[J]. Methods Mol Biol, 2019, 1971: 169-188. |
| [5] |
宋海洋, 吴杰, 邹丰才, 等. CRISPR/Cas系统作用机制及其在寄生虫学研究中的应用[J]. 中国畜牧兽医, 2017, 44(1): 208-213. SONG H Y, WU J, ZOU F C, et al. Mechanism of CRISPR/Cas system and its application in parasitology[J]. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2017, 44(1): 208-213. DOI:10.16431/j.cnki.1671-7236.2017.01.029 (in Chinese) |
| [6] |
CONG L, RAN F A, COX D, et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems[J]. Science, 2013, 339(6121): 819-823. DOI:10.1126/science.1231143 |
| [7] |
MALI P, YANG L, ESVELT K M, et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9[J]. Science, 2013, 339(6121): 823-826. DOI:10.1126/science.1232033 |
| [8] |
SIDIK S M, HUET D, GANESAN S M, et al. A Genome-wide CRISPR screen in Toxoplasma identifies essential apicomplexan genes[J]. Cell, 2016, 166(6): 1423-1435. e12. DOI:10.1016/j.cell.2016.08.019 |
| [9] |
SUAREZ C E, BISHOP R P, ALZAN H F, et al. Advances in the application of genetic manipulation methods to apicomplexan parasites[J]. Int J Parasitol, 2017, 47(12): 701-710. DOI:10.1016/j.ijpara.2017.08.002 |
| [10] |
SOARES MEDEIROS L C, SOUTH L, PENG D, et al. Rapid, selection-free, high-efficiency genome editing in protozoan parasites using CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins[J]. mBio, 2017, 8(6): e01788-17. |
| [11] |
LU H Y, BUCK G A. Expression of an exogenous gene in Trypanosoma cruzi epimastigotes[J]. Mol Biochem Parasitol, 1991, 44(1): 109-114. DOI:10.1016/0166-6851(91)90226-V |
| [12] |
HARIHARAN S, AJIOKA J, SWINDLE J. Stable transformation of Trypanosoma cruzi: inactivation of the PUB12. 5 polyubiquitin gene by targeted gene disruption[J]. Mol Biochem Parasitol, 1993, 57(1): 15-30. DOI:10.1016/0166-6851(93)90240-X |
| [13] |
OTSU K, DONELSON J E, KIRCHHOFF L V. Interruption of a Trypanosoma cruzi gene encoding a protein containing 14-amino acid repeats by targeted insertion of the neomycin phosphotransferase gene[J]. Mol Biochem Parasitol, 1993, 57(2): 317-330. DOI:10.1016/0166-6851(93)90207-E |
| [14] |
UPTON S J, TILLEY M, BRILLHART D B. Comparative development of Cryptosporidium parvum (Apicomplexa) in 11 continuous host cell lines[J]. FEMS Microbiol Lett, 1994, 118(3): 233-236. DOI:10.1111/j.1574-6968.1994.tb06833.x |
| [15] |
VAN DIJK M R, WATERS A P, JANSE C J. Stable transfection of malaria parasite blood stages[J]. Science, 1995, 268(5215): 1358-1362. DOI:10.1126/science.7761856 |
| [16] |
WU Y, SIFRI C D, LEI H H, et al. Transfection of Plasmodium falciparum within human red blood cells[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1995, 92(4): 973-977. DOI:10.1073/pnas.92.4.973 |
| [17] |
SHEN B, BROWN K M, LEE T D, et al. Efficient gene disruption in diverse strains of Toxoplasma gondii using CRISPR/CAS9[J]. mBio, 2014, 5(3): e01114-14. |
| [18] |
ZHANG W W, MATLASHEWSKI G. CRISPR-Cas9-mediated genome editing in Leishmania donovani[J]. mBio, 2015, 6(4): e00861. |
| [19] |
HU D D, TANG X M, BEN MAMOUN C, et al. Efficient single-gene and gene family editing in the apicomplexan parasite Eimeria tenella using CRISPR-Cas9[J]. Front Bioeng Biotechnol, 2020, 8: 128. DOI:10.3389/fbioe.2020.00128 |
| [20] |
BROWN K M, LONG S J, SIBLEY L D. Conditional knockdown of proteins using auxin-inducible degron (AID) fusions in Toxoplasma gondii[J]. Bio Protoc, 2018, 8(4): e2728. |
| [21] |
BRYANT J M, BAUMGARTEN S, DINGLI F, et al. Exploring the virulence gene interactome with CRISPR/dCas9 in the human malaria parasite[J]. Mol Syst Biol, 2020, 16(8): e9569. |
| [22] |
XIAO B, YIN S G, HU Y, et al. Epigenetic editing by CRISPR/dCas9 in Plasmodium falciparum[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2019, 116(1): 255-260. DOI:10.1073/pnas.1813542116 |
| [23] |
WAGNER J C, PLATT R J, GOLDFLESS S J, et al. Efficient CRISPR-Cas9-mediated genome editing in Plasmodium falciparum[J]. Nat Methods, 2014, 11(9): 915-918. DOI:10.1038/nmeth.3063 |
| [24] |
GHORBAL M, GORMAN M, MACPHERSON C R, et al. Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system[J]. Nat Biotechnol, 2014, 32(8): 819-821. DOI:10.1038/nbt.2925 |
| [25] |
NACER A, CLAES A, ROBERTS A, et al. Discovery of a novel and conserved Plasmodium falciparum exported protein that is important for adhesion of PfEMP1 at the surface of infected erythrocytes[J]. Cell Microbiol, 2015, 17(8): 1205-1216. DOI:10.1111/cmi.12430 |
| [26] |
MOGOLLON C M, VAN PUL F J A, IMAI T, et al. Rapid generation of marker-free P. falciparum fluorescent reporter lines using modified CRISPR/Cas9 constructs and selection protocol[J]. PLoS One, 2016, 11(12): e0168362. DOI:10.1371/journal.pone.0168362 |
| [27] |
BRYANT J M, REGNAULT C, SCHEIDIG-BENATAR C, et al. CRISPR/Cas9 genome editing reveals that the intron is not essential for var2csa gene activation or silencing in Plasmodium falciparum[J]. mBio, 2017(8): e00729-17. |
| [28] |
MOHRING F, HART M N, RAWLINSON T A, et al. Rapid and iterative genome editing in the malaria parasite Plasmodium knowlesi provides new tools for P. vivax research[J]. Elife, 2019, 8: e45829. DOI:10.7554/eLife.45829 |
| [29] |
BOLTRYK S D, PASSECKER A, ALDER A, et al. CRISPR/Cas9-engineered inducible gametocyte producer lines as a valuable tool for Plasmodium falciparum malaria transmission research[J]. Nat Commun, 2021, 12(1): 4806. DOI:10.1038/s41467-021-24954-4 |
| [30] |
SHEN B, BROWN K, LONG S J, et al. Development of CRISPR/Cas9 for efficient genome editing in Toxoplasma gondii[J]. Methods Mol Biol, 2017, 1498: 79-103. |
| [31] |
LONG S, BROWN K M, DREWRY L L, et al. Calmodulin-like proteins localized to the conoid regulate motility and cell invasion by Toxoplasma gondii[J]. PLoS Pathog, 2017, 13(5): e1006379. DOI:10.1371/journal.ppat.1006379 |
| [32] |
BROWN K M, LONG S J, SIBLEY L D. Plasma membrane association by N-acylation governs PKG function in Toxoplasma gondii[J]. mBio, 2017, 8(3): e00375-17. |
| [33] |
SIDIK S M, HACKETT C G, TRAN F, et al. Efficient genome engineering of Toxoplasma gondii using CRISPR/Cas9[J]. PLoS One, 2014, 9(6): e100450. DOI:10.1371/journal.pone.0100450 |
| [34] |
MARKUS B M, BELL G W, LORENZI H A, et al. Optimizing systems for Cas9 expression in Toxoplasma gondii[J]. mSphere, 2019, 4(3): e00386-19. |
| [35] |
WANG Y F, SANGARÉ L O, PAREDES-SANTOS T C, et al. Genome-wide screens identify Toxoplasma gondii determinants of parasite fitness in IFNγ-activated murine macrophages[J]. Nat Commun, 2020, 11(1): 5258. DOI:10.1038/s41467-020-18991-8 |
| [36] |
HARDING C R, SIDIK S M, PETROVA B, et al. Genetic screens reveal a central role for heme metabolism in artemisinin susceptibility[J]. Nat Commun, 2020, 11(1): 4813. DOI:10.1038/s41467-020-18624-0 |
| [37] |
YOUNG J, DOMINICUS C, WAGENER J, et al. A CRISPR platform for targeted in vivo screens identifies Toxoplasma gondii virulence factors in mice[J]. Nat Commun, 2019, 10(1): 3963. DOI:10.1038/s41467-019-11855-w |
| [38] |
DELGADO I L S, TAVARES A, FRANCISCO S, et al. Characterization of a MOB1 homolog in the apicomplexan parasite Toxoplasma gondii[J]. Biology (Basel), 2021, 10(12): 1233. |
| [39] |
王沛, 王萌, 李婷婷, 等. 弓形虫4个假定蛋白基因缺失株的构建及其基本生物功能学研究[J]. 畜牧兽医学报, 2022, 53(10): 3598-3608. WANG P, WANG M, LI T T, et al. Generation and basic functional characterization of four hypothetical protein genes deletion strains of Toxoplasma gondii[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2022, 53(10): 3598-3608. (in Chinese) |
| [40] |
LIANG Q L, NIE L B, LI T T, et al. Functional characterization of 17 protein serine/threonine phosphatases in Toxoplasma gondii using CRISPR-Cas9 system[J]. Front Cell Dev Biol, 2022, 9: 738794. DOI:10.3389/fcell.2021.738794 |
| [41] |
LIU J, LI T T, LIANG Q L, et al. Characterization of functions in parasite growth and virulence of four Toxoplasma gondii genes involved in lipid synthesis by CRISPR-Cas9 system[J]. Parasitol Res, 2021, 120(11): 3749-3759. DOI:10.1007/s00436-021-07308-3 |
| [42] |
XU L Q, YAO L J, JIANG D, et al. A uracil auxotroph Toxoplasma gondii exerting immunomodulation to inhibit breast cancer growth and metastasis[J]. Parasit Vectors, 2021, 14(1): 601. DOI:10.1186/s13071-021-05032-6 |
| [43] |
CHEN Y, LIU Q, XUE J X, et al. Genome-wide CRISPR/Cas9 screen identifies new genes critical for defense against oxidant stress in Toxoplasma gondii[J]. Front Microbiol, 2021, 12: 670705. DOI:10.3389/fmicb.2021.670705 |
| [44] |
THEISEN D J, DAVIDSON J T, BRISE?O C G, et al. WDFY4 is required for cross-presentation in response to viral and tumor antigens[J]. Science, 2018, 362(6415): 694-699. DOI:10.1126/science.aat5030 |
| [45] |
XU X P, ELSHEIKHA H M, LIU W G, et al. The role of type Ⅱ fatty acid synthesis enzymes FabZ, ODSCI, and ODSCⅡ in the pathogenesis of Toxoplasma gondii infection[J]. Front Microbiol, 2021, 12: 703059. DOI:10.3389/fmicb.2021.703059 |
| [46] |
ROSENBERG A, LUTH M R, WINZELER E A, et al. Evolution of resistance in vitro reveals mechanisms of artemisinin activity in Toxoplasma gondii[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2019, 116(52): 26881-26891. DOI:10.1073/pnas.1914732116 |
| [47] |
RAMAKRISHNAN C, MAIER S, WALKER R A, et al. An experimental genetically attenuated live vaccine to prevent transmission of Toxoplasma gondii by cats[J]. Sci Rep, 2019, 9(1): 1474. DOI:10.1038/s41598-018-37671-8 |
| [48] |
MARKUS B M, BOYDSTON E A, LOURIDO S. CRISPR-mediated transcriptional repression in Toxoplasma gondii[J]. mSphere, 2021, 6(5): e0047421. DOI:10.1128/mSphere.00474-21 |
| [49] |
PENG D, KURUP S P, YAO P Y, et al. CRISPR-Cas9-mediated single-gene and gene family disruption in Trypanosoma cruzi[J]. mBio, 2015, 6(1): e02097-14. |
| [50] |
CRUZ A, BEVERLEY S M. Gene replacement in parasitic protozoa[J]. Nature, 1990, 348(6297): 171-173. DOI:10.1038/348171a0 |
| [51] |
SOLLELIS L, GHORBAL M, MACPHERSON C R, et al. First efficient CRISPR-Cas9-mediated genome editing in Leishmania parasites[J]. Cell Microbiol, 2015, 17(10): 1405-1412. DOI:10.1111/cmi.12456 |
| [52] |
LI W, ZHANG N, LIANG X Y, et al. Transient transfection of Cryptosporidium parvum using green fluorescent protein (GFP) as a marker[J]. Mol Biochem Parasitol, 2009, 168(2): 143-148. DOI:10.1016/j.molbiopara.2009.07.003 |
| [53] |
VINAYAK S, PAWLOWIC M C, SATERIALE A, et al. Genetic modification of the diarrhoeal pathogen Cryptosporidium parvum[J]. Nature, 2015, 523(7561): 477-480. DOI:10.1038/nature14651 |
| [54] |
KELLEHER M, TOMLEY F M. Transient expression of β-galactosidase in differentiating sporozoites of Eimeria tenella[J]. Mol Biochem Parasitol, 1998, 97(1-2): 21-31. DOI:10.1016/S0166-6851(98)00128-5 |
| [55] |
HAO L L, LIU X Y, ZHOU X Y, et al. Transient transfection of Eimeria tenella using yellow or red fluorescent protein as a marker[J]. Mol Biochem Parasitol, 2007, 153(2): 213-215. DOI:10.1016/j.molbiopara.2007.02.005 |
| [56] |
YAN W C, LIU X Y, SHI T Y, et al. Stable transfection of Eimeria tenella: constitutive expression of the YFP-YFP molecule throughout the life cycle[J]. Int J Parasitol, 2009, 39(1): 109-117. DOI:10.1016/j.ijpara.2008.06.013 |
| [57] |
TANG X M, SUO J X, LIANG L, et al. Genetic modification of the protozoan Eimeria tenella using the CRISPR/Cas9 system[J]. Vet Res, 2020, 51(1): 41. DOI:10.1186/s13567-020-00766-0 |
| [58] |
SUAREZ C E, MCELWAIN T F. Transient transfection of purified Babesia bovis merozoites[J]. Exp Parasitol, 2008, 118(4): 498-504. DOI:10.1016/j.exppara.2007.10.013 |
| [59] |
SUAREZ C E, MCELWAIN T F. Stable expression of a GFP-BSD fusion protein in Babesia bovis merozoites[J]. Int J Parasitol, 2009, 39(3): 289-297. DOI:10.1016/j.ijpara.2008.08.006 |
| [60] |
HAKIMI H, ISHIZAKI T, KEGAWA Y, et al. Genome editing of Babesia bovis using the CRISPR/Cas9 system[J]. mSphere, 2019, 4(3): e00109-19. |
| [61] |
HOWE D K, MERCIER C, MESSINA M, et al. Expression of Toxoplasma gondii genes in the closely-related apicomplexan parasite Neospora caninum[J]. Mol Biochem Parasitol, 1997, 86(1): 29-36. DOI:10.1016/S0166-6851(97)90003-7 |
| [62] |
BECKERS C J M, WAKEFIELD T, JOINER K A. The expression of Toxoplasma proteins in Neospora caninum and the identification of a gene encoding a novel rhoptry protein[J]. Mol Biochem Parasitol, 1997, 89(2): 209-223. DOI:10.1016/S0166-6851(97)00120-5 |
| [63] |
ARRANZ-SOLÍS D, REGIDOR-CERRILLO J, LOURIDO S, et al. Toxoplasma CRISPR/Cas9 constructs are functional for gene disruption in Neospora caninum[J]. Int J Parasitol, 2018, 48(8): 597-600. DOI:10.1016/j.ijpara.2018.03.002 |
| [64] |
CHENG P P, ZHANG Z H, YANG F Y, et al. FnCas12a/crRNA-mediated genome editing in Eimeria tenella[J]. Front Genet, 2021, 12: 738746. DOI:10.3389/fgene.2021.738746 |
| [65] |
MOHSIN M, LI Y G, ZHANG X, et al. Development of CRISPR-CAS9 based RNA drugs against Eimeria tenella infection[J]. Genomics, 2021, 113(6): 4126-4135. DOI:10.1016/j.ygeno.2021.10.019 |
| [66] |
LANDER N, LI Z H, NIYOGI S, et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of paraflagellar rod protein 1 and 2 genes in Trypanosoma cruzi reveals their role in flagellar attachment[J]. mBio, 2015, 6(4): e01012. |
| [67] |
BENEKE T, MADDEN R, MAKIN L, et al. A CRISPR Cas9 high-throughput genome editing toolkit for kinetoplastids[J]. R Soc Open Sci, 2017, 4(5): 170095. DOI:10.1098/rsos.170095 |
| [68] |
BENEKE T, DEMAY F, HOOKWAY E, et al. Genetic dissection of a Leishmania flagellar proteome demonstrates requirement for directional motility in sand fly infections[J]. PLoS Pathog, 2019, 15(6): e1007828. DOI:10.1371/journal.ppat.1007828 |
| [69] |
CHIURILLO M A, LANDER N. The long and winding road of reverse genetics in Trypanosoma cruzi[J]. Microb Cell, 2021, 8(9): 203-207. DOI:10.15698/mic2021.09.758 |
| [70] |
ZHANG W W, LYPACZEWSKI P, MATLASHEWSKI G. Optimized CRISPR-Cas9 genome editing for Leishmania and its use to target a multigene family, induce chromosomal translocation, and study DNA break repair mechanisms[J]. mSphere, 2017, 2(1): e00340-16. |
| [71] |
SHRIVASTAVA R, TUPPERWAR N, DRORY-RETWITZER M, et al. Deletion of a single LeishIF4E-3 allele by the CRISPR-Cas9 system alters cell morphology and infectivity of Leishmania[J]. mSphere, 2019, 4(5): e00450-19. |
| [72] |
BAKER N, CATTA-PRETA C M C, NEISH R, et al. Systematic functional analysis of Leishmania protein kinases identifies regulators of differentiation or survival[J]. Nat Commun, 2021, 12(1): 1244. DOI:10.1038/s41467-021-21360-8 |
| [73] |
PAWLOWIC M C, VINAYAK S, SATERIALE A, et al. Generating and maintaining transgenic Cryptosporidium parvum parasites[J]. Curr Protoc Microbiol, 2017, 46: 20B.2.1-20B.2.32. |
| [74] |
VINAYAK S, JUMANI R S, MILLER P, et al. Bicyclic azetidines kill the diarrheal pathogen Cryptosporidium in mice by inhibiting parasite phenylalanyl-tRNA synthetase[J]. Sci Transl Med, 2020, 12(563): eaba8412. DOI:10.1126/scitranslmed.aba8412 |
| [75] |
CHOUDHARY H H, NAVA M G, GARTLAN B E, et al. A conditional protein degradation system to study essential gene function in Cryptosporidium parvum[J]. mBio, 2020, 11(4): e01231-20. |
| [76] |
XU R, FENG Y Y, XIAO L H, et al. Insulinase-like protease 1 contributes to macrogamont formation in Cryptosporidium parvum[J]. mBio, 2021, 12(2): e03405-20. |
| [77] |
HASAN M M, STEBBINS E E, CHOY R K M, et al. Spontaneous selection of Cryptosporidium drug resistance in a calf model of infection[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2021, 65(6): e00023-21. |
| [78] |
NISHIKAWA Y, SHIMODA N, FEREIG R M, et al. Neospora caninum dense granule protein 7 regulates the pathogenesis of Neosporosis by modulating host immune response[J]. Appl Environ Microbiol, 2018, 84(18): e01350-18. |
| [79] |
MINEO T W P, CHERN J H, THIND A C, et al. Efficient gene knockout and knockdown systems in Neospora caninum enable rapid discovery and functional assessment of novel proteins[J]. mSphere, 2022, 7(1): e0089621. DOI:10.1128/msphere.00896-21 |
(编辑 白永平)