2. 兰州大学草地农业科技学院，兰州 730020;
3. 新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐 830052
2. College of Pastoral Agriculture Science and Technology, Lanzhou University, Lanzhou 730020, China;
3. College of Animal Science, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, China
随着畜禽养殖业规模化、集约化发展程度不断提高，畜舍中饲养密度的增加使得舍内硫化氢、氨气等有害气体含量增多，严重威胁着人畜的健康，对畜禽生产性能产生不良影响[1-2]。硫化氢(H2S)作为畜舍中具有刺激性气味的有害气体之一，主要来源于饲料中含硫物质在动物体内的消化以及粪尿、垫料、饲料残渣中含硫有机物的厌氧分解。我国《规模猪场环境参数及环境管理》(GB/T17824.3—2008)[3]规定猪舍空气中H2S不宜超过10 mg·m-3，美国职业安全与健康管理局(OSHA)[4]规定H2S允许暴露的限值为30 mg·m-3。然而实际生产中，如猪舍清粪等环节，粪便的搅动使猪舍H2S浓度在搅拌源附近或者通风不足的区域常突破OSHA规定的最高限值[5-6]，严重威胁着畜禽和养殖人员的健康以及生命安全。据报道，30 mg·m-3 H2S暴露会使人类眼部受到刺激，并产生疲劳、头痛等症状[7]。在畜禽中的研究发现，20 mg·m-3 H2S暴露诱导肉鸡产生氧化应激，造成肝[8]、气管[9]、空肠[10]等多组织损伤。16 mg·m-3 H2S暴露也会引起肉羊的氧化应激，降低其免疫功能和抗氧化能力[11]。以猪为研究对象，15 mg·m-3 H2S暴露，会对断奶仔猪生长、免疫，甚至肠道菌群产生不利影响[12]，而30 mg·m-3 H2S暴露还能引起肺部炎症、免疫抑制和细胞死亡等[13]，但H2S对猪氧化还原状态影响的报道较少。
相比外源性H2S的毒性作用，内源性H2S作为一种气体信号分子，在生理和病理过程中发挥着重要作用，研究其代谢对于理解其生物学功能至关重要[14]。哺乳动物体内H2S主要由胱硫醚β-合酶(CBS)、胱硫醚γ-裂解酶(CSE)和3-巯基丙酮酸硫转移酶(3-MST)催化产生[15]。随着内源H2S的产生，它必须被快速代谢清除，防止在体内积累产生毒性作用。哺乳动物H2S分解代谢主要途径是在肝线粒体中通过硫化物如醌氧化还原酶(SQR)、亚硫酸盐氧化酶(SUOX)等酶促氧化生成硫酸盐或者硫代硫酸盐[16-17]。
目前，国内外关于H2S暴露对保育猪血清和肝氧化还原状态以及H2S代谢影响的研究鲜有报道。因此，本研究参照OSHA规定的职业环境中H2S暴露最高限值30 mg·m-3，研究人工环控舱中H2S暴露28 d对保育猪血清及肝氧化还原状态和体内H2S代谢的影响，为畜禽舍环境控制和环境舒适度评价提供理论依据，为保护生猪及养殖人员健康安全以及提高动物福利提供理论指导。
1 材料与方法 1.1 试验设计试验采用完全随机设计，选取12头体况健康、体重相近((11.61±1.51)kg)的35日龄保育猪(大白猪)，随机分为2组，公母各半，每组6头仔猪，分别饲养在两个环控舱内。试验组环控舱内H2S浓度控制为30 mg·m-3，对照组环控舱内H2S浓度控制为0 mg·m-3。试验期为28 d。
1.2 饲养管理试验期开始前，对环控舱进行充分清洗、消毒。试验过程中，每2 h，使用便携式H2S气体检测仪(美国华瑞ToxiRAE Pro，PGM-1860)对环控舱内H2S浓度进行检测，确保H2S浓度在试验期内保持稳定。H2S气体(纯度为99.9%)购自北京永圣气体科技有限公司。除H2S浓度外，环控舱内其余环境参数均保持一致，温度为20~22 ℃，湿度为60%~65%。试验期间保育猪自由采食和饮水，参照《猪饲养标准》(NY/T 65—2004)配制玉米-豆粕型基础日粮，其组成及营养成分与文献[18]一致。试验结束后，所有保育猪在禁食、自由饮水12 h后进行采血、屠宰及样品采集。
1.3 样品采集与保存H2S暴露28 d后，保育猪颈静脉采血，血液静置30 min后，3 000 r·min-1离心10 min，分离血清至离心管内，于－80 ℃保存。电击致晕仔猪，屠宰解剖采集肝组织样品至冻存管，于－80 ℃保存。
1.4 测定指标和方法1.4.1 血清氧化还原指标 采用南京建成生物工程研究所的生化试剂盒检测血清总超氧化物歧化酶(T-SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)的活性，以及丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)的含量。采用上海科顺生物科技有限公司的猪活性氧簇(ROS)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒检测血清活性氧(ROS)的含量。具体操作按照试剂盒说明书进行。
1.4.2 肝氧化还原指标 采用南京建成生物工程研究所的生化试剂盒检测肝组织T-SOD、CAT、GPX活性，H2O2、MDA、蛋白质羰基(PC)、GSH、GSSG含量以及羟自由基(·OH)清除能力。采用上海科顺生物科技有限公司的猪活性氧簇(ROS)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒检测肝组织ROS含量。具体操作按照试剂盒说明书进行。
1.4.3 血清和肝H2S含量测定 采用血液硫化氢含量比色法定量检测试剂盒(GMS70105.2，GENMED)测定血清H2S含量；采用组织硫化氢含量比色法定量检测试剂盒(GMS70105.1，GENMED)测定肝组织H2S含量，具体操作按照试剂盒说明书进行。
1.4.4 肝中相关基因表达水平测定 采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测保育猪肝氧化还原、硫化氢合成以及分解代谢相关基因的mRNA表达水平。使用北京金百特生物技术有限公司的通用型总RNA快速提取试剂盒(TRIzol+吸附柱)提取肝组织中的RNA，利用反转录试剂盒(RR047A，TaKaRa)合成cDNA。采用SYBR Green Premix(RR420A，TaKaRa)和实时荧光定量PCR仪(CFX96TM Real-Time system，Bio-Rad)对目的基因的mRNA表达量进行检测。采用2-ΔΔCT法[19]计算目的基因的相对表达量，以GAPDH为内参基因对数据进行标准化。目的基因的引物序列如表 1所示，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
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表 1 用于RT-qPCR的基因引物序列 Table 1 Gene primers sequences for RT-qPCR |
采用Excel 2019软件整理数据，GraphPad Prism 8软件的双尾t检验进行统计分析以及作图，结果以“平均数±标准误”表示。P < 0.05和P < 0.01分别作为显著和极显著差异的标准。
2 结果 2.1 H2S暴露对保育猪血清氧化还原指标的影响由表 2可知，与对照组相比，H2S暴露引起保育猪血清中ROS含量极显著增加(P < 0.01)，MDA含量显著增加(P < 0.05)；T-SOD的活性显著降低(P < 0.05)，CAT和GPX的活性极显著降低(P < 0.01)，GSH和GSSG的含量无显著变化(P>0.05)。
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表 2 H2S暴露对保育猪血清氧化还原指标的影响 Table 2 Effects of H2S exposure on serum redox indexes of nursery pigs |
如表 3所示，与对照组相比，H2S暴露使肝中ROS和H2O2含量升高，同时MDA和PC含量升高，但差异不显著(P>0.05)。T-SOD和GPX活性极显著升高(P < 0.01)，·OH清除能力显著提高(P < 0.05)，而CAT活性升高，但差异不显著(P>0.05)，GSH和GSSG含量无显著变化(P>0.05)。
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表 3 H2S暴露对保育猪肝组织氧化还原指标的影响 Table 3 Effects of H2S exposure on liver redox indexes of nursery pigs |
H2S暴露后保育猪肝中Nrf2及下游抗氧化相关基因的mRNA表达量变化如图 1所示。与对照组相比，H2S暴露显著降低了Keap1的mRNA表达(P < 0.05)，同时上调了Nrf2的mRNA表达(P < 0.05)。SOD1、SOD2、GPX1、GPX2、GPX4、GSR、CAT的mRNA表达均上调，其中SOD2、GPX1、GPX2、GPX4以及GSR的mRNA表达上调达显著水平(P < 0.05)。
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*表示P < 0.05。下图同 * indicates P < 0.05. The same as below 图 1 H2S暴露对保育猪肝Nrf2及下游抗氧化基因表达的影响 Fig. 1 The effect of H2S exposure on the Nrf2 and downstream antioxidant-related genes expression in liver of nursery pigs |
为研究外源H2S对保育猪内源性H2S代谢的影响，检测保育猪血清和肝中H2S含量以及肝H2S合成以及分解代谢相关基因表达。由图 2可知，与对照组相比，H2S暴露28 d后，血清和肝组织中H2S含量均显著降低(P < 0.05)。
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图 2 H2S暴露对保育猪血清和肝H2S含量的影响 Fig. 2 Effects of H2S exposure on H2S content in serum and liver of nursery pigs |
如图 3所示，与对照组相比，H2S暴露28 d后，肝中内源性H2S合成酶CSE和CBS的mRNA表达量均显著下调(P < 0.05)，3-MST的mRNA表达量下调，但差异不显著(P>0.05)；同时，H2S代谢酶SQR和SUOX的mRNA表达量下调，但差异不显著(P>0.05)。
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图 3 H2S暴露对保育猪内源性H2S合成与分解代谢的影响 Fig. 3 Effects of H2S exposure on endogenous H2S synthesis and catabolism in nursery pigs |
血液中氧化还原指标能够反映机体的氧化还原状态和健康状况。本研究通过检测保育猪血清中多项氧化还原指标来判断H2S暴露对保育猪机体氧化还原状态的影响。H2S的主要毒性作用机制是抑制氧化呼吸链中的线粒体细胞色素C氧化还原酶的活性，促进ROS的生成[20]。当ROS的产生超过了机体抗氧化防御系统的清除能力，持续高水平的ROS抑制抗氧化酶的活性，抗氧化系统遭到破坏，最终导致脂质、蛋白质和核酸等大分子受损[21-22]。本研究发现，H2S暴露增加了保育猪血清中ROS的水平，降低了抗氧化酶T-SOD、CAT和GPX活性，同时增加了MDA含量。MDA为脂质过氧化的产物，其含量的增加预示着氧化应激损伤的产生[23]。因此，以上结果预示着H2S暴露导致保育猪血清氧化还原系统受到了损伤。有研究发现，断奶仔猪暴露在5、10、15 mg·m-3的H2S环境中会导致其血清SOD活性降低，MDA含量升高，产生过氧化损伤[24]。高浓度H2S暴露也可引起肉羊机体氧化应激的产生，降低血清SOD、CAT活性，增加MDA水平[11]。许多其他环境因子如热应激、湿度和氨气等同样也能够引发氧化应激，降低肉鸡、肉牛血清抗氧化酶活性，升高MDA含量[25-27]。虽然血清中存在抗氧化系统，但长期暴露于高浓度H2S环境中，随着氧化应激时间的延长，血清抗氧化系统遭到破坏，导致抗氧化酶SOD、GPX和CAT的蛋白表达量降低，从而使其酶活性低于正常水平而不足以及时清除大量的ROS，氧化还原状态失衡，最终造成氧化损伤[11, 28]。
3.2 H2S暴露对保育猪肝组织氧化还原状态的影响肝是机体重要的代谢和解毒器官，其含有大量线粒体，是机体进行氧化还原反应的主要场所[29-30]。因此，机体产生氧化应激时，肝是受ROS攻击的主要靶器官[31]。ROS主要包括O2-·、H2O2和·OH，当环境因素或疾病引起过量的ROS生成，氧化还原平衡遭到破坏，就会导致机体氧化应激的产生[32]。为了避免氧化损伤，机体存在抗氧化防御系统，能够通过清除ROS来保持细胞的氧化还原平衡[33]。抗氧化酶SOD、CAT、GPX被认为是抗氧化防御系统的第一道防线，能快速清除过量的ROS，保护细胞免受氧化损伤[21]。·OH作为最具活性的ROS之一，被认为是造成氧化应激损伤的主要原因，它能够攻击几乎所有类型的生物大分子并造成不可修复的细胞氧化损伤[34]。因此，对·OH清除能力的测定可直接反映出机体的抗氧化水平[35]。本研究发现，H2S暴露提高了肝组织·OH清除能力，表明了肝抗氧化能力的提升。此外，本研究结果还显示，H2S暴露提高了肝抗氧化酶SOD和GPX的水平，且H2O2、ROS、MDA和PC含量无显著变化。PC和MDA是蛋白质和脂质氧化损伤的标志物，常用来评估ROS导致的氧化损伤[36]。而与对照组相比，MDA和PC含量无显著变化，这可能意味着H2S暴露未对保育猪肝产生明显氧化损伤。目前，关于H2S暴露对猪肝氧化还原状态影响的研究还未见报道。但在20 mg·m-3 H2S暴露42 d的肉鸡试验中发现，H2S暴露会引起肉鸡肝组织氧化应激，抑制SOD、CAT和GSH-Px的活性，并增加MDA含量[8]。这与本试验结果不一致，可能是由于小动物接触H2S产生的反应与大动物不同[37]，不同试验动物、H2S浓度以及暴露时间产生的结果也不尽相同[38]。此外，本研究结果与血清中产生氧化损伤的结果不一致，分析其原因，可能是H2S通过呼吸进入体内直接与血液接触[39]，而H2S经血液循环到达肝后浓度相对降低，加之肝有较强的解毒和抗氧化能力，对机体的氧化应激产生了代偿性调控反应，进而提高了肝抗氧化酶的活性，及时清除肝中经H2S刺激后产生的大量ROS，保护肝免受氧化损伤。
Nrf2是细胞氧化还原平衡的主要调节因子，在正常生理条件下，keap1与细胞质中的Nrf2结合，并促进Nrf2被蛋白酶体降解，而当机体遭受氧化应激时，keap1-Nrf2复合物解偶联，导致Nrf2易位至细胞核，与抗氧化反应原件(ARE)结合，诱导抗氧化相关基因和抗氧化酶的表达[40]。哺乳动物抗氧化酶SOD包含SOD1、SOD2和SOD3三种形式；GPX包含GPX1、GPX2、GPX3、GPX4等多种形式，它们各自在机体抗氧化过程中发挥着重要的作用[36, 41]。然而，在外源H2S暴露条件下，关于保育猪Nrf2信号通路的研究鲜有报道。本研究发现，H2S暴露会引起肝Keap1的mRNA表达降低，同时Nrf2的mRNA表达升高，并提高了SOD2、GPX1、GPX2、GPX4和GSR的mRNA表达，这与肝中抗氧化酶活性升高的结果相对应。本研究结果与其他环境因素(污染物)造成的氧化应激结果类似。例如，热应激能够激活肉鸡肝Nrf2信号通路，上调SOD、CAT等抗氧化酶基因的表达，从而导致抗氧化酶活性增加，防止细胞氧化损伤[36]；PM2.5暴露诱导小鼠氧化应激，同时激活了肺中Nrf2信号通路，并增强SOD、CAT等抗氧化酶的表达以及GSH的产生，维持氧化还原稳态并避免肺部氧化损伤[42]。此外，大量研究发现，GSH是内源非酶抗氧化剂中含量最丰富的小分子物质，其能够直接清除ROS或者参与GPX催化H2O2生成GSSG和水的解毒反应，GSSG在谷胱甘肽还原酶(GSR)的作用下重新还原成GSH，构成的GSH循环是维持机体氧化还原平衡的重要过程[43]。在本研究中，试验组GSR的mRNA表达升高，而GSH和GSSG的含量并未发生显著变化。这可能是因为GPX活性提高增加了GSH消耗的同时，GSR的mRNA表达上调提高了GSR活性，促进GSSG生成GSH来维持GSH循环的稳态。
3.3 H2S暴露对保育猪内源性硫化氢代谢的影响在体内，H2S作为内源性气体信号分子，在生理和病理过程中发挥重要的作用[44]。内源性H2S主要由CBS、CSE和3-MST三种酶催化生成[45]，这3种酶均存在于肝中，且CSE和CBS是肝中H2S产生的主要贡献者[15, 46]。高浓度H2S通过抑制线粒体细胞色素C氧化还原酶和线粒体呼吸而产生细胞毒性，为维持机体H2S适当的生理水平，绝大多数游离H2S会立即通过氧化、甲基化以及与金属蛋白结合进行代谢[39, 47]。其中，肝线粒体中的氧化是H2S分解代谢的主要途径，该途径包括SQR、SUOX等几种功能相关的酶，共同协作催化H2S分解[16, 17]。
准确测定血液、组织和细胞内源性H2S水平对研究其在病理生理环境中生物学功能至关重要[48]。此外，肝是内源性H2S产生与分解代谢的主要场所[49]，本研究通过检测血清和肝组织中的H2S含量以及H2S合成与分解代谢酶的mRNA表达来研究H2S暴露对保育猪机体H2S稳态的影响。结果表明，H2S暴露导致血清和肝中的内源性H2S水平显著下降，同时CBS和CSE的mRNA表达显著降低，但SQR和SUOX的mRNA表达无显著变化。产生上述结果的原因可能是长期暴露于较高外源H2S环境下，机体为维持内源性H2S的稳态，通过负反馈调节机制，抑制内源H2S合成酶相关基因的表达，进而减少内源性H2S的产生，而对分解代谢过程无显著影响，最终导致内源性H2S含量降低[18]。本课题组前期研究发现，15 mg·m-3 H2S暴露28 d，断奶仔猪血清、肝、心、肾中H2S含量以及肝中H2S合成酶CSE、CBS的mRNA表达也存在降低的现象[18]。此外，腹腔注射高剂量的外源H2S供体NaHS，发现小鼠肝中H2S含量以及CSE基因表达也出现显著降低[50]，与本研究结果类似。H2S的生理浓度是维持体内细胞稳态的重要因素，而异常的H2S浓度以及H2S代谢失调通常与众多疾病的发生发展有关[51-53]。因此，本研究中内源H2S水平以及其合成能力的降低可能预示着肝功能异常和机体疾病的发生。
4 结论在本试验条件下，30 mg·m-3 H2S暴露28 d，导致保育猪血清抗氧化系统受损，而肝中Nrf2/Keap1信号通路的激活使肝免受氧化损伤；此外，H2S暴露抑制了保育猪内源性H2S的合成代谢。
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(编辑 范子娟)