2. 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，兰州 730050
, GE Wenbo2, DUAN Hongwei1, LÜ Jianshu1, ZENG Jianlin1, WANG Wenjuan1, NIU Tian1, ZHANG Yong1, ZHAO Xingxu1, HU Junjie1
2. Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Sciences of CAAS, Lanzhou 730050, China
孕酮(progesterone, P4)和雌二醇(oestrogen, E2)是妊娠建立和维持所需的重要类固醇激素，同时P4和E2也控制着子宫植入窗口期的开始和结束[1-3]。在黄体期P4分泌增加，能够抑制子宫内膜上皮细胞(endometrial epithelium cells, EEC)的增殖，并诱导间质细胞分化并改变其生理形态和功能[4]。也可调节干扰素刺激因子和组织蛋白酶L等下游因子，激活MAPK和PI3K通路，促进子宫腺体的发育[5-6]。E2也是子宫中必需的调节激素，E2能够通过胰岛素样生长因子受体激活PI3K/Akt信号通路，促进上皮细胞增殖，提供营养，调节子宫功能[7]。而在敲除雌激素受体(ERα和ERβ)的雌性动物中出现卵巢损伤、子宫发育不良和胚胎植入率下降[5]。
双氢睾酮(dihydrotestosterone, DHT)是由睾酮(testosterone, T)在5α-还原酶(5α-red1和5α-red2)不可逆地催化生成的一种重要类固醇激素，具有与雄激素受体(androgen receptor, AR)更高的亲和力，因此被认为是比T更有效的雄激素[8]。研究表明，DHT增强了P4诱导的人类子宫蜕膜化细胞的超微结构变化，并增加了猪卵巢中ERα的表达和子宫中ERβ的表达[9-10]。此外，在人子宫内膜基质细胞中，DHT和P4发挥相似作用，均以浓度依赖的方式促进细胞凋亡发生，并且DHT和P4的这种促凋亡反应可被E2拮抗[11]。细胞凋亡是由B细胞淋巴瘤蛋白2(B cell lymphoma protein 2, Bcl-2)和半胱天冬酶家族控制，并由Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X protein, Bax)/ Bcl比率决定细胞凋亡敏感性[12]。在对黄体退化的研究中发现，DHT显著减少了Bax和半胱天冬酶3(caspase 3, CASP3)的表达，抑制黄体细胞凋亡[13]。然而，DHT是否通过影响反刍动物EEC的凋亡而影响子宫生理功能，尚未见系统报道。
因此，本试验以小尾寒羊为研究对象，检测不同子宫时期DHT合成酶及受体表达，并用不同浓度的DHT(10-10~10-7 mol·L-1)和AR抑制剂氟他胺(flutamide, Flu)处理体外培养的绵羊EEC，检测P4和E2水平、合成酶及受体的表达。同时检测相关凋亡因子表达。为阐明DHT是否通过调节P4、E2和细胞凋亡影响子宫功能提供新数据。
1 材料与方法 1.1 主要试剂和抗体牛血清白蛋白(BSA，SW3015)、TRIzol(R1100)和RIPA裂解液(R0010)均购于Solarbio公司，显影液、定影液和ECL发光液均购于Beyotime公司，胎牛血清(FBS)和DMEM/F12培养基(SH30023.01)均购于Hyclone公司，两步法反转录试剂盒购于Promega公司，DHT和Flu标准品购于Sigma公司，P4(TY98251)和E2(TY98241)ELISA试剂盒购于上海颖心。抗体：5α-red1(bs-11308R)、5α-red2(bs-6700R)、类固醇合成急性调节蛋白(StAR，bs-3570R)、细胞色素P450侧链裂解酶(P450 scc，bs-10099R)、芳香化酶(P450arom，bs-0114M)、孕酮受体(PGR，bs-23376R)、G蛋白偶联雌激素受体(GPER，bs-1380R)、活化半胱天冬酶3(Act-CASP3，bs-0081R)、β-actin(bs-0061R)以及二抗(bs-0295G-HRP和bs-40296G-HRP)均购于北京Bioss；ERα(ab-66102)、ERβ(ab-3576)、AR(ab-3509)均购于英国Abcam；Bax(T40051)、Bcl-2(T45006)均购于上海Abmart。
1.2 样品收集小尾寒羊，年龄约1.5岁，体重约25~35 kg。在当地屠宰场收集卵泡期(n=8)、黄体期(n=6)和妊娠期(n=5)的正常子宫，放置在35~37 ℃含有青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)中运回实验室。在冰上用手术刀分离不同时期的子宫角，PBS清洗3次，－80 ℃下储存。
1.3 子宫内膜上皮细胞培养与处理根据文献[14]，体外培养卵泡期绵羊子宫内膜上皮细胞。使用DMEM/F12培养基培养，48 h更换1次，直到细胞密度约85%~90%。处理前添加不含FBS的DMEM/F12培养基12 h。为研究DHT对P4和E2相关蛋白及子宫凋亡的影响，将终浓度为10-10~10-7 mol·L-1的DHT和10-8mol·L-1 Flu加入无血清DMEM/F12培养基中24 h。
1.4 酶联免疫吸附试验(ELISA)根据ELISA试剂盒说明书，检测经Flu和不同浓度DHT处理的上皮细胞上清液中P4和E2的浓度，上清液通过0.45 mm过滤器过滤。试剂盒最低检测浓度P4小于0.1 ng·mL-1，E2小于1.0 pg·mL-1，板内变异系数小于10%、板间变异系数小于15%。P4含量以ng·mL-1表示，E2含量以pg·mL-1表示。
1.5 细胞鉴定与细胞免疫荧光用免疫荧光法检测细胞角蛋白18、5α-还原酶和AR在绵羊子宫内膜上皮细胞中的表达。将培养的内膜细胞固定在载玻片上后，PBS洗涤，并用5 mL 4%(V/V)多聚甲醛固定，并在－20 ℃下保存。使用时，在4 ℃下用PBS洗涤，用0.1%(V/V)曲拉通处理30 min，然后用5%(V/V)BSA孵育30 min。一抗孵育(角蛋白18和5α-还原酶，1∶300；AR，1∶200)。阴性对照用2%的BSA代替一级抗体孵育。使用FITC偶联的山羊抗兔IgG抗体进行检测(1∶200)，然后使用1 μg·mL-1 4, 6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)进行核重复染色拍照。
1.6 总RNA提取及qRT-PCR通过TRIzol处理组织和细胞沉淀样品，释放总RNA。用微量核酸分析仪测定吸光度A260 nm/A280 nm值，电泳检测RNA纯度和完整性。使用prime script RT试剂盒和gDNA橡皮擦反向转录获得cDNA。检测不同部位和培养细胞中5α-red1、5α-red2、AR、StAR、P450 scc、3β羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD)、P450arom、PGR、ERα、ERβ、Bax、Bcl-2和CASP3，以β-actin为参考基因。设定条件为95 ℃ 300 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共45个循环。结果由2-ΔCt计算得出[15]。引物序列见表 1。
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表 1 目的基因与内参基因引物序列 Table 1 Primers sequence of target genes and house-keeping gene |
向样品中加入RIPA蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂PMSF，充分裂解，12 000×g，4 ℃离心15 min。提取总蛋白，并使用BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度。然后将收集的蛋白质上清液加入5×蛋白上样缓冲液中，充分混合，在98 ℃变性15 min，－20 ℃储存。使用实验室改良的Western blot技术[13]，该技术使用SDS-PAGE分离蛋白质，并转移到PVDF膜。用1×TBST冲洗，5%脱脂奶粉的TBST密封1 h。经一抗4 ℃孵育24 h，其中5α-red1、5α-red2、StAR、P450 scc、P450arom、PGR、GPER和Act CASP3均为1∶500配制，ERα、ERβ和AR均为1∶1 000配制，Bax和Bcl-2均为1∶1 500配制，以β-actin(1∶4 000)为内参，膜与辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1∶4 000)37 ℃共孵育1 h。用增强化学发光溶液检测免疫复合物，并用ImageJ定量表达。
1.8 数据分析使用SPSS 24.0软件(美国IBM公司)进行统计分析。所有数据均以“平均值±标准误(Mean±SEM)”表示，并进行正态性和同方差检验、单因素方差分析和邓肯多重检验。如果P＜0.05，则差异显著。
2 结果 2.1 体外培养的EEC的鉴定及5α-red1、5α-red2和AR的表达和定位如图 1所示，通过免疫荧光染色检测细胞角蛋白18的表达，结果显示细胞角蛋白18在细胞质中表达。5α-red1、5α-red2和AR在EEC的细胞质和细胞核中表达。
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a~c. Cytokeratin 18的表达；d~i. DHT合成酶5α-red1和5α-red2的表达；j~l. AR的表达；m~o.阴性对照 a-c. Expression of cytokeratin 18; d-i. Expression of DHT synthetase 5α-red1 and 5α-red2; j-l. Expression of AR; m-o. Negative control 图 1 绵羊子宫内膜上皮细胞鉴定及DHT合成酶和雄激素受体AR的免疫荧光分析(200×) Fig. 1 Sheep EEC identification and DHT synthetase and AR immunofluorescence analysis(200×) |
DHT合成酶5α-red1、5α-red2和AR在子宫不同阶段的表达水平如图 2A~C。5α-red1、5α-red2和AR在妊娠子宫中的mRNA及蛋白表达明显低于卵泡期子宫和黄体期子宫(P＜0.05)。
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A.5α-red1、5α-red2和AR相对mRNA水平；B.5α-red1、5α-red2和AR蛋白质免疫印迹；C.5α-red1、5α-red2和AR的相对蛋白水平。不同小写字母之间差异显著(P＜0.05)，相同字母之间差异不显著(P＞0.05), 下同 A.Relative mRNA levels of 5α-red1, 5α-red2 and AR; B.Western blot of 5α-red1, 5α-red2 and AR; C.Relative protein levels of 5α-red1, 5α-red2 and AR. There was significant difference between different lowercase letters (P < 0.05), and there was no significant difference between the same letters (P > 0.05), the same as below 图 2 绵羊子宫不同时期5α-red1、5α-red2和AR表达 Fig. 2 Expression of 5α-red1, 5α-red2 and AR in sheep uterus at different stages |
为了检测DHT是否通过AR发挥作用，添加不同浓度DHT(10-10~10-7 mol·L-1)体外培养绵羊子内膜上皮细胞。结果如图 3，在10-8~10-7 mol·L-1时，AR mRNA的表达显著高于对照组和10-10mol·L-1组(P＜0.05)。在10-8~10-7 mol· L-1时，AR蛋白表达显著高于对照组和10-10~10-9 mol·L-1组(P＜0.05)。
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A.AR相对mRNA水平；B.AR蛋白质印迹；C.AR的相对蛋白水平 A. AR relative mRNA levels; B. AR Western blot; C. AR relative protein levels 图 3 DHT对体外培养的绵羊子宫内膜上皮细胞中AR表达的影响 Fig. 3 Effect of DHT on AR expression of sheep EEC in vitro |
在DHT(10-8~10-7mol·L-1)时，P4水平显著升高(P＜0.05，图 4A)。对照组和处理组(10-10~ 10-7 mol·L-1)的P4平均浓度分别为(12.66±0.54)、(12.93±0.29)、(13.32±0.32)、(14.95±0.44)和(16.03±0.31) ng·mL-1。此外，还检测P4合成酶StAR、P450 scc、3β-HSD和PGR的表达(图 4B~D)。结果发现，StAR蛋白和mRNA的表达以浓度依赖的方式增加，P450 scc蛋白和mRNA的表达也上调，在10-7 mol·L-1 DHT时最为显著(P＜0.05)。DHT对3β-HSD mRNA表达的上调在10-8 mol·L-1时最为显著(P＜0.05)。PGR mRNA表达在10-10~10-9和10-7 mol·L-1 DHT上调，而PGR蛋白表达在10-10~10-8 mol·L-1 DHT上调，但在10-7 mol·L-1 DHT下调(P＜0.05)。
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A.孕酮水平；B.StAR、P450 scc、3β-HSD和PGR的相对mRNA水平；C.StAR、P450 scc和PGR的蛋白质免疫印迹；D.StAR、P450 scc和PGR的相对蛋白水平 A.P4 levels; B.Relative mRNA levels of StAR, P450 scc, 3β-HSD and PGR; C. Western blot of StAR, P450 scc and PGR; D. StAR, P450 scc and PGR relative protein levels 图 4 DHT对EEC中P4合成和PGR表达的影响 Fig. 4 Effects of DHT on P4 synthesis and PGR expression in EEC |
为探索DHT对P4的影响是否由AR介导，添加了10-8 mol·L-1 Flu。结果显示，添加Flu的处理组较DHT处理组的P4水平显著降低(P＜0.05，图 5A)。对照组和处理组的P4平均浓度分别为(13.59±0.39)、(14.95±0.44)、(13.74±0.35)和(13.13±0.10) ng·mL-1。StAR、P450 scc、3β-HSD和PGR的表达，如图 5B~D所示。在mRNA表达方面，添加10-8 mol·L-1 DHT和10-8 mol·L-1 Flu显著抑制StAR、P450 scc、3β-HSD和PGR的表达(P＜0.05)。然而，蛋白表达中，只有StAR的表达被Flu阻断(P＜0.05)，P450 scc和PGR的表达并未减少，反而P450 scc的表达在添加10-8mol·L-1 DHT和10-8mol·L-1 Flu时表达增加(P＜0.05)。
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A.孕酮水平；B.StAR、P450 scc、3β-HSD和PGR的相对mRNA水平；C.StAR、P450 scc和PGR的蛋白质免疫印迹；D.StAR、P450 scc和PGR的相对蛋白水平 A.P4 levels; B.Relative mRNA levels of StAR, P450 scc, 3β-HSD and PGR; C. Western blot of StAR, P450 scc and PGR; D. StAR, P450 scc and PGR relative protein levels 图 5 添加Flu对EEC中P4合成和PGR表达的影响 Fig. 5 Effects of addition of Flu on P4 synthesis and PGR expression in EEC |
结果表明，10-8~10-7 mol·L-1 DHT时，E2水平显著降低，在10-8 mol·L-1 DHT时最显著(P＜0.05，图 6A)。对照组和处理组的E2平均浓度分别为(155.30±4.23)、(151.18±2.37)、(143.62±0.57)、(121.75±2.54)和(130.38±3.69) pg·mL-1。添加10-10~10-7 mol·L-1 DHT可降低P450arom和ERα mRNA和蛋白质的表达，且差异显著(P＜0.05)。然而，DHT促进了ERβ和GPER的表达，在10-9~10-7 mol·L-1 DHT时显著上调(P＜0.05)。
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A.雌二醇水平；B. P450arom、ERα、ERβ和GPER的相对mRNA水平；C. P450arom、ERα、ERβ和GPER的蛋白质免疫印迹；D. P450arom、ERα、ERβ和GPER的相对蛋白水平 A.E2 levels; B.Relative mRNA levels of P450arom, ERα, ERβ and GPER; C.Western blot of P450arom, ERα, ERβ and GPER; D.P450arom, ERα, ERβ and GPER relative protein levels 图 6 DHT对EEC中E2合成及雌激素受体表达的影响 Fig. 6 Effects of DHT on E2 synthesis and oestrogen receptor expression in EEC |
添加Flu结果显示，E2水平的降低被阻止，且差异显著(P＜0.05，图 7A)。对照组和处理组的E2水平分别为(157.09±1.25)、(120.23±0.51)、(140.02± 0.14)、(141.70±3.05) pg·mL-1。P450arom、ERα、ERβ和GPER的表达如图 7B~D所示。结果表明，10-8 mol·L-1 DHT降低了P450arom和ERα mRNA和ERα蛋白质的表达。这种下降被10-8mol·L-1 Flu部分阻断(P＜0.05)，也部分阻断了ERβ mRNA和GPER蛋白表达的增加(P＜0.05)。
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A.雌二醇水平；B. P450arom、ERα、ERβ和GPER的相对mRNA水平；C. P450arom、ERα、ERβ和GPER的蛋白质免疫印迹；D. P450arom、ERα、ERβ和GPER的相对蛋白水平 A.E2 levels; B.Relative mRNA levels of P450arom, ERα, ERβ and GPER; C.Western blot of P450arom, ERα, ERβ and GPER; D.P450arom, ERα, ERβ and GPER relative protein levels 图 7 添加Flu对EEC中E2合成和雌激素受体表达的影响 Fig. 7 Effects of addition of Flu on E2 synthesis and oestrogen receptor expression in EEC |
为探索DHT对绵羊子宫内膜上皮细胞体外凋亡的影响，相关凋亡因子Bax、Bcl-2、CASP3和Act-CASP3的表达如图 8A~C。结果表明，随着DHT浓度的增加(10-10~10-7 mol·L-1)，Bax mRNA和蛋白表达增加，CASP3 mRNA和Act-CASP3蛋白表达增加(P＜0.05)。10-10和10-9 mol·L-1 DHT分别增加Bcl-2的mRNA和蛋白表达。但10-9和10-7 mol·L-1 DHT降低了Bcl-2 mRNA表达(P＜0.05)。10-10~10-7mol·L-1 DHT上调Bax/Bcl-2比值。凋亡敏感性增加。
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A.Bax、Bcl-2、Bax/Bcl-2和CASP3相对mRNA水平；B.Bax、Bcl-2和Act-CASP3的蛋白质免疫印迹；C.Bax、Bcl-2和Act-CASP3的相对蛋白水平 A. Relative mRNA levels of Bax, Bcl-2, Bax/Bcl-2 and CASP3; B. Western blot of Bax, Bcl-2 and Act-CASP3; C. Relative protein levels of Bax, Bcl-2, and Act-Casp3 图 8 不同浓度DHT对EEC中相关凋亡因子的影响 Fig. 8 Effects of different concentrations of DHT on apoptosis-related factors of EEC |
为检测DHT对凋亡的影响是否由AR介导，添加Flu检测体外培养的绵羊EEC的凋亡相关因子变化(图 9A~C)。结果显示，10-8mol·L-1 Flu部分阻断了10-8 mol·L-1 DHT对Bax、CASP3和Act-CASP3 mRNA和蛋白表达的增加(P＜0.05)，而对Bcl-2的mRNA和蛋白表达没有影响。Bax/Bcl-2的表达被10-8 mol·L-1 Flu部分阻断，显著低于10-8mol·L-1 DHT(P＜0.05)。
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A.Bax、Bcl-2、Bax/Bcl-2和CASP3相对mRNA水平；B.Bax、Bcl-2和Act-CASP3的蛋白质免疫印迹；C.Bax、Bcl-2、和Act-CASP3的相对蛋白水平 A. Relative mRNA levels of Bax, Bcl-2, Bax/Bcl-2 and CASP3; B. Western blot of Bax, Bcl-2 and Act-CASP3; C. Relative protein levels of Bax, Bcl-2, and Act-CASP3 图 9 添加Flu对EEC中相关凋亡因子的影响 Fig. 9 Effects of Flu addition on apoptosis-related factors of EEC |
DHT参与调节子宫功能[16-18]。本研究中，5α-red1、5α-red2和AR在绵羊EEC中表达，这与人、猪、大鼠和小鼠的结果一致[19-22]，表明绵羊子宫内膜细胞能够合成和利用DHT。在绵羊子宫不同时期DHT合成酶和AR表达存在差异。妊娠期子宫中DHT合成和AR表达最低。这表明DHT可能在不同阶段发挥不同的生物学作用，例如黄体退化[13]。已有证据表明，DHT在小鼠子宫中调节子宫内膜周期，并严格控制G1/S和G2/M细胞，触发转率级联，调控子宫细胞生长[16]。此外，本试验还检测了DHT对EEC中AR的影响。结果显示，高浓度DHT可能通过配体-受体效应促进AR的表达。在雌性动物中，缺乏AR可能会导致多种妊娠疾病，如子宫内膜异位症和反复流产[23]。这些证据充分表明DHT通过AR影响子宫功能。
DHT和P4在子宫中可能发挥相似的生物学功能，P4的生物学作用需要其特异性受体PGR介导[11, 24-25]。本试验发现，DHT可促进P4合成酶StAR和P450 scc基因和蛋白的表达，这可能会增加子宫中P4的浓度，从而发挥生理作用。研究表明，子宫内的P4可拮抗E2，促进膜细胞凋亡，并降低子宫重量[11]。同时，AR抑制剂Flu可以阻断P4合成酶的增加，表明DHT至少部分通过AR介导调节P4合成。此外，DHT也显著增加PGR的蛋白表达，但在高浓度下抑制了这种增加，这与DHT处理子宫内膜外植体和体外Ishikawa细胞的结果一致[26]。Flu阻断了PGR的上调，表明DHT对PGR的上调也部分依赖于AR的介导作用。研究表明，P4和PGR的增加能够有效的减弱子宫收缩，从而减少因子宫过度蠕动而引起的子宫内膜异位症，还可促进胚胎植入[27]。此外，DHT对P4的调节可能是宫内腺体形成的一个重要机制[28]。这些证据表明，DHT在子宫中能够调节P4合成，进而调控子宫的正常生理环境。
E2也是调节子宫内环境的重要参与者，能够调节子宫内膜增殖、分化、脱落和再生周期[29-32]。DHT影响E2的合成，在本试验中，DHT减少P450arom的合成可被Flu阻断，表明至少部分通过AR介导，E2浓度与此结果一致。研究表明，DHT可以拮抗E2诱导的子宫内膜细胞增殖和蜕膜化[11]。结合本试验可推测，DHT和P4可能在促进子宫细胞凋亡中发挥类似的作用。此外，DHT对ERα和ERβ有调控作用，DHT增加了子宫中的ERβ，但降低了ERα的表达，这与猪的结果相似[10]。在对AR和ER的基因分析中显示，AR和ER可能共享类似的控制基因片段或上游调节器或串扰效应[28, 33-34]。这部分解释了DHT对ERβ的促进作用，并且DHT也可能通过ERβ介导发挥作用。此外，DHT增加颗粒细胞中的ERα和ERβ，但下调E2合成酶P450arom的表达[35]。结合本试验，推测认为在子宫中DHT发挥生物学功能不仅通过基因组和非基因组途径，还通过其它途径。DHT上调GPER，这种上调没有被Flu阻断，这表明DHT上调GPER可能不是由AR介导的。
细胞凋亡受Bcl-2家族和caspase家族调控[36-38]。在本试验中，DHT增加了Bax的表达，降低了Bcl-2的水平，增加了Bax/Bcl-2的比率。这表明DHT促进子宫内膜细胞凋亡。在子宫内膜基因组分析中，DHT可通过伴侣蛋白HSP105和叉头框蛋白1促进细胞凋亡[16, 19]。但在黄体细胞中，DHT抑制了黄体细胞凋亡，这种差异可能和参与不同生理功能有关[13, 39]。在本试验中，DHT还上调Act-CASP3蛋白和CASP3基因的表达。而在添加Flu后，Bax、Act-CASP3和CASP3的表达下调，表明AR至少部分参与介导。推测，这种DHT在子宫中促进细胞凋亡，可能与防止子宫内膜异常增生有关。有趣的是，在去卵巢小鼠中，DHT增加了子宫重量、子宫内膜和子宫肌层的横截面积[28]。此外，DHT可以恢复类固醇耗尽的子宫功能[40]。DHT这种促进或抑制凋亡的生物学作用是否与卵巢切除有关，DHT是否在子宫中部分代替P4和E2发挥作用，值得今后进一步研究。
4 结论DHT的合成和AR的表达在绵羊子宫的不同阶段存在差异。此外，DHT至少部分通过AR调控P4和E2合成、受体表达以及EEC凋亡，并参与子宫生理功能的调节。本研究为雄激素参与调节子宫功能机制提供新的数据和基础。
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(编辑 孟培)