2. 宁夏大学生命科学学院, 银川 750021;
3. 宁夏医科大学总医院, 银川 750004
2. School of Life Sciences, Yinchuan 750021, China;
3. General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China
结核病(tuberculosis, TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)感染所引起的慢性消耗性传染病，属于典型的人兽共患传染病。根据世界卫生组织全球结核病报告，2020年，全球新发结核病例990万，死亡病例128万。其中，艾滋病毒阳性人群中的结核病死亡人数为21.4万[1]。除人以外，已发现50种哺乳动物和25种禽类可感染结核病，它们的流行不仅给畜牧业造成经济损失，而且严重威胁人们健康，从而成为终止结核病流行，消除结核病危害的障碍和挑战[2]。结核分枝杆菌属于胞内致病菌，对其感染机制的研究将为结核病的预防及治疗提供重要助力。巨噬细胞作为抵御病原体感染的第一道防线，其会主动吞噬Mtb并在内部与其发生复杂的斗争[3-4]。但同时，Mtb具有很强的抵抗力，其通过调节宿主细胞死亡的方式和时间来劫持巨噬细胞，从而诱导巨噬细胞坏死来逃避宿主免疫，导致宿主细胞死亡和细菌增殖的不断循环，以促进疾病发展[5-6]。因此，了解Mtb如何与宿主巨噬细胞相互作用来调控细胞死亡模式至关重要。
最新研究发现，长链非编码RNA(long noncoding RNA, LncRNA)是一类长度超过200个核苷酸且缺乏蛋白质编码能力的转录本，其表达水平失调与结核分枝杆菌的感染机制及细胞命运调控密切相关[7]。如LncRNA NEAT1在结核病患者血清中高表达，并且其通过靶向调控miR-377-3p促进Mtb感染巨噬细胞的炎症反应[8]。由于LncRNA与microRNAs (miRNAs)对结核分枝杆菌感染的调控功能及在细胞或组织中的差异表达，因此它们已被提议作为结核病的潜在生物标志物[9]。本项目组前期对巨噬细胞LncRNA表达谱及转录谱等进行分析发现，LncRNA NR_003508是与坏死相关的LncRNAs分子之一，有关其如何调控Mtb诱导巨噬细胞坏死的研究尚未见报道[10]。并且生物信息学数据库预测显示LncRNA NR_003508与miR-483-3p之间存在结合位点。据研究报道，miR-483-3p是miR-483家族中的一员，位于胰岛素样生长因子受体基因(IGF)2的内含子中，参与调控多种生物学过程，包括细胞迁移、增殖和凋亡以及促进炎性细胞因子的分泌[11-13]。然而，miR-483-3p在细胞坏死中的确切作用仍然未知。在细胞坏死通路中，混合谱系激酶结构域样蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein, MLKL)发挥关键作用，其被受体相互作用蛋白激酶3(RIPK3)所激活，并形成寡聚体易位至细胞膜改变膜通透性，最终导致膜破裂来介导细胞坏死[14-15]。
综上所述，Mtb感染后，可通过诱导细胞内某些因子的表达来促进细胞发生坏死，从而逃避巨噬细胞的杀伤作用。然而，在结核分枝杆菌感染过程中，LncRNA NR_003508作为长链非编码RNA中的一员对巨噬细胞坏死的调控作用尚未阐明。因此，本研究采用牛分枝杆菌疫苗株卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin, BCG)感染小鼠巨噬细胞RAW264.7发生坏死，通过siRNA技术干扰LncRNA NR_003508的表达，并利用Western blot、免疫荧光和流式细胞仪等技术，检测坏死关键蛋白MLKL的表达水平和细胞坏死率，从而明确LncRNA NR_003508对BCG诱导的巨噬细胞RAW264.7坏死的调控作用，并探讨其分子机制。上述研究有助于阐明Mtb与巨噬细胞之间的相互作用并为结核病的诊断或治疗提供新的靶点，从而对畜禽结核病的流行、临床诊断和防控具有深远意义。
1 材料与方法 1.1 主要试剂与抗体DMEM培养基购自Gibco公司，胎牛血清与磷酸盐缓冲溶液(PBS)购自BI公司，胰酶购自北京索莱宝科技有限公司，Annexin V-FITC/PI试剂盒和Middlebrook 7H9肉汤培养基购自BD公司；OADC增菌剂购自青岛海博公司，全蛋白提取试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；蛋白定量(BCA)试剂盒与蛋白Marker购自美国Thermo Fisher公司，Tris甘氨酸-SDS电泳缓冲液购自上海百赛生物技术股份有限公司，Western Lighting Plus ECL试剂盒购自美国PerkinElmer公司，双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，兔抗鼠GAPDH单克隆抗体(货号60008-1-Ig)购自美国Proteintech公司，兔抗鼠MLKL单克隆抗体(货号A13451)购自武汉爱博泰克(ABclonal)生物科技有限公司。
1.2 细胞培养RAW264.7细胞购自中国科学院上海细胞研究所，培养步骤：当细胞培养密度达90 %时，吸去培养液，加入胰酶消化2 min，1 000 r·min－1离心5 min；离心结束后，吸去上清，加入培养液重悬细胞，根据细胞数量进行传代，于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中继续培养。
1.3 BCG培养及感染牛分枝杆菌疫苗株卡介苗(BCG)购自上海生物制品研究所；培养步骤：采用Middlebrook 7H9培养基对BCG进行培养，随后BCG培养斜面上挑取菌落，接种于培养液中，在37 ℃培养箱中培养，待BCG培养至合适浓度(OD600 nm=1.5)后进行传代操作。利用不同感染复数(multiple of infection, MOI)的BCG，感染RAW264.7细胞，建立结核分枝杆菌与小鼠巨噬细胞系互作模型，其中，MOI=10表示细胞与细菌之比为1∶10。
1.4 LncRNA NR_003508小干扰RNA和miR-483-3p过表达的构建根据LncRNA NR_003508序列设计合成小干扰RNA，序列：Sense 5′-ACACUGCUAGAAAU-AAAUUTT-3′，Antisense 5′-AAUUUAUUUCUAGCAGUGUGC-3′，并设计合成Negative control (NC)，序列：Sense 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，Antisense 5′-ACGUGACACG-UUCGGAGAATT-3′。根据miR-483-3p序列：5′-UCACUCCUCCCCUCCCGUCUU-3′，设计合成mimics: Sense 5′-UCACUCCUCCCCUCCCGUCUU-3′，Antisense 5′-GACGGGAGGGGAGGAGU-GAUU-3′。小干扰RNA和mimics购自上海吉玛制药技术有限公司。
1.5 细胞转染及分组取生长至对数期的RAW264.7细胞以1×106个·孔－1接种到六孔培养板中；贴壁后进行转染操作，分别构建阴性对照组(NC)、BCG感染组(BCG)、siRNA-NR_003508组和siRNA-NR_003508结合BCG感染组；转染按照ZETA试剂说明书进行，每孔加入转染试剂7~10 μL，20 μmol·L－1 siRNA或mimics 3~5 μL，24 h后观察荧光强度以确定转染比例。过表达miR-483-3p的构建分组：阴性对照组(NC)、BCG感染组(BCG)、miR-483-3p mimics组和miR-483-3p mimics结合BCG感染组。
1.6 双荧光素酶报告基因的构建和检测应用RegRNA 2.0 (http://regrna2.mbc.nctu.edu.tw/detection.html)、TargetScan (http://www.targetscan.org)和miRBase (http://www.mirbase.org/search.shtml)3个数据库在线预测LncRNA NR_003508与miR-483-3p的结合靶点。利用pmirGLO质粒(Promega, Madison, WI, USA) 将LncRNA NR_003508包括预测结合位点的序列(5′-GCUGAAUGAGGGAGAGGAGUGG-3′)克隆到pmirGLO-LncRNA NR_003508-WT，同时构建靶位点突变(5′-GCUGAAUGAGGGACUCCUCACG-3′)序列的pmirGLO-LncRNA NR_003508-MUT报告质粒，将两种重组质粒分别与miR-483-3p mimics和阴性对照(mimics NC)共转染至293T细胞中，24 h后收集细胞，采用双荧光素酶报告基因分析系统(Promega)进行分析，酶标仪检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的反应强度并计算两者比值来反映细胞内荧光素酶活性。
1.7 Western blot检测取生长状态良好的RAW264.7细胞以1×106个·孔－1接种于6孔板培养皿中，按试验设计处理后，按全蛋白提取试剂盒提取蛋白，并用BCA法试剂盒检测蛋白浓度。根据需要测定的蛋白大小调整分离胶的浓度，将各组蛋白按30 μg定量上样并进行SDS-PAGE凝胶电泳后，用湿转法将蛋白样品从胶转至PVDF膜，5%脱脂奶粉37 ℃封闭1 h，加入MLKL(1∶1 000稀释)和GAPDH(1∶2 000稀释)蛋白抗体，4 ℃过夜孵育，TBST洗涤6 min×5次，加入相应的二抗，室温孵育1 h，TBST洗涤6 min×5次，使用化学发光液(ECL发光)检测蛋白条带并通过GE化学发光检测仪进行曝光。结果用ImageJ软件分析各组条带的灰度值。
1.8 免疫荧光检测提前将20 mm盖玻片置入12孔板中，每孔接种5×104个细胞，贴壁后按照试验组设计处理细胞。制片步骤：用4%固定液固定20 min，加入0.5% TritonX-100室温通透30 min，3% BSA室温封闭1 h后，37 ℃孵育一抗(用3%BSA按照1∶200比例稀释MLKL抗体)2 h，37 ℃孵育二抗(用PBS稀释)，最后用含有DAPI的封片剂封片。激光共聚焦显微镜观察MLKL的荧光表达并拍照。
1.9 实时荧光定量聚合酶链反应使用TRlzol试剂(Thermo Fisher Scientific，Inc)提取各处理组的总RNA，微量分光光度计检验RNA质量。使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo ScientificTM)将RNA合成cDNA。通过使用QuantStudioTM5 System实时荧光定量PCR系统和SYBR&Green Reagents (TaKaRa Bio)进行qRT-PCR。各样本中LncRNA NR_003508和MLKL的相对转录量以β-actin为内参，miR-483-3p以U6为内参：以2－ΔΔCt计算LncRNA NR_003508、miR-483-3p和MLKL表达的相对定量。具体引物序列见表 1。qRT-PCR反应体系：TB Green Premix Ex Taq (2×) 10 μL，cDNA模板2 μL，上、下游引物(10 μmol·L－1)各0.8 μL，Rox Reference Dye Ⅱ(50×) 0.4 μL，Nuclease-free water 6 μL，共20 μL。反应条件：①预变性95 ℃ 30 s；②95 ℃ 5 s；60 ℃ 30 s、40个循环，运行程序。
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表 1 引物名称和序列 Table 1 Name and sequence of the primers |
取生长状态良好RAW264.7细胞以1×106个接种于6孔板，按试验设计处理后，用Annexin V-FITC/PI试剂盒检测细胞坏死率。除试验组还需设计3个对照组，分别为不染组、Annexin V-FITC单染和PI单染，将各组细胞消化后用预冷的PBS洗涤1遍，1 000 r·min－1离心5 min，弃上清，加入500 μL 1×Binding buffer重悬细胞，各处理组分别加入Annexin V-FITC和PI染色液各5 μL，轻轻混匀，室温，避光染色20 min。上流式细胞仪检测或荧光显微镜观察，细胞坏死率为PI阳性细胞数占总细胞数的百分比。
1.11 统计学分析所有试验数据均重复3次，数据以“均数±标准误(
为了了解BCG感染对巨噬细胞内LncRNA NR_003508的影响，本研究通过qRT-PCR检测BCG感染后LncRNA NR_003508的表达情况，结果如图 1所示，相比于空白对照组，BCG感染显著上调LncRNA NR_003508的表达(P＜0.01)，并且呈时间依赖性表达。结果表明, BCG可以诱导LncRNA NR_003508的高表达。
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A、B. qRT-PCR检测细胞内LncRNA NR_003508的表达。*.P＜0.05，**.P＜0.01 A, B. qRT-PCR was used to detect the expression level of LncRNA NR_003508. *.P < 0.05, **.P < 0.01 图 1 BCG感染对LncRNA NR_003508的影响 Fig. 1 The effect of BCG infection on LncRNA NR_003508 |
为了研究LncRNA NR_003508在BCG感染巨噬细胞过程中的作用，本研究设计并合成LncRNA NR_003508的小干扰RNA，从而检测干扰LncRNA NR_003508对BCG感染的巨噬细胞RAW264.7坏死的影响。利用Western blot检测了各处理组中MLKL的表达情况，结果(图 2A)表明BCG感染后，细胞中MLKL蛋白水平显著增加(P＜0.01)，而干扰LncRNA NR_003508后，细胞中MLKL蛋白水平显著下降(P＜0.01)。同时免疫荧光技术检测结果(图 2B)显示，干扰LncRNA NR_003508显著减弱了BCG感染的巨噬细胞内MLKL荧光(绿色)强度。结果提示干扰LncRNA NR_003508降低了BCG感染的巨噬细胞RAW264.7内MLKL的表达。
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A. Western blot检测细胞内MLKL的表达；B.免疫荧光检测细胞内MLKL的表达，MLKL为绿色，DAPI为蓝色(400×)。**. P＜0.01 A. The expression of MLKL were detected by Western blot. The results were analyzed by Image J; B. Immunofluorescence was used to detect the expression level of MLKL, Green dots represent MLKL protein and blue dots represent nucleus (400×). **. P < 0.01 图 2 干扰LncRNA NR_003508降低MLKL的表达 Fig. 2 Interference with LncRNA NR_003508 reduces the expression of MLKL |
为了进一步研究干扰LncRNA NR_003508在BCG感染后巨噬细胞坏死的影响。本研究利用碘化丙啶荧光染料(PI)对细胞进行染色，用荧光显微镜观察各处理组的细胞坏死情况，结果表明，BCG感染后RAW264.7细胞坏死率与空白对照组相比显著上升(P＜0.01)，但是干扰LncRNA NR_003508结合BCG感染处理组与BCG组相比细胞坏死率显著下降(P＜0.05)，见图 3。上述结果表明，干扰LncRNA NR_003508抑制了BCG感染的巨噬细胞发生坏死，阻止了BCG的进一步扩散。
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A. PI检测细胞坏死，PI为红色，Hoechst为蓝色(100×)；B. PI阳性细胞率。*.P＜0.05, **.P＜0.01 A. PI was used to detect cell necrosis, Red dots represent PI and blue dots represent Hoechst (100×); B. PI positive cells rates. *.P < 0.05, **.P < 0.01 图 3 干扰LncRNA NR_003508抑制BCG感染的细胞坏死 Fig. 3 Interfering with LncRNA NR_003508 inhibits necrosis of BCG-infected cells |
本研究利用生物信息学软件RegRNA 2.0预测发现LncRNA NR_003508与miR-483-3p存在结合位点，见图 4A。通过双荧光素酶报告基因检测结果(图 4B)显示，相比于NC组，miR-483-3p mimic转染能显著下调野生型LncRNA NR_003508-WT质粒组的荧光素酶活性(P＜0.01)，提示LncRNA NR_003508与miR-483-3p之间存在相互作用关系。为进一步验证两者关系，通过qRT-PCR对BCG感染后巨噬细胞内miR-483-3p的含量进行验证，结果(图 4C)表明miR-483-3p的含量显著下降(P＜0.05)。随之，干扰LncRNA NR_003508后miR-483-3p的表达显著增加(P＜0.01) (图 4D)。上述结果表明，在BCG感染巨噬细胞过程中，LncRNA NR_003508通过与miR-483-3p特异性结合而发挥海绵吸附作用。
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A. LncRNA NR_003508与miR-483-3p的结合位点；B. 双荧光素酶报告系统验证LncRNA NR_003508与miR-483-3p的结合位点；C. qRT-PCR检测BCG感染对miR-483-3p表达的影响；D. qRT-PCR检测干扰LncRNA NR_003508对miR-483-3p的影响。*.P＜0.05, **.P＜0.01 A. The binding site of LncRNA NR_003508 and miR-483-3p; B. Verification of the binding site of LncRNA NR_003508 to miR-483-3p by dual luciferase reporter system; C. qRT-PCR detection of the effect of BCG infection on the expression of miR-483-3p;D. qRT-PCR detection the influence of interference LncRNA NR_003508 on miR-483-3p. *.P < 0.05, **.P < 0.01 图 4 LncRNA NR_003508在巨噬细胞中起ceRNA作用海绵吸附miR-483-3p Fig. 4 LncRNA NR_003508 functions as a ceRNA and sponges miR-483-3p in macrophages |
通过生物信息学软件TargetScan发现，miR-483-3p靶向坏死关键基因MLKL(图 5A)，为了解miR-483-3p对MLKL的靶向调控作用，本研究合成miR-483-3p mimics并转染到RAW264.7细胞中，通过qRT-PCR进行检测，结果(图 5B、C)表明过表达miR-483-3p后，显著抑制细胞中MLKL的mRNA水平(P＜0.01)。为进一步研究miR-483-3p对MLKL的靶向调控作用，Western blot检测结果(图 5D)显示，过表达miR-483-3p显著降低了BCG感染的巨噬细胞内MLKL的蛋白水平(P＜0.01)。以上结果表明，miR-483-3p负调控巨噬细胞中MLKL的表达水平。
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A. LncRNA NR_003508与miR-483-3p的结合位点；B. qRT-PCR检测细胞内miR-483-3p的含量；C. qRT-PCR检测过表达miR-483-3p对MLKL mRNA水平的影响；D. Western blot检测细胞内MLKL的表达。*.P＜0.05, **.P＜0.01 A. The binding site of miR-483-3p and MLKL; B. qRT-PCR was used to detect the expression level of miR-483-3p; C. qRT-PCR detects the effect of overexpression of miR-483-3p on the level of MLKL mRNA; D. The expression of MLKL were detected by Western blot. The results were analyzed by Image J. *.P < 0.05, **.P < 0.01 图 5 miR-483-3p负调控MLKL的表达 Fig. 5 miR-483-3p negatively regulates the expression of MLKL |
为了进一步证明miR-483-3p调控BCG感染的细胞坏死，本研究采用Annexin V-FITC/PI染液对细胞进行避光染色，通过流式细胞仪对细胞坏死率进行检测，结果(图 6)显示，与BCG单独感染组相比，过表达miR-483-3p结合BCG感染处理组显著降低了巨噬细胞坏死率(P＜0.01)。结果提示过表达miR-483-3p抑制了BCG诱导的巨噬细胞坏死。
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A. PI检测细胞坏死率；B.细胞坏死率。*.P＜0.05, **.P＜0.01 A. PI was used to detect cell necrosis rates; B. Necrosis rates. *.P < 0.05, **.P < 0.01 图 6 过表达miR-483-3p抑制BCG感染的细胞坏死 Fig. 6 Overexpression of miR-483-3p inhibits BCG-infected cell necrosis |
目前，结核病还是世界上非常严重的公共卫生问题，发病率不断上升，在其发展到中晚期，可造成严重的组织损伤和坏死，直接威胁患者的生命健康。大量研究证实巨噬细胞对结核分枝杆菌(Mtb)感染的影响，但其调控机制尚未完全阐明[16]。巨噬细胞是宿主免疫防御的前哨，Mtb作为一种胞内寄生菌，感染巨噬细胞后会触发一系列信号事件，为了自身利益而劫持宿主的先天免疫途径，影响细胞凋亡、自噬和坏死等过程，而坏死的发生有助于Mtb从巨噬细胞中逃逸，进而扩散感染[17]。过表达的miRNA-1281靶向亲环蛋白-D(CyPD)，保护人类巨噬细胞免受Mtb的侵害诱导程序性坏死和细胞凋亡[18]。因此，坏死发生与否、病菌能否存活是众多调控因子博弈的结果，其间机制繁复，迄今尚不完全明晰。
近年来，随着对LncRNA的深入研究，其已是感染性免疫反应的关键调节剂，并且其作为miRNA的内源竞争RNA(ceRNA)，抑制miRNA的表达来影响miRNA靶基因的调控，从而参与调节巨噬细胞的自噬、凋亡、炎症和坏死等生物学过程[19-22]。此外，LncRNA与miRNAs参与了Mtb与其宿主之间复杂的相互作用，后者决定了感染过程。例如，miR-342-3p通过SOCS6增加炎症细胞因子和趋化因子的产生来调节抗Mtb免疫[23]。miR-483-3p广泛参与调控多种肿瘤的发生发展过程。研究显示，在胰腺癌和直肠癌中可检测到miR-483-3p高表达，并且发挥促癌因子的作用[24-25]。另外，miR-483-3p在重症肺炎患儿血清中高表达，并且其通过靶向IGF-1诱导MRC-5细胞损伤和炎症因子过度释放[26]。本研究发现LncRNA NR_003508与miR-483-3p之间存在结合位点，通过双荧光素酶报告技术证实LncRNA NR_003508与miR-483-3p特异性结合。此外，BCG感染巨噬细胞后会上调LncRNA NR_003508的表达，而降低miR-483-3p的表达，并且敲低LncRNA NR_003508会促进miR-483-3p的表达，表明两者之间存在负相关性。因此，LncRNA NR_003508可以通过与miR-483-3p特异性结合而起到海绵吸附的作用。
MLKL已被证明参与结核分枝杆菌诱导的细胞坏死[27]。据报道，在强毒Mtb (H37Rv)感染巨噬细胞的过程中，敲减MLKL的表达显著减少了H37Rv感染的巨噬细胞坏死。此外，本项目组前期工作已证实BCG可诱导巨噬细胞坏死的发生[29]。在本研究中，利用生物信息学分析显示MLKL是miR-483-3p的靶基因，并且BCG感染显著上调MLKL的表达，而过表达miR-483-3p可降低MLKL的表达水平，结果表明，miR-483-3p可以调节MLKL的翻译。同时，过表达miR-483-3p降低了BCG诱导的细胞坏死率。以上结果显示，miR-483-3p可能通过调节MLKL的表达，从而影响BCG诱导的巨噬细胞坏死。本研究以此尝试从LncRNA-miRNA-mRNA调控网络解释结核分枝杆菌诱导巨噬细胞坏死的作用机制，初步证实了LncRNA NR_003508在BCG感染巨噬细胞中对细胞坏死的调控作用，研究结果将为Mtb致病机制的解读提供新的视角与理论依据。接下来，本研究将对MLKL基因过表达、敲除试验以及动物体内试验验证，以期深入探讨LncRNA NR_003508和miR-483-3p在巨噬细胞坏死中的功能和作用机制。
4 结论BCG感染促进了巨噬细胞内LncRNA NR_003508的表达，并且诱导巨噬细胞坏死。在BCG感染巨噬细胞过程中，LncRNA NR_003508通过海绵吸附miR-483-3p，从而调控MLKL的表达，最终促进巨噬细胞坏死。
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(编辑 孟培)