2. 赣州绿林湾农牧有限公司，赣州 341103
2. Ganzhou Lvlinwan Agriculture and Animal Husbandry Co. Ltd., Ganzhou 341103, China
羊肉是日常生活中常见的畜产品之一，我国的羊肉产量世界排名第一，占世界羊肉总产量的30%左右。2021年国家统计局的数据显示，我国羊肉产量近五年呈逐步增加趋势，至2020年已达492万吨[1]。湖羊适应性强、繁殖性能好，是现代集约化舍饲养殖的理想肉羊品种[2]。随着羊肉消费需求的增加，传统放牧的肉羊生产模式逐渐转向舍内规模化养殖。反刍动物养殖模式的转变常常伴随着日粮的改变。生产中为追求高生产性能，常采用高比例精料的营养饲喂策略，以满足反刍动物对能量和其他营养物质的需求[3-4]。然而，高精料饲喂模式下的非结构性碳水化合物含量高，进入瘤胃后快速发酵产生大量的乳酸、挥发性脂肪酸(VFA)等有机酸使得瘤胃内pH下降，进而引发一系列的代谢紊乱，如亚急性瘤胃酸中毒(SARA)和营养性腹泻，这给生产带来严重的经济损失[4]。瘤胃作为一个厌氧发酵系统，有着复杂的微生物区系，这些微生物在提高反刍动物营养物质消化和生产性能及维持动物健康方面起着重要的作用[5]。瘤胃pH、VFA产量和氨态氮(NH3-N)浓度是衡量瘤胃发酵状况的主要指标，其数值的高低或大小能够反映饲料在瘤胃内的发酵程度和利用状况[6]。影响瘤胃发酵的因素有很多，如日粮、动物品种、年龄、气候和饲养环境，其中最主要的是饲粮的结构和营养水平，改变日粮精粗比是调节饲粮结构、改变营养水平的重要手段，不同的日粮类型会使进入瘤胃的发酵底物产生差异，进一步影响瘤胃的发酵类型和产物[7]。目前关于能量水平对湖羊的影响多集中在生长性能、消化代谢和肉品质[2, 8]，而对瘤胃微生物菌群的影响报道较少。因此，本试验以湖羊为研究对象，通过设置等氮日粮，研究日粮能量水平对瘤胃发酵特性和瘤胃微生物菌群的影响，为湖羊育肥期的营养调控策略提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 时间和地点试验于2021年5~9月在赣州绿林湾农牧有限公司开展。
1.2 试验动物与试验设计选取健康、体重相近((17.77±1.15)kg)的湖羊公羊48只，随机分为2组，每组6个重复，每个重复4只羊，每个重复安排在同一栏中饲养。日粮营养水平参照肉羊饲养标准(NY/T 816—2004)，其中对照组(代谢能ME=8.83 MJ·kg－1，C组)饲喂试验羊场常规日粮，高能组(代谢能ME=10.84 MJ·kg－1，H组)饲喂高出对照组代谢能20%的日粮。试验全期105 d，其中预试期15 d，正试期90 d。
1.3 基础饲粮基础饲粮组成及营养水平见表 1。
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表 1 饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Dietary composition and nutrient level (dry matter basis) |
试验开始前用2%的NaOH溶液对羊舍进行喷洒消毒，试验期内每周消毒2次。所有羊只均进行体内和体外驱虫，并按照羊场相关免疫程序对试验羊进行免疫。在试验期间，每天饲喂2次(早上8:00和下午16:00)，自由饮水；根据羊前一天的采食量，饲喂时适当调整各栏的日粮供应，确保料槽内有10%左右的剩料量。
1.5 样品采集在试验期第90天，每个重复随机选取1只羊，禁食12 h后屠宰采集瘤胃液，用于测定瘤胃发酵参数以及瘤胃菌群的组成和多样性。将采集到的瘤胃内容物充分混合后用四层纱布进行过滤，立即测定瘤胃液pH；取约30 mL用于NH3-N、微生物菌体蛋白(MCP)和VFA浓度的测定；另取2 mL于冻存管中用于DNA的提取和测序分析。瘤胃液样品分装后迅速放入液氮中，后转移至实验室－80 ℃冰箱保存。
1.6 测定指标及方法1.6.1 瘤胃液pH 采集瘤胃液后立即使用便携式pH计测定瘤胃液pH。
1.6.2 氨态氮(NH3-N) 取四层纱布过滤后的瘤胃液1 mL于4 000 r·min-1离心10 min，后吸取100 μL上清液置于5 mL离心管中，加入300 μL的水，再加入1.6 mL 0.2 mol·L-1的HCl混合并摇匀，将待测样品稀释20倍，取稀释过的瘤胃液200 μL，依次加入1 mL的A液(0.08 g亚硝基铁氰化钠溶解于100 mL的14%水杨酸钠溶液中)和1 mL的B液(2 mL次氯酸钠溶液(商品名安替福明，含活性氯5.2%)混于100 mL 0.3 mol·L-1氢氧化钠溶液中摇匀)，混匀后静置10 min，立即在波长700 nm下比色[9]。
1.6.3 微生物菌体蛋白(MCP) 将样品在室温下解冻后漩涡振动1 min，在2 100 r·min-1离心5 min后，取上清2 mL在4 ℃、13 000 r·min-1条件下离心30 min，弃上清，加入1 mL蒸馏水重悬，再次13 000 r·min-1离心30 min，弃上清，加1 mL的1% NaOH溶液，洗3次后转移至10 mL的离心管中，然后加3 mL的NaOH于100 ℃水浴锅中水浴10 min，取1 mL溶液于13 000 r·min-1离心40 min，之后参照Makkar等[10]描述的福林-苯酚法测定MCP含量。
1.6.4 挥发性脂肪酸(VFA) 取1.5 mL瘤胃液于2 mL离心管中，在10 000 r·min-1离心15 min，再取离心后的上清液1.25 mL于2 mL离心管中，加入0.25 mL的25%偏磷酸溶液，充分混匀，在10 000 r·min-1离心15 min，取上清液于进样瓶中，采用自动进样针吸取0.4 μL注入气相色谱仪进行分析，得到VFA样品色谱图，采用峰面积外标法计算样品中各种挥发性脂肪酸的含量[11]。
1.6.5 瘤胃微生物检测1.6.5.1 DNA提取 采用试剂盒法提取瘤胃液中的细菌DNA，提取步骤严格参照说明书执行。DNA样品先用1%琼脂糖凝胶电泳定性检测，然后用分光光度计检测DNA样品的浓度和纯度。符合上机建库要求的DNA样本送至北京奥维森基因科技有限公司进行测序。
1.6.5.2 Illumina MiSeq测序 选取细菌的V3-V4区，利用Illumina Miseq PE300高通量测序平台进行双尾测序。引物及反应程序参照Qiu等[12]报道的方法。
1.6.5.3 数据分析处理 经过双尾测序的下机数据采用QIIME(v 1.9.0)软件根据Barcode序列拆分样本，使用FLASH(v1.2.11)软件对原始数据进行过滤和拼接，去除评分低于20、碱基模糊、引物错配的序列。引物序列长度控制在250~500 bp之间。借助USEARCH(v11.0.667)软件采用UPARSE算法对优质序列进行OTU(Operational Taxonomic Units)聚类，相似性设定为97%。与SILVA 128数据库进行比对后，利用RDP过滤器基于70%的置信阈值获取每个OTU对应的物种分类信息。利用Mothur软件(v 1.31.2) 进行α多样分析，β多样性利用R语言基于Bray-Curtis距离做主坐标分析(PCoA)、采用Vegan包进行相似性分析(ANOSIM)。
1.7 数据统计和分析所有试验数据利用SPSS 22.0软件采用独立样本T检验，显著水平规定为P＜0.05。
2 结果 2.1 瘤胃发酵特性由表 2可知，C组和H组的乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸和总挥发性脂肪酸含量以及乙丙比均无显著差异(P＞0.05)，瘤胃pH、NH3-N和MCP浓度在H组和C组间也没有显著差异(P＞0.05)。
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表 2 日粮不同能量水平对湖羊瘤胃发酵特性的影响 Table 2 Effects of different dietary energy levels on rumen fermentation characteristics of Hu sheep |
在本次瘤胃液样本16S rRNA测序得到的优质序列中，99.8%的优质序列分布在400~440 bp，覆盖率均在99%以上，这表明本次样本的测序量和测序深度合理，测序结果可信。从表 3可知，C组的Chao 1、Observed species、PD whole tree和Shannon指数显著高于H组(P＜0.05)，但两组在Simpson指数上无显著差异(P=0.114)。
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表 3 日粮不同能量水平对湖羊瘤胃菌群α多样性指数的影响 Table 3 Effects of different dietary energy levels on α-diversity metrics of rumen bacteria of Hu sheep |
表 4展示了日粮不同能量水平饲喂下湖羊瘤胃细菌在门水平上的相对丰度。由表可知，本试验条件下瘤胃细菌的主要门有拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)，分别占据66.82%、28.19%和2.90%。C组疣微菌门(Verrucomicrobiota)、螺旋体门(Spirochaetota)、互养菌门(Synergistetes)和蓝藻门(Cyanobacteria)的相对丰度显著高于H组(P＜0.05)。
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表 4 日粮不同能量水平对湖羊瘤胃细菌门水平相对丰度的影响 Table 4 Effects of different dietary energy levels on relative abundance of rumen bacteria at phylum level of Hu sheep |
瘤胃微生物属水平上相对丰度大于0.5%的物种列于表 5。属水平上的普雷沃菌属(Prevotella)、克里斯滕森菌科R-7群(Christensenellaceae R-7 group)和理研菌属科RC9肠道群(Rikenellaceae RC9 gut group)相对丰度最高，分别占据46.63%、6.41%和5.76%，但组间差异均不显著(P＞0.05)。H组的瘤胃球菌属(Ruminococcus)和厌氧弧菌属(Anaerovibrio)相对丰度显著高于C组(P＜0.05)。
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表 5 日粮不同能量水平对湖羊瘤胃细菌属水平相对丰度的影响 Table 5 Effects of different dietary energy levels on relative abundance of rumen bacteria at genus level of Hu sheep |
相似性分析(ANOSIM)结果显示，H组和C组间的R值为0.7852，P值为0.004，说明H组和C组间差异显著。通过主坐标分析(PCoA)发现，各组间有明显的聚集(图 1)。
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图 1 基于Bray-Curtis距离的主坐标分析(PCoA) Fig. 1 Principal coordinates analysis (PCoA) based on Bray-Curtis distance |
瘤胃中复杂的微生物组成和生态位分布在饲料发酵和能量代谢中起着关键作用[13]。瘤胃pH是衡量瘤胃内环境变化的一项重要指标，受到日粮原料、营养水平、环境等因素的影响。正常情况下瘤胃液pH的波动范围为5.5~7.5 [14]，瘤胃中的pH会影响瘤胃微生物对底物的利用效率，当瘤胃pH＜6.2时微生物合成蛋白质的效率下降[15]。本试验中，随着饲粮能量水平的提高，瘤胃pH在数值上出现下降，但均在正常范围内且维持在6.2以上，这说明两种试验日粮均比较适宜瘤胃微生物的生长。Rabelo等[16]研究发现，日粮能量水平的提高会降低奶牛瘤胃pH，这是因为饲喂高能量日粮后瘤胃中的总VFA会快速积累，进而导致瘤胃pH的下降。在实践生产中，饲粮精粗比对瘤胃pH影响很大，精料中可快速发酵的非结构性碳水化合物含量高，当饲粮中精料比例提高时，瘤胃pH会随之降低[17]。霍路曼等[18]的研究也发现，随着日粮能量水平的提高，瘤胃pH在数值上表现为下降。
瘤胃中NH3-N浓度也是评价瘤胃内环境和发酵状况的常用参数，反映的是日粮中蛋白质的降解程度与微生物蛋白合成代谢间所达到的动态平衡[19]。NH3-N在瘤胃中的适宜浓度范围为5.0~30 mg·dL-1，过高或者过低时，都不利于瘤胃微生物的生长，过高造成氮浪费，甚至引起动物氨中毒，过低会阻碍瘤胃微生物蛋白的合成[20]，导致动物生长速度缓慢，生产性能降低。张海波和王之盛[21]报道，随着精料能量水平的提高，高能组肉牛瘤胃NH3-N浓度低于低能组，本试验发现，提高能量水平只在数值上降低NH3-N浓度，这可能是高能日粮可提供充足的能量、促进微生物对NH3-N的利用，进而使得瘤胃液中的NH3-N浓度下降，但这种促进作用有限，不足以达到显著水平。在本试验中，日粮中不同的能量水平对单种VFA、总VFA及乙丙比均没有显著影响，只在数值上有所差异。VFA是反刍动物发酵饲料后的主要产物和能量利用形式，可为反刍动物提供所需能量的70%左右[22]，日粮中的纤维性碳水化合物和非纤维性碳水化合物发酵的主要产物分别是乙酸和丙酸，两者产量之和占到总VFA的75%以上，因此乙酸和丙酸在反刍动物生产中有着重要的意义[23]。随着日粮能量水平的提高，乙酸浓度在数值上降低，主要是因为高能日粮中的纤维性碳水化合物含量较低，Wang等[24]在饲喂高能日粮的肉牛瘤胃中也发现乙酸浓度比低能日粮低。在本研究中，与C组相比，H组的乙酸、丙酸和总VFA浓度在数值上较低，这可能是高能日粮中谷物含量较高，消化吸收速度更快[25]，从而导致在屠宰前的禁食期间下降速度更快，使得最终浓度更低[26]。
3.2 日粮能量水平对湖羊瘤胃菌群α多样性的影响α多样性指标可用于反映特定样本或单个群落中物种的丰富度和均匀度[27]。本研究借助Illumina MiSeq PE300测序平台研究了日粮能量水平对湖羊瘤胃菌群α多样性的影响，试验得到的稀释曲线已趋于平缓到达平台期，表明样本的测序量和测序深度合理，测序结果可以进行后续的研究。Chao 1和Observed species反映的是微生物群落的丰富度。在本试验中，随着日粮能量水平的增加，两者数值均降低，说明高能日粮会降低瘤胃微生物的丰富度，这与Qiu等[12]的研究结果一致。Shannon指数反映的是微生物群落的均匀度，H组的该指数显著低于C组，这说明饲喂高能日粮会降低瘤胃微生物群落的均匀度，这与上述研究结果也一致。本试验出现瘤胃发酵特性差异不显著，但微生物多样性存在差别的现象，这与Palmonari等[28]的研究发现细菌群落组成上的相似性不一定意味着瘤胃发酵特性也相似的现象是一致的。
3.3 日粮能量水平对湖羊瘤胃微生物组成的影响目前多数研究均发现，拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)在成年反刍动物瘤胃菌群中的门水平上占比最高[12, 29]。本试验共发现10个门的相对丰度在0.1%以上，其中以拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门(Proteobacteria)这3个门的相对丰度最高，分别占据66.8%、28.2%和2.9%。拟杆菌门作为第一优势菌门在C组中的相对丰度为70.26%，数值上高于H组中的63.37%。H组中厚壁菌门的丰度在数值上较高是因为H组的瘤胃pH较低，而之前的研究发现，较低的瘤胃pH增加了厚壁菌门在细菌组成中的比例[30]。变形菌门的相对丰度在门水平上仅次于拟杆菌门和厚壁菌门，但含量远低于这两种门，这与Fernando等[31]的研究一致。Pitta等[32]发现，变形菌门在瘤胃淀粉分解中起着重要作用，本试验中的H组淀粉含量较C组高，因此会出现H组中变形菌门的相对丰度在数值上高于C组。疣微菌门(Verrucomicrobiota)和螺旋体门(Spirochaetota)对于纤维素的降解有着重要的作用[33]，由于C组中的粗料比例高于H组，日粮中的高纤维含量会使得纤维分解菌的含量上升，这解释了C组中这两个门的相对丰度较高。
在属水平上发现10个相对丰度在1%以上的属，其中以普雷沃菌属(Prevotella)和克里斯滕森菌科R-7群(Christensenellaceae R-7 group)的相对丰度最高，分别占据46.6%和6.4%，然而日粮能量水平并未对这两种属的相对丰度造成影响。之前的研究发现，普雷沃菌属在瘤胃微生物中占比最高且可达瘤胃细菌数量的30%左右[12]，本试验发现，该属在H组中的相对含量高达48.6%，这可能是本试验中的高能日粮精粗比较高，因为该属主要参与非纤维性碳水化合物和蛋白质的代谢[34]。瘤胃球菌属(Ruminococcus)是瘤胃球菌科的一个属，Liu等[35]报道称，瘤胃球菌属在高精料日粮下的相对丰度更高，并推测该属可能参与瘤胃中淀粉的分解，本试验的高能组饲粮淀粉含量较高，因此会出现H组瘤胃球菌属相对丰度比C组更高。厌氧弧菌属(Anaerovibrio)是反刍动物瘤胃内参与脂质水解的主要菌属，可将甘油三酯水解为甘油和脂肪酸[36]。本试验H组的粗脂肪含量较C组高，因此会出现H组的厌氧弧菌属的相对丰度高于C组。
4 结论在本试验条件下，日粮能量水平的提高对湖羊瘤胃发酵特性没有显著影响，但会降低瘤胃微生物的丰富度和均匀度，并影响部分菌属的相对丰度。
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(编辑 范子娟)