鼻腔是呼吸道的重要结构之一，发挥着预热空气、分辨气味、过滤灰尘、辅助发声等功能[1]。由于呼吸道与外界直接相通，外界环境中的有害气体、致病微生物等易侵入呼吸道内，引起呼吸系统疾病。有研究表明，鼻腔免疫能够提供对多种细菌、病毒等黏膜致病原侵袭的保护，通过鼻腔免疫能够在呼吸道诱导高效的免疫应答从而预防呼吸系统疾病，也能在远端黏膜部位产生免疫反应，诱导机体全身免疫应答[2-4]。分泌IgA和IgG的浆细胞作为鼻腔免疫中参与免疫应答的两类重要的效应细胞，所分泌形成的分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A，SIgA)和IgG抗体在机体抵抗病原微生物入侵中发挥着重要的功能[5]。其中，SIgA作为黏膜免疫中重要的效应分子，发挥着免疫清除、调节微生态平衡、诱发免疫耐受、抑制炎症和过敏反应、中和病毒及抵御病原菌在黏膜上皮黏附的功能，是机体黏膜免疫的第一道防御屏障[6-7]。IgG是体液免疫中最重要的抗体，具有吞噬、凝集、沉淀抗原和中和毒素的作用，可被相应受体转运至气道腔分泌物中，发挥黏膜免疫清除功能；IgG也作为黏膜免疫的第二道防御屏障，当第一道屏障在各种因素作用下被破坏即将有病原入侵时发挥着重要的作用[8-9]。因此，研究鼻腔中分泌IgA和IgG的浆细胞的分布规律在预防呼吸系统疾病中具有重要意义。
家兔作为重要的经济动物，肉质细嫩味美，营养价值高，深受消费者青睐，长期摄取兔肉能够预防心脏病、动脉粥样硬化[10]。然而，在家兔养殖中，消化系统和呼吸系统疾病是危害养兔业发展的两类重要疾病，其中呼吸系统疾病占20%以上[11]。鼻腔免疫具有生物利用度高、避免肝的首过效应、引发免疫反应迅速等优点，能够在呼吸道诱导高效的免疫应答来预防呼吸道疾病，并已有相应的实例[12]，这将为家兔养殖中呼吸系统疾病的预防提供一定的参考。
目前，关于分泌IgA和IgG的浆细胞分布的研究大多是在胃肠黏膜[13-16]，有部分研究也涉及扁桃体等部位[17]，在呼吸道黏膜中的研究相对较少[18-19]，研究对象已涉及双峰驼[13-15, 17]、家兔[16]、猪[3]、鸡[18]、黄牛[19]等动物。然而，家兔作为常用的实验动物，关于分泌IgA和IgG的浆细胞在家兔鼻腔中的分布特点仍不清楚。因此，本试验是在课题组研究家兔鼻腔的形态学特点及鼻黏膜相关淋巴组织(nose-associated lymphoid tissue，NALT)分布规律的基础上，运用组织学、免疫组织化学、图像分析及统计学方法，对分泌IgA和IgG的浆细胞在家兔鼻腔中的分布特征进行了详细的研究，旨在阐明家兔鼻腔中分泌IgA和IgG的浆细胞的分布特征、鼻腔不同段与不同部位两类效应细胞的分布规律，将为家兔呼吸系统疾病的预防及进一步研究家兔鼻腔免疫应答的机制提供重要的理论依据，也为其他动物鼻腔免疫的研究提供有价值的理论参考。
1 材料与方法 1.1 试验动物健康成年家兔20只(均购自兰州市)，雌雄各半，平均体重为(2.5±0.3) kg。
1.2 主要试剂与仪器主要试剂：10% EDTA脱钙液；多聚赖氨酸；0.1%胰蛋白酶；山羊抗兔IgA多克隆抗体(一抗，ab97186，abcam)；生物素标记驴抗山羊IgG多克隆抗体(二抗，博奥森)；小鼠抗兔IgG单克隆抗体(一抗，R2655，SIGMA)；生物素标记山羊抗小鼠IgG多克隆抗体(二抗，博士德)；浓缩型DAB试剂盒(中杉金桥)；Harris氏苏木精染液；伊红染液等。
主要仪器：自动组织脱水机(ASP300S，Leica德国)；全自动包埋仪(EG1160，Leica德国)；轮转式切片机(HistoCore MULTICUT，Leica德国)；恒温鼓风干燥箱(DHG-9240B，上海琅玕实验设备有限公司)；OlympusDP-71显微照相系统(BX51+DP71，Olympus日本)；光学显微镜(13395H2X，Leica德国)等。
1.3 样品的采集与固定将家兔颈动脉放血致死，取其头部，将头部皮毛去掉后固定于10%的福尔马林溶液中。固定7 d去掉其下颌，除去多余结缔组织并按照下述试验方案进行样品处理：参照Uraih和Maronpot[20]的研究方法并进行完善，将去掉下颌的头部用流水冲洗24 h (去掉部分福尔马林)后冷冻于－20 ℃的冰箱12 h，以硬腭褶皱和牙齿为标志分为以下5个横断面：鼻尖到硬腭第1腭褶前端为第Ⅰ段，硬腭第1腭褶到第4腭褶为第Ⅱ段，第5腭褶到第1前臼齿前端为第Ⅲ段，第1前臼齿前端到第1后臼齿前端为第Ⅳ段，第1后臼齿前端到第3后臼齿末端为第Ⅴ段(每段长度约为1 cm)，做好相应标记后，分别进行固定。所有样品继续固定1周后，用流水冲洗各组织3 h并置于10%的EDTA脱钙液中进行脱钙，每3周更换1次脱钙液，直到组织能够轻松用大头针刺透证明钙已脱好。
1.4 家兔鼻腔分泌IgA和IgG浆细胞的免疫组织化学染色取已脱钙好的鼻腔样品，经取材、流水缓慢冲洗48 h、常规梯度酒精脱水、二甲苯透明、组织浸蜡与包埋后制成蜡块，经连续切片(厚度5 μm)、展片、贴片、烤片处理后，HE常规染色，显微镜观察家兔鼻腔的组织学结构。
本试验采用间接SABC免疫组织化学染色法。切片脱蜡至水，室温下使用3% H2O2溶液作用15 min，以去除内源性过氧化物酶活性，蒸馏水洗2 min×3次；使用0.1%胰蛋白酶修复抗原，37 ℃孵育40 min，蒸馏水洗2 min×3次；滴加5% BSA封闭，37 ℃孵育40 min，以减少非特性染色，不洗；滴加稀释后的一抗(山羊抗兔IgA多克隆抗体，稀释浓度为1∶400；小鼠抗兔IgG单克隆抗体，稀释浓度为1∶8 000)，4 ℃孵育18 h，使抗原抗体充分反应，PBS缓冲液洗5 min×4次(阳性、阴性切片分开洗，下同)，滴加二抗37 ℃孵育40 min，PBS缓冲液洗5 min×4次；滴加SABC(链霉亲和素-过氧化物酶复合物)37 ℃下孵育30 min，PBS缓冲液洗5 min×4次；室温避光进行DAB显色，光镜下观察显色效果，及时洗去多余显色液；苏木精染液轻度复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明后，使用中性树胶封片，待中性树胶凝固后，光学显微镜观察。阴性对照用0.01 mol·L－1 PBS代替一抗，其他操作与阳性切片一致。
1.5 家兔鼻腔分泌IgA和IgG浆细胞的统计分析每个组织随机选择切片5张，每10张连续切片取1张，用OlympusDP-71显微照相系统在40×10倍镜下观察切片，每张切片随机选择10个视野并拍照。用Image-Pro Plus 6.0统计每个视野内IgA与IgG阳性细胞的数量，并计算各自的细胞密度。用IBM SPSS 21.0单因素方差分析每种阳性细胞在鼻腔不同段与不同部位分布密度的差异性，结果以“平均值±标准差”表示，差异显著水平为P<0.05。
2 结果 2.1 分泌IgA的浆细胞在家兔鼻腔中的分布特征分泌IgA的浆细胞呈圆形或卵圆形，胞质丰富，核圆一般位于细胞的一侧，为典型的浆细胞样，胞质被染成强阳性，呈棕黄色。分泌IgA的浆细胞在家兔鼻腔不同段与不同部位组织中都有分布(图 1 B1~B5、图 2 B1~B4)，主要弥散分布于鼻黏膜固有层，在紧靠上皮的浅层黏膜固有层中，分泌IgA的浆细胞分布数量相对较多，在深层黏膜固有层分布数量相对较少，在固有层鼻腺周围也分布有少量分泌IgA的浆细胞(图 2B4)。统计结果显示(图 3)：在鼻腔的5段组织中，分泌IgA的浆细胞分布密度由高到低依次是鼻腔第Ⅳ段、第Ⅴ段、第Ⅲ段、第Ⅱ段、第Ⅰ段。其中分泌IgA的浆细胞在鼻腔Ⅰ和Ⅱ段之间以及鼻腔Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段之间的分布密度差异不显著(P>0.05)；但在鼻腔Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段分泌IgA的浆细胞分布密度显著高于鼻腔Ⅰ、Ⅱ段(P<0.05)；分泌IgA的浆细胞在上颌鼻甲、筛鼻甲与鼻中隔之间的分布密度差异不显著(P>0.05)；但在这些部位的分布密度显著高于上鼻甲(P<0.05)。
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A. 鼻腔不同段的HE染色结果；B. 分泌IgA的浆细胞在鼻腔不同段的免疫组织化学结果；C. B中相应部位的局部放大(箭头所指为分泌IgA的浆细胞)；D. 阴性对照。1~5. 分别对应鼻腔Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段 A. HE staining results of different segments of nasal cavity; B. Immunohistochemical results of plasma cells secreting IgA in different segments of nasal cavity; C. Partial enlarged view of the corresponding part of figure B(Plasma cells secreting IgA marked by the arrow); D. Negative control. 1-5. Corresponding to five(Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ and Ⅴ)segments of nasal cavity 图 1 分泌IgA的浆细胞在鼻腔不同段的分布特征 Fig. 1 Distribution characteristics of plasma cells secreting IgA in different segments of nasal cavity |
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A.鼻腔不同部位的HE染色结果；B. 分泌IgA的浆细胞在鼻腔不同部位的免疫组织化学结果；C. B中相应部位的局部放大(箭头所指为分泌IgA的浆细胞)；D. 阴性对照。1~4. 分别对应上鼻甲、上颌鼻甲、筛鼻甲与鼻中隔 A. HE staining results of different parts of nasal cavity; B. Immunohistochemical results of plasma cells secreting IgA in different parts of nasal cavity; C. Partial enlarged view of the corresponding part of figure B(Plasma cells secreting IgA marked by the arrow); D. Negative control. 1-4. Corresponding to superior tuibinate, maxilloturbinate, ethmoid turbinate, nasal septum 图 2 分泌IgA的浆细胞在鼻腔不同部位的分布特征 Fig. 2 Distribution characteristics of plasma cells secreting IgA in different parts of nasal cavity |
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A.分泌IgA的浆细胞在鼻腔不同段分布密度比较；B.分泌IgA的浆细胞在鼻腔不同部位分布密度比较。柱上不同小写字母代表差异显著(P<0.05)；相同小写字母代表差异不显著(P>0.05)；下同 A.Comparison of the distribution density of plasma cells secreting IgA in different segments of nasal cavity; B.Comparison of the distribution density of plasma cells secreting IgA in different parts of nasal cavity. Column with different lowercase letters represent significant difference(P<0.05); Identical lowercase letters represent no significant difference(P>0.05); The same as below 图 3 分泌IgA的浆细胞在鼻腔不同段与不同部位分布密度比较 Fig. 3 Comparison of the distribution density of plasma cells secreting IgA in different segments and parts of nasal cavity |
分泌IgG的浆细胞呈圆形或卵圆形，胞质丰富，核圆多偏于细胞一侧，胞质呈阳性反应，为棕黄色。分泌IgG的浆细胞在家兔鼻腔不同段与不同部位组织中也有分布(图 4B1~B5、图 5B1~B4)，主要弥散分布于鼻黏膜固有层，在黏膜上皮下的固有层中分泌IgG的浆细胞分布数量较多，在深层黏膜固有层分布数量较少，在固有层的鼻腺周围也分布有分泌IgG的浆细胞(图 4B4、图 5B3)。统计结果显示(图 6)：在鼻腔的5段组织中，分泌IgG的浆细胞分布密度由高到低依次是鼻腔第Ⅳ段、第Ⅴ段、第Ⅲ段、第Ⅱ段、第Ⅰ段。其中分泌IgG的浆细胞在鼻腔Ⅰ、Ⅱ段之间；鼻腔Ⅲ、Ⅴ段之间的分布密度差异不显著(P>0.05)，但在鼻腔第Ⅳ段中分泌IgG的浆细胞分布密度显著高于鼻腔Ⅲ、Ⅴ段(P<0.05)；分泌IgG的浆细胞在鼻腔Ⅲ、Ⅴ段的分布密度显著高于鼻腔Ⅰ、Ⅱ段(P<0.05)，分泌IgG的浆细胞在上颌鼻甲、筛鼻甲和鼻中隔之间的分布密度差异不显著(P>0.05)，但在这些部位的分布密度显著高于上鼻甲(P<0.05)。综上所述，分泌IgG的浆细胞在家兔鼻腔中总体的分布变化趋势与分泌IgA的浆细胞相似。
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A. 鼻腔不同段的HE染色结果；B. 分泌IgG的浆细胞在鼻腔不同段的免疫组织化学结果；C. B中相应部位的局部放大(箭头所指为分泌IgG的浆细胞)；D. 阴性对照。1~5.分别对应鼻腔Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段 A. HE staining results of different segments of nasal cavity; B. Immunohistochemical results of plasma cells secreting IgG in different segments of nasal cavity; C. Partial enlarged view of the corresponding part of figure B(Plasma cells secreting IgG marked by the arrow); D. Negative control. 1-5. Corresponding to five(Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ and Ⅴ)segments of nasal cavity 图 4 分泌IgG的浆细胞在鼻腔不同段的分布特征 Fig. 4 Distribution characteristics of plasma cells secreting IgG in different segments of nasal cavity |
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A. 鼻腔不同部位的HE染色结果；B. 分泌IgG的浆细胞在鼻腔不同部位的免疫组织化学结果；C. B中相应部位的局部放大(箭头所指为分泌IgG的浆细胞)；D. 阴性对照。1~4.上鼻甲、上颌鼻甲、筛鼻甲与鼻中隔 A. HE staining results of different parts of nasal cavity; B. Immunohistochemical results of plasma cells secreting IgG in different parts of nasal cavity; C. Partial enlarged view of the corresponding part of figure B(Plasma cells secreting IgG marked by the arrow); D. Negative control. 1-4. Corresponding to superior tuibinate, maxilloturbinate, ethmoid turbinate, nasal septum 图 5 分泌IgG的浆细胞在鼻腔不同部位的分布特征 Fig. 5 Distribution characteristics of plasma cells secreting IgG in different parts of nasal cavity |
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A. 分泌IgG的浆细胞在鼻腔不同段分布密度比较；B. 分泌IgG的浆细胞在鼻腔不同部位分布密度比较 A. Comparison of the distribution density of plasma cells secreting IgG in different segments of nasal cavity; B. Comparison of the distribution density of plasma cells secreting IgG in different parts of nasal cavity 图 6 分泌IgG的浆细胞在鼻腔不同段与不同部位分布密度比较 Fig. 6 Comparison of the distribution density of plasma cells secreting IgG in different segments and parts of nasal cavity |
SIgA和IgG作为两种重要的免疫球蛋白，在机体黏膜免疫中发挥着重要的功能。由分泌IgA的浆细胞分泌所形成的多聚免疫球蛋白A(polymeric immunoglobulin A，pIgA)能够被其特异性跨膜转运受体pIgR转运至胃肠道，呼吸道以及泌尿生殖道等的黏膜表面，以SIgA形式参与免疫保护作用[21-22]。由分泌IgG的浆细胞所分泌的IgG也被黏膜上皮转运受体FcRn转运至呼吸道外分泌物中，发挥免疫清除功能[23]。本研究显示，分泌IgA的浆细胞主要弥散分布于家兔每段鼻腔的鼻黏膜固有层中，分泌IgG的浆细胞的分布特征与其相似。Zhang等[13, 15]的研究表明，在不同年龄组双峰驼的皱胃淋巴集结区，分泌IgA和IgG的浆细胞主要弥散分布于黏膜固有层内，并且衰老可以显著降低两类效应细胞密度，但不会改变其弥散分布的特征；在双峰驼小肠中，分泌IgA和IgG的浆细胞均弥散分布于小肠黏膜固有层内，两类效应细胞在小肠中的分布密度呈先增加后减少趋势；张学锋等[24]的研究表明，在双峰驼眼结膜相关淋巴组织中，分泌IgA和IgG的浆细胞弥散分布于结膜上皮下浅层固有层；车传燕和杨倩[25]的研究表明，在断奶仔猪胃肠道中，分泌IgA和IgG的浆细胞主要分布在黏膜固有层，其数量沿胃肠道呈先增加后减少的趋势，上述研究结果与本研究一致。提示鼻黏膜固有层属于黏膜免疫的重要效应部位，保护鼻黏膜免受病原微生物的侵袭。有文献表明，肺中的支气管黏膜相关淋巴组织被抗原物质刺激后，其内的T、B淋巴细胞被激活，激活的淋巴细胞被引流淋巴管运送到达血液，最后经血液归巢到支气管黏膜固有层，引发免疫应答，产生以SIgA和IgG为主的免疫效应分子，保护肺部免受感染[23]。分泌IgA和IgG的浆细胞在鼻黏膜固有层分布可能也与其归巢机制相关。SIgA需要穿过上皮发挥功能[26]，分泌IgA的浆细胞在鼻黏膜固有层浅层分布数量较多或许更有利于抗体转运进入黏膜表面，发挥相应的免疫功能。分泌IgG的浆细胞在黏膜上皮下的固有层分布数量较多，或许可以更好地阻止穿过黏膜上皮的外源性病原体到达深层组织进行破坏，发挥黏膜免疫第二道屏障的作用。另外，分泌IgA和IgG的浆细胞也分布在固有层的鼻腺周围。杨树宝等[18]的研究发现，4日龄雏鸡鼻黏膜固有层鼻腺周围分布有分泌IgA的浆细胞；李鹏成等[27]的研究也发现，在猪气管中分泌IgA和IgG的浆细胞在气管腺周围也有分布，与本研究结果相似，以此推测，SIgA和IgG可以随着腺体的分泌进入黏膜表面发挥屏障作用。同时，分泌IgA和IgG的浆细胞在家兔每段鼻腔的鼻黏膜固有层呈弥散分布，可能有利于SIgA和IgG在整个鼻黏膜形成完整的保护屏障。
近年来，随着国家经济迅速发展，伴随着规模化集约化养殖场的不断增多，在家兔养殖中，呼吸系统疾病已逐渐成为当前养兔业防控的重点和难点[11, 28]。鼻腔作为呼吸道的重要组成部分，需要不停地吸入外界的空气，是机体最先接触大量病原微生物的部位，这使得许多传染病可能通过鼻腔感染和传播，然而程翠翠等[29]的研究发现，家兔鼻腔中存在较为丰富的鼻黏膜相关淋巴组织，且分布部位较为广泛，这使得家兔鼻腔可能具有更多的抗原诱导位点，提示其鼻腔免疫效果可能会优于其他动物。也有研究显示，通过鼻腔免疫能够在呼吸道局部产生特异性抗体，证明这些部位分布有相应的抗体分泌细胞[27]。本研究以家兔鼻腔为研究对象，关于分泌IgA和IgG的浆细胞在家兔鼻腔中的分布规律进行了研究。本试验统计结果显示：分泌IgA的浆细胞在鼻腔不同段均有分布，但在鼻腔Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段的分布较为集中，显著高于鼻腔Ⅰ、Ⅱ段(P<0.05)，分泌IgG的浆细胞分布规律与其基本类似。Yang等[3]的研究表明，分泌IgA的浆细胞在巴马香猪鼻腔中后部分布较多，在鼻腔前部分布较少，分泌IgA的浆细胞在鼻腔中分布趋势由前向后递增，与本研究基本相似。提示家兔鼻腔Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段是鼻黏膜重要效应分子SIgA和IgG产生的关键部位，也是家兔鼻腔免疫的重要效应部位，对病原微生物入侵鼻黏膜具有重要的保护作用。分泌IgA和IgG的浆细胞在鼻腔Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段分布较为集中可能是因为：家兔鼻腔Ⅲ~Ⅴ段大部分是呼吸区，其上皮分布有丰富的杯状细胞，是鼻腔中产生黏液最多的地方，SIgA能在黏膜表面形成一层保护层[30]，配合杯状细胞分泌的黏液或许能够更有效地清除抗原；也有文献表明，SIgA与抗原形成的复合物能够刺激肠道黏膜中的杯状细胞分泌大量黏液，使游离于肠道分泌液中的病原体被清除，保护机体免受感染[31]；分泌IgA的浆细胞集中分布在鼻腔Ⅲ~Ⅴ段的黏膜固有层内或许有利于及时补充黏膜表面的SIgA。同时，家兔鼻腔Ⅲ~Ⅴ段存在丰富的NALT，因而B细胞的数量较多，可以分化形成特异性的分泌IgA和IgG的浆细胞；此外，与鼻腔Ⅰ、Ⅱ段相比，鼻腔Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段的结构较为复杂[29]，使得吸入的空气不容易快速通过鼻腔进入鼻咽道，所以该段鼻腔与抗原的接触时间较长，需要机体产生较多的SIgA与IgG等抗体发挥免疫功能。
在家兔鼻腔的不同部位，分泌IgA和IgG的浆细胞在上颌鼻甲、筛鼻甲和鼻中隔的分布密度显著高于上鼻甲(P<0.05)，提示这些部位也作为家兔鼻腔免疫的重要效应位点在免疫应答中发挥着至关重要的作用。分泌IgA和IgG的浆细胞主要分布在上颌鼻甲、筛鼻甲及鼻中隔可能是因为：在家兔鼻腔中，相比于上鼻甲，上颌鼻甲和筛鼻甲的卷曲程度较大[29]，使得其表面积增大，并且这些部位的黏膜固有层中分布大量的毛细血管[32]，吸入的空气在此与鼻甲骨充分接触使空气温暖并对空气起到过滤作用，同时充分接触也容易使抗原滞留，抗原充分刺激鼻黏膜，并进一步刺激B细胞更多地转化为抗体分泌细胞；鼻中隔是筛骨嵴向前的延续，将鼻腔分为左右两部分[32]，而且表面平坦，分布范围较广，能第一时间接触抗原的数量和种类也较多，所以需要黏膜固有层的大量抗体分泌细胞分泌抗体来处理抗原。
虽然SIgA形成黏膜免疫的第一道屏障，但IgG作为另一种重要效应分子，在黏膜免疫中也发挥着重要的作用，IgG能够募集具有吞噬功能的天然免疫细胞发挥免疫清除功能，也可诱发强烈的炎症反应从而控制病原体的扩散[33]。本研究也显示：分泌IgG的浆细胞在鼻腔不同段与不同部位的分布规律与分泌IgA的浆细胞基本相似，这使得IgG能够成为保护鼻黏膜的第一后备分子，当SIgA的分泌量受限或黏膜受损使得病原微生物即将到达黏膜时，IgG可以迅速募集具有吞噬功能的免疫细胞来清除病原微生物，进而发挥相应的免疫功能。提示IgG作为黏膜免疫的第二道防线，有利于在鼻黏膜形成完整的保护屏障。
4 结论分泌IgA和IgG的浆细胞弥散分布于家兔每段鼻腔的鼻黏膜固有层中，有利于SIgA和IgG分子在整个鼻黏膜形成完整的保护屏障；分泌IgA和IgG的浆细胞主要分布在家兔鼻腔Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段及上颌鼻甲、筛鼻甲和鼻中隔，提示这些区域是家兔鼻腔免疫的重要效应部位。本研究将为家兔呼吸系统疾病的预防及进一步探讨家兔鼻腔免疫应答的机制提供重要的理论依据。
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(编辑 范子娟)