2. 西北农林科技大学动物科技学院, 杨凌 712100
2. College of Animal Science and Technology, Northwest A&F University, Yangling 712100, China
沙门菌是革兰阴性菌，可引起人畜共患疾病，并在食用动物宿主中获得耐药性，然后通过食物链传播给人类[1]。食用受污染家禽产品而引起的沙门菌病常导致严重的公共卫生问题[2]，尽管已经采取了包括抗生素、疫苗和卫生消毒等方法来控制家禽沙门菌的感染，但是沙门菌病病例仍在持续增加[3]。此外，抗生素的使用导致细菌耐药性增加，许多抗生素的有效性降低[4]，周而复始，形成恶性循环。
先天免疫是宿主抵御病原体感染的第一道防线，病原微生物入侵后, 首先引起宿主对病原微生物的识别，这是先天免疫应答的前提和基础，模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)就是宿主细胞识别病原的特殊分子，其中, Toll样受体(toll like receptors，TLRs)不仅是目前研究最广泛的一类TLRs，也是进化上保守的一类模式识别受体，在人、小鼠和鸡等大多数物种中均有该受体，其中，TLR4是在家禽中研究比较多的一类模式识别受体[5]，TLR4-MyD88依赖通路活性与沙门菌感染密切相关，雏鸡对沙门菌感染的反应受TLR4基因表达水平的调节[6]，当雏鸡受到革兰阴性菌细胞壁主要成分——脂多糖(LPS)刺激后，TLR4及其下游的分子MyD88、NF-κB、TNF-α、IL-1β等基因表达均显著上调[7-8]。
USP7作为研究比较广泛的去泛素化酶，可以通过去除靶蛋白上的泛素链，防止靶蛋白被蛋白酶体降解来稳定靶蛋白的表达，在维持基因组稳定性及其与癌症的发生方面都发挥重要作用[9]。USP7可以通过去泛素化稳定NF-κB的亚基从而促进下游炎症因子的表达[7]。P5091是USP7的选择性抑制剂，以浓度依赖的方式抑制USP7的活性[10]，当用P5091处理后，USP7的底物HDM2、PLK1、P53以及CCDC6的蛋白表达均降低[10-12]，而它通过抑制USP7活性影响机体对沙门菌抗性的研究尚未有报道，因此，作者用鼠伤寒沙门菌感染了腹腔注射P5091的雏鸡，分析抑制USP7活性后雏鸡抵抗沙门菌感染的影响。
1 材料与方法 1.1 材料1.1.1 3日龄白来航鸡 雏鸡来源于北京畜牧兽医研究所昌平基地，饲喂于中国农业科学院北京畜牧兽医研究所隔离仓中，自由采食与饮水。
1.1.2 P5091及溶液配制 选择性USP7抑制剂P5091购于上海Selleck，其分子式为C12H7Cl2NO3S2，化学结构见图 1。配制方法为4%DMSO+30%PEG400+dd H2O从左到右依次将纯溶液加入到P5091中，室温溶解，现用现配。
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图 1 P5091化学结构 Fig. 1 Chemical structure of P5091 |
1.1.3 试验菌株 鼠伤寒沙门菌菌株(ST，21484)购自中国工业微生物菌种保藏中心(北京)。菌株按照1∶1 000的比例加入到灭菌的LB肉汤培养基(奥博星，北京)中，置于摇床，37 ℃，180 r·min-1过夜培养。
1.2 试验方法1.2.1 雏鸡感染与样本采集 40只3日龄的雏鸡分为试验组与对照组，每组20只，试验组以10 mg·kg-1浓度腹腔注射USP7抑制剂P5091，隔天注射，共注射5次，对照组以相同方法注射P5091溶剂PEG400和DMSO。各组鸡每天空腹称重。沙门菌在LB肉汤培养基中传代培养至第3代，每代培养12 h，培养第3代后将菌液离心浓缩、梯度稀释，用平板计数的方法确定最终菌落形成单位(CFU)。待最后一次注射P5091后第4天对雏鸡人工口服感染7×1010 CFU沙门菌，感染24 h后，放血处死雏鸡，并收集血样、肝和脾。每组随机选取5只雏鸡新鲜肝用于测量细菌载菌量，将脾、肝置于液氮中以备后续RNA提取，用于细胞因子基因相对表达量的测定。
1.2.2 肝载菌量的测定 采集雏鸡相同部位的肝样品(均采集雏鸡右侧肝)，称取相同质量(约0.1 g) 新鲜肝样品，置于已经加入钢珠和1 mL PBS溶液的离心管中，在组织研磨仪中研磨，用PBS梯度稀释后均匀涂布在营养琼脂(奥博星，北京)上，37 ℃培养箱中培养24 h后，计算菌落数以确定肝细菌载菌量。
1.2.3 RNA提取与实时定量PCR反应 根据使用说明书，使用TRIzol试剂(赛默飞，美国)从肝中提取总RNA。使用逆转录酶试剂盒(天根，北京)进行逆转录。使用荧光定量检测试剂盒(天根，北京)进行实时定量PCR反应(RT-qPCR)。每个样品3个生物学重复。反应体系：cDNA 3 μL, mix 5 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 1 μL，共10 μL。RT-qPCR参数：95 ℃ 3 min; 40个循环，95 ℃ 3 s，60 ℃ 34 s。RT-qPCR的引物序详见表 1。
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表 1 荧光定量PCR引物序列 Table 1 Primers for quantitative real-time polymerase chain reaction |
在本研究中，使用2-ΔΔCt方法计算基因相对表达量，使用t检验分析差异显著性，P＜0.05表示具有统计学意义，结果以“平均值±标准差”表示。使用GraphPad Prism 7.0将所有数据图示化。
2 结果 2.1 USP7活性对雏鸡载菌量以及组织炎症反应的影响监测并记录注射P5091前后雏鸡健康状况以及体重变化，注射前后两组雏鸡健康状况良好，两组体重与体增重均无显著差异(图 2a、b)，说明注射P5091并不会影响雏鸡体重变化。对感染沙门菌的两组雏鸡进行了24 h的监测，雏鸡活动正常，没有死亡发生。雏鸡肝载菌量统计结果发现，与对照组相比，注射P5091的雏鸡肝组织中载菌量显著低于对照组雏鸡(图 2c)，HE染色结果显示，对照组与注射P5091组均出现炎症，具体表现为肺间质充血水肿、肺间隔增宽、血管充血，肝基本结构消失，肝板排列紊乱，并且在肝细胞间可见红细胞和巨噬细胞聚集，但是相较于对照组，注射P5091的雏鸡肝与肺炎症反应更严重(图 2d)。
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a.P5091注射前后雏鸡体重；b.注射P5091组与对照组的体增重(n=20)；c.注射P5091组与对照组的载菌量(n=5)；d.雏鸡肝与肺病理切片。ns.没有显著差异，*.P＜0.05，**.P＜0.01，***.P＜0.001，下同 a. The weight of chicks before and after P5091 injection; b. Body weight gain of injection P5091 group and control group (n=20); c. The bacterial load of the P5091 injection group and the control group (n=5); d. Pathological sections of liver and lungs of chicks. ns.No significant difference, *.P < 0.05, **.P < 0.01, ***.P < 0.001, the same as below 图 2 注射P5091后雏鸡载菌量降低、组织炎症反应加剧 Fig. 2 The bacterial load decreased and the tissue inflammatory response increased after injection of P5091 |
动物的免疫反应与炎症因子的产生密切相关，机体通过释放免疫因子对外界刺激作出免疫应答，为此作者分别检测了试验动物IL-1β、IL-8以及TNF-α的mRNA表达水平，RT-qPCR结果表明，与对照组相比，注射了P5091组炎症因子IL-1β、IL-8以及TNF-α在mRNA水平的表达均显著降低(图 3a~c)，说明抑制USP7活性会降低雏鸡感染后免疫因子的产生。
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a~c.RT-qPCR法检测鼠伤寒沙门菌感染24 h后，P5091组和对照组雏鸡肝中IL-1β、IFN-α和IL-8的mRNA水平(n=18)；d. 抑制USP7活性降低转录因子NF-κB mRNA表达水平(n=16) a-c. RT-qPCR for IL-1β, IL-8 and IFN-α in the liver from P5091 and control chicks challenged with Salmonella for 24 h (n=18); d. Inhibition of USP7 activity reduced NF-κB mRNA expression (n=16) 图 3 注射P5091后肝中免疫因子表达量降低 Fig. 3 Cytokines in the liver decreased after injection of P5091 |
NF-κB是一种转录因子，它可以调节参与免疫反应和炎症的各种基因的表达，NF-κB通路的激活是产生包括IL-1β、TNF-α等细胞因子的经典途径，与细胞因子mRNA表达一致，注射P5091的雏鸡NF-κB的mRNA表达水平显著降低(图 3d)，说明USP7正调控转录因子NF-κB的mRNA表达水平，提示USP7可能通过影响转录因子NF-κB的表达进而调控下游免疫因子。
3 讨论模式识别受体(PRR)通过识别微生物中存在的保守病原体相关分子模式(PAMP)诱导先天免疫反应[13]，它可以用于检测沙门菌触发的机体免疫反应，还可促使炎性细胞因子的释放，限制病毒的复制[14]。TLR4是在家禽中研究比较多的一种模式识别受体，革兰阴性菌LPS可以激活TRL4诱导的核因子NF-κB和转录因子家族的几个成员的激活，诱导宿主的免疫应答[15]。在此过程中，接头蛋白MyD88扮演着重要的作用，它承接TRL4与下游蛋白之间信号传导，当TRL4识别病原体后，MyD88将信号传递给IL-1β受体相关激酶(IRAK)，信号向下游传递激活NF-κB，促使其向核内转移调节包括编码促炎细胞因子在内的靶基因，发生一系列的炎症反应[16]。然而，炎症反应对机体清除病原体固然重要，但是过度免疫或者免疫缺陷都会对机体健康造成不良影响，如过度的炎症反应会引起细胞因子风暴导致内毒素休克或脓毒症的发生[17-18]，免疫应答不足会造成免疫缺陷症，如过敏、恶性肿瘤和自身免疫性疾病等[19]。而NF-κB信号通路是这些炎症反应发生的经典通路，包括细胞因子、趋化因子和黏附分子在内的许多促炎基因都是基于NF-κB发挥作用[20]。NF-κB作为炎症发生和维持免疫稳态的主要调节因子[21]，它的激活和抑制在炎症反应过程中至关重要，在炎症发生期间NF-κB的活化可以促进炎症因子的表达，发挥促炎作用，但在炎症消退过程中，抑制NF-κB可以调节炎症消退，发挥抗炎作用[22]。
USP7作为研究最广泛的一类去泛素化酶，目前对其研究最多的是其在肿瘤发生中的作用，比如USP7可以调控肿瘤因子p53、PTEN和FoxO的稳定性、定位以及活性[11, 23-24]。此外，USP7还在DNA复制、细胞凋亡中发挥作用[25-26]，USP7可以通过去泛素化稳定NF-κB的P65亚基，从而促进下游炎症因子的表达[27]，但是，它在机体对抗沙门菌感染的免疫反应中的作用仍不确定。P5091是特异性针对USP7的小分子抑制剂，它可以通过抑制USP7的活性发挥作用[10]，当用P5091处理后，USP7的底物HDM2、PLK1、P53以及CCDC6的蛋白表达均降低[10-12]。USP7与MyD88结合并稳定其蛋白表达[28]，而USP7是否通过MyD88影响下游免疫因子的表达还未可知。在本研究中，用P5091抑制USP7的活性后，下游转录因子NF-κB的mRNA表达下调，说明USP7可能在NF-κB信号通路的上游发挥作用。而导致NF-κB的激活的信号主要是MyD88[29]，USP7活性减弱可能影响了MyD88的稳定性，导致转录因子的表达降低。之前有研究报道，微量LPS可以通过TLR4激活先天免疫系统，导致TNF-α、IL-1β、IL-8等大量促炎因子的产生[7, 29-30]，本研究结果表明，当抑制USP7的活性之后，雏鸡中IL-1β和IL-8的表达水平降低，这与先前的研究结果一致。本研究还发现，与对照组相比，注射P5091的雏鸡感染后肝载菌量更低，推测可能是由于抑制USP7活性后雏鸡对沙门菌的感染更加敏感，少量的菌液即可以使机体发生免疫反应。综合以上分析可以推测，USP7可能通过调控TLRs-MyD88-NF-κB信号通路的活性，从而影响动物抗病力，本研究为家禽抗病育种提供了基因素材。然而，USP7是否通过特异性调控MyD88来调节鸡肉对沙门菌的抵抗力，以及USP7是否影响鸡对其他病原体的抵抗力，还有待于进一步研究。
4 结论USP7活性被抑制的雏鸡感染沙门菌后NF-κB mRNA表达水平下降，说明USP7在TLRs-MyD88-NF-κB信号通路的上游发挥作用，导致NF-κB信号通路受阻，下游免疫因子IL-1β、IL-8以及TNF-α mRNA表达显著降低；除了在沙门菌感染后炎症通路激活和细胞因子的产生受损外，沙门菌感染后发现注射P5091的雏鸡肝载菌量更低，炎症加剧。本研究结果提示，USP7可能在沙门菌感染雏鸡模型中具有重要的免疫作用，为今后研究USP7影响机体先天免疫应答的分子机制提供了理论依据，为动物的抗病育种提供理论依据。
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(编辑 白永平)