2. 农业部动物疫病病原生物学重点实验室东北科学观测实验站，哈尔滨 150030
, ZHANG Senhao1, ZHANG Liu1, LI Jiaxuan1,2, WANG Xiaona1,2, CUI Wen1,2, JIANG Yanping1,2, ZHOU Han1,2, WANG Li1,2, QIAO Xinyuan1,2, LI Yijing1,2, TANG Lijie1,2
2. Northeast Scientific Inspection Observation Station, Key Laboratory of Animal Pathogen Biology of Ministry of Agriculture, Harbin 150030, China
禽白血病病毒[avian leukemia (leukosis) virus，ALV]隶属反转录病毒科、α反转录病毒属成员，其基因组为单股、正链、线性RNA的二聚体，具有经典的C型反转录病毒基因组结构(5′LTR-5′UTR-gag-pol-env-3′UTR-3′LTR)，可引起禽类的多种肿瘤性疾病[1]。目前，根据宿主感染范围、中和抗体交叉反应和gp85基因同源性比对等方法[2]，可将ALV分为11个亚群(A-K)。其中，外源性病毒包含A、B、C、D、J和K亚群，均可自然感染鸡群；而内源性病毒主要有E、F、G、H和I亚群，除E亚群分离于鸡外，其余亚群多见于野生鸟类[3]。感染ALV后的鸡，一方面表现为直接发病，病鸡体表或内脏出现肿瘤，最终导致死亡；另一方面还会出现发育迟缓，免疫力低下，产蛋率降低等亚临床症状，并易受到外界各种病原体的侵害，增加混合感染的概率[4]，给我国养鸡业造成了巨大的经济损失。
近年来，随着ALV多个亚群混合感染情况在各地鸡群中不断出现，加上RNA病毒本身具有遗传多样性的特点，以致ALV基因组极易发生变异或重组，并使病毒有效逃避宿主防御机制、扩大感染宿主的范围并表现出更为复杂的致病特征[5-6]。例如，Li等[7]在江苏某鸡场分离出1株由ALV-K gp85基因、ALV-E gp37基因和ALV-J LTR基因组成的JS15SG01株，感染该毒株的SPF鸡表现出严重的病毒血症现象且病毒脱落能力也显著增强，并伴有明显的嗜神经症状，给ALV的防控带来新的挑战。因此，ALV的分离鉴定及基因组序列分析对于了解该病毒的致病机制、遗传进化状况以及制定ALV有效防控措施至关重要。本研究从RT-PCR检测为ALV阳性的病死鸡组织样品中分离、鉴定到1株E亚群禽白血病病毒，命名为HLJE2020，通过对其全基因组序列进行分析，分析其遗传演变趋势，为黑龙江地区禽白血病病毒的净化提供参考和依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料1.1.1 样本与细胞 2020年8月，黑龙江省某鸡场的海兰白病死鸡，无明显临床症状。取病死鸡的心、肝、肺、肾和法氏囊，各组织眼观无异常。原代鸡胚成纤维细胞(CEF)由SPF级鸡胚制备，DF-1细胞系、大肠杆菌DH5α感受态细胞和BL21(DE3)感受态细胞均由东北农业大学兽医微生物与免疫学实验室保存。
1.1.2 主要试剂 禽白血病病毒ELISA抗原检测试剂盒购自哈尔滨国生生物科技股份有限公司；ExTaq DNA聚合酶、反转录酶RRI和RT-ace、Oligo(dT)18 Primer、DL2000 DNA Marker、pMD-19T(Simple)质粒等购自大连宝生物工程公司；ALV P27单克隆抗体由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所惠赠；山羊抗小鼠FITC-IgG购自Sigma公司。
1.2 样本的检测将采集的心、肝、肺、肾和法氏囊进行研磨处理，采用TRIzol法提取RNA并反转录为cDNA，同时使用DNA提取试剂盒提取DNA，利用参考文献中的禽白血病病毒(ALV)、禽网状内皮组织增生症病毒(REV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)、禽呼肠孤病毒(ARV)、马立克病毒(MDV)、传染性贫血病病毒(CAV)和传染性喉气管炎病毒(ILTV)的特异性引物[8-16]进行PCR检测(表 1)，引物均由吉林吉林省库美生物科技公司合成。
|
表 1 鸡常见传染性病毒的检测引物 Table 1 Primers for detection of common infectious viruses in chicken |
使用液氮将检测为ALV阳性的组织研磨至粉状，依照1∶5的比例加入灭菌PBS，置于－80 ℃反复冻融3次后，4 ℃ 12 000 r·min－1离心10 min，收集上清液并过滤一次后接种于生长密度达70% CEF和DF-1细胞中，吸附作用3 h，补加维持液培养7 d后反复冻融2次，收集上清液，按照上述方法盲传3代，病毒液于－80 ℃保存。
1.4 病毒的鉴定1.4.1 病毒亚群的鉴定 取P3代CEF细胞和DF-1细胞上清液提取RNA，采用参考文献中ALV-A-E、ALV-J和ALV-K的引物[17-18]进行RT-PCR扩增(表 2)，从而进行ALV亚群的鉴定。
|
|
表 2 ALV亚群鉴定引物 Table 2 ALV subgroup identification primer |
1.4.2 病毒的间接免疫荧光(IFA)鉴定 以ALV P27单克隆抗体(1∶100稀释)为一抗，山羊抗小鼠FITC-IgG(1∶100稀释)为二抗，利用间接免疫荧光试验(IFA)检测CEF细胞中病毒增殖情况，并设立未感染的CEF细胞为阴性对照。
1.4.3 病毒的形态学鉴定 取细胞病毒液200 mL，4 ℃ 6 000 r·min－1离心20 min，再取上清，用超速离心机4 ℃ 35 000 r·min－1高速离心2 h后，弃上清，用100 μL灭菌的去离子水重悬沉淀。吸取25 μL滴于铜网上作用15 min，用2%磷钨酸负染色1 min 30 s，自然晾干，置于透射电子显微镜观察。
1.4.4 病毒传代的鉴定 收集P3至P11代细胞病毒液，依照禽白血病病毒抗原ELISA检测试剂盒说明书步骤进行ALV P27抗原检测，同时提取P3至P11代细胞病毒液RNA，使用ALV A-E鉴定引物进行RT-PCR检测，利用以上两种方法检测病毒传代稳定性。
1.5 病毒全基因组的测定1.5.1 病毒全基因组序列扩增与测序鉴定 参照GenBank中ALV-E参考毒株ev-1株(GenBank登录号：AY013303)全基因组序列，分段设计并合成用于扩增分离株全基因组序列引物(表 3)。提取细胞培养上清液RNA进行RT-PCR扩增，PCR产物经1% 琼脂糖凝胶电泳，胶回收目的片段与pMD-19T(Simple)载体进行连接、转化，挑选菌株提取质粒后进行PCR鉴定，鉴定结果为阳性的质粒送吉林省库美生物科技公司测序。
|
|
表 3 ALV-E全基因组序列扩增引物 Table 3 Amplification primer of ALV-E whole genome sequence |
1.5.2 病毒全基因组序列分析 应用DNAStar Lasergen 7.0软件对测序后各片段序列进行剪切、拼接和同源性比较；利用MEGA 7.0软件对分离株的env、gp85和LTR基因序列进行遗传进化分析；利用RDPv.4(Recombination Detection Program 4)软件[19]中7种重组检测算法(RDP、GENECONV、BootScan、Max Chi、Chimaera、SiScan、3Seq) 对分离株gp85基因进行潜在重组分析。之后利用SimPlot(v3.5.1)软件验证分离株gp85基因中是否存在重组情况。用于序列比对分析的28株ALV各亚群参考毒株(国内外最初和近些年最新发现且具有代表性的ALV参考毒株)详细信息见表 4。
|
|
表 4 用于序列比对的参考毒株信息 Table 4 Reference strains information for sequence alignment |
以病料提取的RNA为模板，经RT-PCR扩增获得ALV P27基因，结果显示，各组织均在约674 bp处出现特异性条带，与预期结果相符(图 1a)，表明该病料中含有ALV；而病料各组织提取RNA或DNA后，均未扩增到REV、IBDV、IBV、NDV、AIV、ARV、MDV、CAV和ILTV的目的基因(图 1b)。
|
a.病死鸡病料的ALV P27检测；b.病死鸡病料的鸡常见病毒检测；M. DNA相对分子质量标准；1、7.阴性对照；2.心；3.肝；4.肺；5.肾；6.法氏囊；8.禽白血病病毒；9.禽网状内皮组织增生症病毒；10.传染性法氏囊病毒；11.传染性支气管炎病毒；12.新城疫病毒；13.禽流感病毒；14.禽呼肠孤病毒；15.马立克病毒；16.传染性贫血病病毒；17.传染性喉气管炎病毒 a. Detection of ALV P27 in sick materials of dead chickens; b. Detection of common viruses in sick materials of dead chickens; M. DL2000 DNA marker; 1, 7. Negative control; 2.Heart; 3.Liver; 4.Lungs; 5.Kidney; 6.Bursa; 8. ALV; 9. REV; 10. IBDV; 11. IBV; 12. NDV; 13. AIV; 14. ARV; 15. MDV; 16. CAV; 17. ILTV 图 1 病死鸡病料的RT-PCR鉴定结果 Fig. 1 The identification results of sick materials of dead chickens by RT-PCR |
2.2.1 病毒的亚群鉴定结果 对盲传3代后的CEF和DF-1细胞上清提取RNA后进行RT-PCR鉴定。结果显示，经CEF细胞培养的上清液可扩增到约300 bp条带，而由DF-1细胞培养的上清液及阴性对照均未扩增出目的条带(图 2)。由于除E亚群ALV外，A~D亚群ALV均可在DF-1细胞传代培养[20-23]，初步表明该分离株可能为E亚群禽白血病病毒。
|
M.DNA相对分子质量标准；1.阴性对照；2.A-E亚群(P3代CEF细胞上清)；3.J亚群(P3代CEF细胞上清)；4.K亚群(P3代CEF细胞上清)；5.A-E亚群(P3代DF-1细胞上清)；6.J亚群(P3代DF-1细胞上清)；7.K亚群(P3代DF-1细胞上清) M.DL2000 DNA marker; 1.Negative control; 2.A-E subgroup (P3 generation CEF cell supernatant); 3.Subgroup J (P3 generation CEF cell supernatant); 4.K subgroup (P3 generation CEF cell supernatant); 5.A-E subgroup (P3 generation DF-1 cell supernatant); 6.Subgroup J (P3 generation DF-1 cell supernatant); 7.Subgroup K (P3 generation DF-1 cell supernatant) 图 2 ALV亚群RT-PCR鉴定结果 Fig. 2 RT-PCR identification results of ALV subgroup |
2.2.2 病毒的IFA鉴定结果 利用IFA法检测接种P3代细胞毒7 d的CEF细胞，结果显示，ALV P27单克隆抗体与接毒细胞呈阳性反应，细胞质中出现绿色荧光，细胞核呈蓝色荧光，可见ALV在细胞质中获得增殖，而未接毒细胞仅细胞核呈蓝色荧光，细胞质无特异性荧光(图 3)。
|
a~c.ALV-E感染的CEF细胞；d~f.CEF细胞阴性对照 a-c.ALV-E infected CEF cells; d-f.CEF cells negative control 图 3 间接免疫荧光检测结果(bar=100 μm) Fig. 3 Indirect immunofluorescence test results (bar=100 μm) |
2.2.3 病毒形态学鉴定结果 P3代CEF细胞培养上清液经超速离心和负染色后，通过透射电镜可观察到病毒粒子近似球形，具有明显的囊膜和纤突结构，整体直径约为80 nm (图 4)，与ALV形态大小相符，将该毒株命名为HLJE2020株。
|
图 4 透射电镜下的ALV病毒粒子(150 000×) Fig. 4 ALV virus particles under transmission electron microscope(150 000×) |
2.2.4 病毒传代的鉴定结果 取HLJE2020株P3至P11代CEF细胞培养上清液，利用ELISA和RT-PCR法检测分离株的传代稳定性。ELISA结果显示，随着传代次数的增加，病毒液中P27抗原的S/P值逐渐下降，并于P10代呈阴性(表 5)。RT-PCR结果显示P3~P9代可检测到目的基因，但P10代后未检测到病毒核酸(图 5)。上述结果表明，该分离株无法长期有效于CEF细胞中进行连续传代培养。
|
|
表 5 HLJE2020株各代CEF细胞培养上清液P27抗原检测结果 Table 5 P27 antigen detection results of supernatant of each generation HLJE2020 strain CEF cell culture |
|
N. DNA分子质量标准；1. 阴性对照；2~10. P3~P11细胞毒 N. DL2000 DNA marker; 1. Negative control; 2-10. P3-P11 cytotoxicity 图 5 HLJE2020株于CEF细胞传代的RT-PCR鉴定结果 Fig. 5 RT-PCR identification results of HLJE2020 strain passaged in CEF cells |
2.3.1 HLJE2020株全基因组序列扩增和测序结果 将HLJE2020株病毒液提取RNA后进行RT-PCR扩增，结果显示，各段均成功扩增出目的片段，与预期条带大小一致(图 6)。利用DNAStar软件将各段测序结果进行拼接，获得了HLJE2020株全基因组序列。结果显示，该分离株全基因组序列全长为7 524 bp，与经典的复制完整型C型反转录病毒结构相符，其中，3个编码蛋白的基因gag基因长2 106 bp，位于碱基位554—2 659；pol基因长2 688 bp，位于碱基位2 677—5 364；env基因长1 851 bp，位于碱基位554—571和5 252—7 084；两端完全相同，LTR基因全长274 bp，由U3、R和U5序列组成，长度分别为175、21和78 bp。将序列上传至GenBank，获得登录号为OK216743。
|
M. DNA分子质量标准；1~8. F1~F8扩增片段 M. DNA Marker DL2000; 1-8. F1-F8 amplified fragment 图 6 HLJE2020株全基因组序列扩增结果 Fig. 6 Amplification result of the whole genome sequence of HLJE2020 strain |
2.3.2 HLJE2020株全基因组序列分析结果 将HLJE2020株全基因组序列同选定的28株ALV各亚群参考毒株进行比对分析，结果显示(表 6)，HLJE2020株与28株参考毒株间的核苷酸相似性为83.6%~98.5%；gag和pol基因较为保守，二者与ALV各亚群参考毒株间的核苷酸相似性分别为94.6%~99.3%和94.9%~99.1%，氨基酸相似性分别为95.9%~99.3%和95.6%~98.9%；而env和LTR基因的核苷酸相似性与其他参考毒株间的差异相对较大，二者与ALV各亚群参考毒株间的核苷酸相似性分别为51.6%~97.4%和58.1%~98.2%，其中二者均与E亚群ALV参考毒株的核苷酸相似性最高，分别为95.6%~97.4%和94.9%~98.2%，而遗传进化分析结果也显示二者与E亚群ALV参考毒株隶属同一个进化分支，其中与含有内源性ALV LTR基因的参考毒株JS14CZ01株和JS13LY19株具有较近的亲缘关系(图 7)。
|
|
表 6 HLJE2020株全基因组序列与ALV各亚群参考毒株的相似性比较 Table 6 Comparison of homology between the whole genome sequence of HLJE2020 strain and the reference strains of ALV subgroups |
|
a.HLJE2020株env核苷酸序列遗传进化树；b. HLJE2020株LTR核苷酸序列遗传进化树 a.Phylogenetic tree of env nucleotide sequence of HLJE2020 strain; b. Phylogenetic tree of LTR nucleotide sequence of HLJE2020 strain 图 7 HLJE2020株与ALV各亚群参考毒株核苷酸序列遗传进化树 Fig. 7 Phylogenetic tree of nucleotide between HLJE2020 strain and reference strains of ALV subgroups |
2.3.3 HLJE2020株gp85基因序列分析结果 gp85蛋白是病毒囊膜蛋白env编码的主要蛋白之一，由于其能特异性结合靶细胞膜上的受体，因而决定了ALV感染宿主的范围以及亚群的特异性。将HLJE2020株gp85基因同选定的28株ALV各亚群参考毒株gp85基因进行比对，结果显示(表 6)，gp85基因与ALV各亚群参考毒株的核苷酸相似性为50.1%~94.1%，氨基酸相似性为37.3%~92.0%，其中, 与E亚群和B亚群ALV参考毒株的相似性均在90% 以上；而gp85核苷酸序列遗传进化分析结果显示该毒株gp85基因在B亚群和E亚群ALV之间出现一个单独的分支(图 8)，且该分离株gp85氨基酸序列的5个易变异区域中的Vr2、hr1和Vr3区域的氨基酸组成与B亚群参考毒株相似，Vr1、hr2以及其他区域的氨基酸组成与E亚群参考毒株相似(图 9)，推测该分离株gp85基因核苷酸序列在225—618 bp和810—840 bp处可能存在E亚群ALV与B亚群ALV的重组事件。
|
图 8 HLJE2020株与ALV各亚群参考毒株gp85核苷酸序列遗传进化树 Fig. 8 Phylogenetic tree of gp85 nucleotide between HLJE2020 strain and reference strains of ALV subgroups |
|
ALV各毒株gp85氨基酸序列中圆点表示氨基酸一致，破折号“—”表示氨基酸缺失，字母表示氨基酸突变 In the gp85 amino acid sequence of ALV strains, the dots represent consistent amino acids, the dashes "—" represent amino acid deletion, and the letters represent amino acid mutation 图 9 HLJE2020株与ALV参考毒株gp85氨基酸序列分析 Fig. 9 Amino acid sequence analysis of gp85 between HLJE2020 strain and ALV reference strain |
随后利用RDPv.4软件中的RDP、GENE-CONV、BootScan、MaxChi、Chimaera、SiScan和3Seq进一步分析HLJE2020株gp85基因的重组事件，结果显示(判断依据：至少保证5种算法的P值< 10-5且Recombinant sequence identification graphs中第一个柱状图面积评分需>0.600)，该分离株gp85基因是由主要亲本毒株AF229株(美国2017年商品肉鸡分离株)与次要亲本毒株SDAU09C2株(中国2012年山东地方品系种鸡芦花鸡分离株)于核苷酸序列258—613 bp产生1处重组信号，形成了HLJE2020株重组gp85基因(表 7和图 10)；而SimPlot软件分析结果也进一步表明HLJE2020株的gp85基因确实存在重组现象(图 11)。
|
|
表 7 HLJE2020株的RDPv.4重组分析数据 Table 7 RDPv. 4 recombination analysis data of HLJE2020 strain |
|
图 10 HLJE2020株gp85基因重组分析结果 Fig. 10 Analysis of gp85 gene recombination of HLJE2020 strain |
|
设置：窗口200 bp, 步长20 bp，间隙开启，Kimura两参数模型，T/t2.0 Settings: Window 200 bp, Step 20 bp, Gapstrip on, Kimura (2-parameter), T/t 2.0 图 11 HLJE2020株的SimPlot重组分析结果 Fig. 11 SimPlot recombination analysis results of HLJE2020 strain |
自1999年我国首次发现J亚群ALV以来，其在全国多地鸡场中的广泛分布严重阻碍了养鸡业的健康发展[24-25]。尽管我国从2008年起开始实行禽白血病根除计划(NEP)并取得一定成效，然而在某些采取净化措施不到位的地方品系鸡群中仍然存在着ALV多个亚群混合感染的情况[26]，导致鸡体在受到多个基因组不同的ALV病毒粒子感染时，就可能产生包含来自两个或多个亲本基因组序列的重组ALV[6]。因此，务必要引起国内养禽业的重视。
本研究通过对黑龙江省某养鸡场病料进行检测，将ALV阳性样品处理后接种于CEF细胞培养，利用RT-PCR、IFA和透射电镜方法对分离株进行鉴定，分离到一株E亚群ALV HLJE2020株。通过对该分离株的传代稳定性进行研究，发现随着传代次数的增加，P27抗原的S/P比值也随之下降，在盲传至第10代后的P27抗原检测结果均呈阴性，这与徐海鹏等[27]从种蛋中分离出的E亚群ALV在CEF细胞上连续传代培养后P27抗原S/P值不断下降的结果一致。同时，RT-PCR结果也显示, 在盲传至第10代后检测不到病毒核酸的存在。推测其原因可能是E亚群ALV基因组中LTR基因同外源性ALV相比其启动子活性较弱，而LTR启动子活性的强弱与病毒的复制能力、翻译以及致瘤性密切相关[4]，因而导致E亚群ALV的复制和感染能力很弱，无法长期连续传代培养，但具体原因仍需进行后续研究。
gp85基因是ALV env基因的重要组成部分，与敏感细胞的识别和黏附过程有关，它是决定ALV亚群分类的主要依据，其编码的蛋白也是病毒中和的主要抗原[2]，其核苷酸序列的改变，特别是某些位点的变化可能对病毒的抗原性、细胞趋向性等方面产生影响，甚至有可能经过长期的突变和重组而产生新的亚群，因此其在ALV的遗传演化中发挥着重要作用[28]。在本研究中，通过对HLJE2020株gp85基因进行核苷酸(氨基酸)同源性、遗传进化和重组分析，发现该分离株gp85基因的重组区域主要集中在gp85基因5个高变区(hr1、hr2、Vr1、Vr2和Vr3)中的hr1和hr2，且该区域的重组元件是由B亚群ALV提供，这与先前多项研究中发现重组ALV毒株基因组中的重组区域主要位于LTR基因、gag基因或gp37基因且均由E亚群ALV提供重组元件的情况有所不同[4, 29]。有研究表明，gp85基因高变区中的hr1和hr2是病毒糖蛋白三聚体和宿主蛋白受体之间的主要结合域[30]，当其受到外界环境或免疫反应的选择压力的干扰极有可能发生变异[31]，而这些区域的改变就会对细胞受体的结合以及宿主范围产生影响[32]，进而推测该分离株在此区域的改变可能使病毒感染、复制和传播的能力增强，并使其感染的宿主范围发生改变，同时也进一步表明我国ALV已发生新的变异趋势，这种新的变异现象的产生应当引起人们的高度重视。而有关该重组毒株的真实起源、形成过程等方面内容还有待后续研究。
4 结论本研究成功分离出1株E亚群ALV HLJE2020株，且该分离株基因组序列中的gp85基因可能存在E亚群ALV和B亚群ALV的重组现象，为今后ALV的变异趋势和致病机制的研究奠定基础。
| [1] |
LI H J, WANG P K, LIN L L, et al. The emergence of the infection of subgroup J avian leucosis virus escalated the tumour incidence in commercial yellow chickens in Southern China in recent years[J]. Transbound Emerg Dis, 2019, 66(1): 312-316. DOI:10.1111/tbed.13023 |
| [2] |
PAYNE L N, NAIR V. The long view: 40 years of avian leukosis research[J]. Avian Pathol, 2012, 41(1): 11-19. DOI:10.1080/03079457.2011.646237 |
| [3] |
马美哥. 我国部分地方品种鸡和进口白羽肉种鸡ALV-J的分子流行病学调查及致病性研究[D]. 石河子: 石河子大学, 2019. MA M G. Molecular epidemiological investigation and pathogenicity of subgroup J avian leukosis in part local breeders and imported broiler breeders[D]. Shihezi: Shihezi University, 2019. (in Chinese) |
| [4] |
ZHAO Z J, RAO M Z, LIAO M, et al. Phylogenetic analysis and pathogenicity assessment of the emerging recombinant subgroup K of Avian Leukosis virus in South China[J]. Viruses, 2018, 10(4): 194. DOI:10.3390/v10040194 |
| [5] |
SUN T, WANG X M, HAN W, et al. Complete genome sequence of a novel recombinant avian Leukosis virus isolated from a three-yellow chicken[J]. Arch Virol, 2020, 165(11): 2615-2618. DOI:10.1007/s00705-020-04764-7 |
| [6] |
WANG P K, YANG Y L, LIN L L, et al. Complete genome sequencing and characterization revealed a recombinant subgroup B isolate of avian Leukosis virus with a subgroup J-like U3 region[J]. Virus Genes, 2017, 53(6): 927-930. DOI:10.1007/s11262-017-1493-4 |
| [7] |
LI X Y, YU Y, MA M G, et al. Molecular characteristic and pathogenicity analysis of a novel multiple recombinant ALV-K strain[J]. Vet Microbiol, 2021, 260: 109184. DOI:10.1016/j.vetmic.2021.109184 |
| [8] |
毕研丽, 庄金秋, 王金良, 等. 双重PCR检测禽源生物制品中禽网状内皮组织增生症病毒和禽白血病病毒[J]. 畜牧与兽医, 2014, 46(4): 74-78. BI Y L, ZHUANG J Q, WANG J L, et al. Detection of avian reticuloendothelial hyperplasia virus and avian leukemia virus in avian biological products by dual PCR[J]. Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2014, 46(4): 74-78. (in Chinese) |
| [9] |
李凯, 高宏雷, 高立, 等. 禽网状内皮组织增生病病毒TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的建立及应用[J]. 中国兽医科学, 2010, 40(11): 1137-1141. LI K, GAO H L, GAO L, et al. Development and application of a TaqMan real-time PCR assay for detection of reticuloendotheliosis virus[J]. Chinese Veterinary Science, 2010, 40(11): 1137-1141. (in Chinese) |
| [10] |
金娟, 李亚杰, 鲍恩东. 1株禽传染性支气管炎病毒的分离鉴定及其实时荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 畜牧与兽医, 2020, 52(1): 115-121. JIN J, LI Y J, BAO E D, et al. Isolation and identification of a strain of avian infectious bronchitis virus and establishment of real-time fluorescent quantitative PCR for the strain[J]. Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2020, 52(1): 115-121. (in Chinese) |
| [11] |
屈素洁, 施开创, 邹联斌, 等. 新城疫病毒和传染性支气管炎病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J]. 中国预防兽医学报, 2014, 36(11): 867-871. QU S J, SHI K C, ZOU L B, et al. Development of a dultiplex real-time RT-PCR assay for detection of Newcastle disease virus and avian infectious bronchitis viruses[J]. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine, 2014, 36(11): 867-871. (in Chinese) |
| [12] |
王楷宬, 王素春, 朱琳, 等. 禽流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J]. 中国动物检疫, 2019, 36(4): 64-69. WANG K C, WANG S C, ZHU L, et al. Establishment of real-time RT-PCR for detection of avian influenza virus[J]. China Animal Health Inspection, 2019, 36(4): 64-69. DOI:10.3969/j.issn.1005-944X.2019.04.016 (in Chinese) |
| [13] |
钟丽, 孙美玉, 高立, 等. 禽呼肠孤病毒TaqMan实时荧光RT-PCR方法的建立及病毒组织分布比较研究[J]. 中国动物传染病学报, 2017, 25(2): 56-60. ZHONG L, SUN M Y, GAO L, et al. Development and application of a TaqMan RT-PCR assay for detection of avian reoviruses in tissues[J]. Chinese Journal of Animal Infectious Diseases, 2017, 25(2): 56-60. (in Chinese) |
| [14] |
张颖. 鸡马立克氏病病毒TaqMan探针双重荧光定量PCR检测方法的建立及应用[D]. 呼和浩特: 内蒙古农业大学, 2006. ZHANG Y. Establishment and application of diagnostic test for Marek's disease virus based on TaqMan probe double Fluorescent Quantitative Polymerase-Chain-Reaction (FQ-PCR)[D]. Hohhot: Inner Mongolia Agricultural University, 2006. (in Chinese) |
| [15] |
宋修庆. VP3对鸡贫血病毒复制的影响及核定位信号的作用[D]. 北京: 中国农业科学院, 2009. SONG X Q. Effect of chicken anemia virus VP3 on viral replication and function of nuclear location signal[D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2009. (in Chinese) |
| [16] |
赵妍, 孔聪聪, 张晓敏, 等. 鸡传染性喉气管炎病毒TaqMan real-time PCR检测方法的建立[J]. 中国预防兽医学报, 2012, 34(8): 642-646. ZHAO Y, KONG C C, ZHANG X M, et al. Development of a TaqMan real-time PCR for detection of infectious laryngotracheitis virus[J]. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine, 2012, 34(8): 642-646. (in Chinese) |
| [17] |
SMITH L M, BROWN S R, HOWES K, et al. Development and application of polymerase chain reaction (PCR) tests for the detection of subgroup J avian leukosis virus[J]. Virus Res, 1998, 54(1): 87-98. |
| [18] |
俞燕, 周生, 李建梅, 等. A、B、J和K亚群禽白血病病毒多重PCR检测方法的建立及应用[J]. 中国预防兽医学报, 2020, 42(5): 462-468. YU Y, ZHOU S, LI J M, et al. Establishment and application of multiple PCR for detection of avian leukosis viruses subgroup A, B, J and K[J]. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine, 2020, 42(5): 462-468. (in Chinese) |
| [19] |
MARTIN D P, MURRELL B, GOLDEN M, et al. RDP4:detection and analysis of recombination patterns in virus genomes[J]. Virus Evol, 2015, 1(1): vev003. |
| [20] |
陈茹. 两株A亚群和一株K亚群禽白血病病毒体外增殖及对雏鸡致病性比较[D]. 泰安: 山东农业大学, 2018. CHEN R. Comparisons of the proliferation in vitro and the pathogenicity in chickens between two ALV-a strains and one ALV-K strain[D]. Taian: Shandong Agricultural University, 2018. (in Chinese) |
| [21] |
武专昌. 一株B亚型ALV的分离、前病毒全基因组序列分析和感染性克隆的构建[D]. 泰安: 山东农业大学, 2012. WU Z C. Isolation, sequence analysis for the complete Proviral genome and construction of infectious clone of a subgroup B ALV[D]. Taian: Shandong Agricultural University, 2012. (in Chinese) |
| [22] |
CAI L M, SHEN Y W, WANG G H, et al. Identification of two novel multiple recombinant avian Leukosis viruses in two different lines of layer chicken[J]. J Gen Virol, 2013, 94(Pt 10): 2278-2286. |
| [23] |
SANDELINI K, ESTOLA T. Occurrence of different subgroups of avian Leukosis virus in Finnish poultry[J]. Avian Pathol, 1974, 3(3): 159-168. |
| [24] |
MAO Y Q, SU Q, LI J P, et al. Avian Leukosis virus contamination in live vaccines: a retrospective investigation in China[J]. Vet Microbiol, 2020, 246: 108712. |
| [25] |
ZHOU D F, XUE J W, ZHANG Y, et al. Outbreak of myelocytomatosis caused by mutational avian leukosis virus subgroup J in China, 2018[J]. Transbound Emerg Dis, 2019, 66(2): 622-626. |
| [26] |
LI Q H, WANG P K, LI M, et al. Recombinant subgroup B avian leukosis virus combined with the subgroup J env gene significantly increases its pathogenicity[J]. Vet Microbiol, 2020, 250: 108862. |
| [27] |
徐海鹏, 孟凡峰, 董宣, 等. 种蛋中内源性禽白血病病毒的检测和鉴定[J]. 畜牧兽医学报, 2014, 45(8): 1317-1323. XU H P, MENG F F, DONG X, et al. Detection and identification of an endogenous subgroup E avian leukosis virus in a chicken breeder embryo[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2014, 45(8): 1317-1323. (in Chinese) |
| [28] |
DONG X, MENG F F, HU T, et al. Dynamic co-evolution and interaction of avian Leukosis virus genetic variants and host immune responses[J]. Front Microbiol, 2017, 8: 1168. |
| [29] |
WANG P K, NIU J R, XUE C, et al. Two novel recombinant avian leukosis virus isolates from Luxi gamecock chickens[J]. Arch Virol, 2020, 165(12): 2877-2881. |
| [30] |
FEDERSPIEL M J. Reverse engineering provides insights on the evolution of subgroups A to E avian sarcoma and Leukosis virus receptor specificity[J]. Viruses, 2019, 11(6): 497. |
| [31] |
VENUGOPAL K, SMITH L M, HOWES K, et al. Antigenic variants of J subgroup avian leukosis virus: sequence analysis reveals multiple changes in the env gene[J]. J Gen Virol, 1998, 79(Pt 4): 757-766. |
| [32] |
HOLMEN S L, MELDER D C, FEDERSPIEL M J. Identification of key residues in subgroup A avian leukosis virus envelope determining receptor binding affinity and infectivity of cells expressing chicken or quail Tva receptor[J]. J Virol, 2001, 75(2): 726-737. |
(编辑 白永平)