2. 中国农业科学院兰州兽医研究所, 家畜疫病病原生物学国家重点实验室, 兰州 730046
, DENG Ruixue1,2, HU Linjie2, ZHU Xueliang2, SUN Yuefeng2, WANG Guirong1
, MENG Xuelian2
2. State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology, Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730046, China
小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus，PPRV)属于副黏病毒科麻疹病毒属[1]，是一种有囊膜的单股负链RNA病毒，在我国被列为一类病原微生物。PPRV感染山羊、绵羊等引起的小反刍兽疫(PPR)具有较高的发病率和死亡率，在非洲、中东和亚洲等地区流行并造成重大经济损失，被OIE列为法定上报的动物传染病，在我国属于一类动物疫病。2007年, 我国西藏首次暴发PPR，2013― 2014年, 该病迅速传播、流行于22个省区[2-3]，2018年，在我国甘肃西北部造成少量绵羊死亡[4]。鉴于该病对养殖业尤其是养羊业的影响，OIE和FAO制定了为期15年(2015―2030年)的全球小反刍兽疫根除计划。目前，PPR尚无有效的治疗方法，防控的主要措施是疫苗免疫，但是传统的减毒活疫苗存在无法区分自然感染动物和免疫动物、热稳定性低等缺陷，限制了其使用范围，重组标记疫苗的开发虽大有成效，但要普遍应用还为时尚早，因而探索影响PPRV复制的因素对于兽医学研究以及经济意义至关重要。
组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDACs)是一类蛋白酶，通过调控组蛋白和非组蛋白的乙酰化状态调控基因的表达，进而调控细胞内多种生命活动过程，其中，包括炎症反应和抗病毒免疫反应。组蛋白去乙酰化酶有18个家族成员[5]，分为4类：Ⅰ类包括HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8；II类可以细分为IIa类(HDAC4、HDAC5、HDAC7和HDAC9)和IIb类(HDAC6和HDAC10)[6]；III类为Sirtuins家族，属于NAD+依赖性的Sir2超蛋白家族，含有SIRT1~SIRT7七个成员；IV类仅有HDAC11。
HDACs抑制剂是一类小分子化合物，通过抑制HDACs活性调控蛋白质的乙酰化水平，已被广泛应用以揭示HDACs的作用机制。HDACs抑制剂能够调控病毒复制，如SAHA、PCI-34051能够抑制丙肝病毒(HCV)复制[7]，Tubastatin A能够抑制日本脑炎病毒(JEV) 复制[8]。然而，HDACs抑制剂在PPRV感染过程中的作用尚未见报道。因此, 本研究选用不同作用谱的HDACs抑制剂Nicotinamide(NIC，SIRT家族的抑制剂)、Vorinostat(SAHA，广谱HDAC家族抑制剂)、Trichostatin A(TSA，广谱HDAC家族抑制剂)、Mocetinostat(MGCD0103，Ⅰ类HDACs抑制剂，主要作用于HDAC1/2/3/11)、TMP269(Ⅱa类HDACs抑制剂，作用于HDAC4/5/7/9)、Tubastatin A(HDAC6抑制剂)和PCI-34051(HDAC8抑制剂)，分析其对PPRV复制的影响，为进一步研究HDACs调控PPRV感染机制奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料Vero细胞和PPRV Nigeria75/1毒株由本实验室保存；Mocetinostat(MGCD0103)、TrichostatinA(TSA)、Vorinostat(SAHA)、TMP269、PCI-34051、Tubastatin A、NIC购自SELLECK公司；CCK-8试剂盒购自APExBIO公司；Anti-N Antibody由本实验室提供；鼠源抗β-Actin Antibody购自Proteintech公司；Rabbit Anti-Mouse Antibody购自Bioss ANTIBODIES公司；PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)、TB Green® Premix Ex TaqTM II(Tli RNaseH Plus)、One Step TB Green® PrimeScriptTM RT-PCR Kit (Perfect Real Time)、TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0购自宝生物工程(大连)有限公司；DMEM购自甘肃健顺生物科技有限公司；胎牛血清、青链霉素购自Biological industries公司。
1.2 方法1.2.1 细胞培养和病毒感染 Vero细胞培养于含有胎牛血清(100 mL·L-1)、青链霉素(10 mL·L-1) 的DMEM培养基中，在50 mL·L-1CO2、37 ℃细胞培养箱中培养。细胞密度达到80%左右时接种PPRV(0.01 MOI)，吸附2 h后, 更换新鲜的含10 mL·L-1胎牛血清、10 mL·L-1青链霉素的DMEM培养基培养，于50 mL·L-1CO2、37 ℃细胞培养箱培养。
1.2.2 CCK-8细胞增殖-毒性检测试验 100 μL Vero细胞悬液(细胞数2×104~3×104)接种于96孔板，培养24 h后加入10 μL不同浓度HDACs抑制剂NIC、SAHA、TSA、MGCD0103、TMP269、Tubastatin A、PCI-34051(溶剂为DMSO)，以DMSO为对照，孵育48 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续孵育3 h，用酶标仪测定450 nm吸光度值。根据CCK-8试剂盒说明书计算细胞存活率。
1.2.3 RNA提取和RT-qPCR 按照TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit说明书提取RNA，按照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书进行反转录，根据TB Green® Premix Ex TaqTM II (Tli RNaseH Plus)试剂盒说明书设置反应体系和反应程序，测定HDACs基因相对水平。反应体系：Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2×) 10 μL，cDNA 2 μL，上、下游引物(20 μmol·L-1)各0.2 μL，ROX Reference Dye II(50×)0.4 μL，ddH2O 7.2 μL，共20 μL。反应程序：95 ℃预变性30 s; 95 ℃变性3 s，60 ℃延伸34 s，共40个循环。利用TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0提取病毒RNA，根据One Step TB Green® PrimeScriptTM RT-PCR Kit (Perfect Real Time)说明书设置反应体系和反应程序，测定PPRV N基因相对水平。反应体系：2× One Step TB Green RT-PCR Buffer Ⅲ 10 μL，TaKaRa Ex Taq HS(5 U·μL－1) 0.4 μL，PrimeScript RT enzyme Mix Ⅱ0.4 μL，RNA 2 μL，上、下游引物(20 μmol·L－1)各0.2 μL，ROX Reference Dye II(50×)0.4 μL，ddH2O 6.4 μL，共20 μL。反转录反应：42 ℃5 min，95 ℃10 s。PCR：95 ℃预变性5 s，60 ℃延伸34 s，共40个循环。根据NCBI中PPRV N基因序列和绿猴(Chlorocebus sabaeus)HDAC1~11以及β-Actin基因序列设计引物，引物序列见表 1。每个样本设置2个重复孔，采用2-ΔΔCt法计算相对基因水平，根据数据类型选择GraphPad Prism8.2.1软件t test或Multiple t tests方法进行差异性分析。
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表 1 RT-qPCR引物序列 Table 1 The primers for RT-qPCR |
1.2.4 Western blot检测 弃去细胞培养基，PBS洗涤后加入预冷的RIPA裂解细胞，提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度后进行SDS-PAGE凝胶电泳、转膜，50 g·L-1脱脂奶粉室温封闭2 h，PPRV N蛋白抗体(1∶1 000)、β-Actin抗体(1∶5 000)4 ℃孵育过夜，HRP标记的Rabbit Anti-Mouse Antibody(1∶5 000)室温孵育1 h，化学发光显色后，在超灵敏多功能成像仪(GE Amersham Imager 600)中曝光成像。
1.2.5 TCID50试验 用无血清DMEM培养基将病毒原液进行倍比稀释，10-1~10-5，稀释好的病毒液依次加入到96孔板中，每孔100 μL，每稀释度重复接种8孔，无血清DMEM培养基作为对照；向每孔加入细胞悬液100 μL(细胞数2×104~3×104)。37 ℃培养5~7 d，逐日观察细胞病变情况，并记录细胞病变孔数，按照Reed-Muench两氏法计算TCID50。
2 结果 2.1 PPRV感染对HDACs转录的影响为了验证HDACs是否参与PPRV感染过程，Vero细胞密度达到80%左右时接种PPRV(0.01 MOI)，吸附2 h后更换新鲜培养基，培养2 d后收集细胞，提取细胞内RNA，通过RT-qPCR方法检测不同HDACs mRNA的表达水平。结果显示，PPRV感染显著增加了HDAC2的转录，但对其余HDAC家族成员的转录量没有明显作用(图 1)。
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*.P < 0.05 图 1 PPRV感染后HDACs mRNA表达的变化 Fig. 1 The mRNA expression of HDACs after PPRV infection |
为了确定HDACs抑制剂的最适使用浓度，使用CCK-8试剂盒对NIC、SAHA、TSA、MGCD0103、TMP269、TubastatinA、PCI-34051的细胞毒性进行分析。结果显示，终浓度为0.625~20.000 μmol·L-1的PCI-34051基本无细胞毒性，TMP269有轻微细胞毒性；终浓度为0.625~10.000 μmol·L-1的NIC和TubastatinA没表现出细胞毒性；SAHA、TSA和MGCD0103的细胞毒性较强(图 2)。据此结果，确定了HDACs抑制剂的使用浓度，PCI-34051和TMP269为20 μmol·L-1；NIC和Tubastatin A为10 μmol·L-1；SAHA为1 μmol·L-1；TSA和MGCD0103为0.5 μmol·L-1。
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A.PCI-34051; B.SAHA; C.TMP269;D.Tubastatin A; E.MGCD0103; F.NIC; G.TSA 图 2 不同的HDACs抑制剂对Vero细胞活性的影响 Fig. 2 Effect of different HDACs inhibitors on Vero cell viability |
Vero细胞密度达到80%左右时接种PPRV(0.01 MOI)，吸附2 h后，更换新鲜培养基，并加入HDACs抑制剂处理，MGCD0103终浓度为0.25和0.5 μmol·L-1，其余抑制剂终浓度见“2.2”，培养48 h后收集细胞，提取细胞总蛋白，进行Western blot检测。与对照组(DMSO处理组)相比，TMP269和SAHA能明显抑制PPRV N蛋白的表达；0.5 μmol·L-1MGCD0103对PPRV N蛋白的下调作用较0.25 μmol·L-1的明显(图 3)。
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A.Western blot; B.灰度值分析。*.P < 0.05, **.P < 0.01, ***.P < 0.001, 下图同 A.Western blot; B.Gray value analysis. *.P < 0.05, **.P < 0.01, ***.P < 0.001, the same as below 图 3 不同HDACs抑制剂对PPRV复制的影响 Fig. 3 Effect of different HDACs inhibitors on PPRV replication |
2.4.1 RT-qPCR分析 分别用SAHA、TMP269、MGCD0103处理感染PPRV的Vero细胞(处理方法同“2.3”，终浓度见“2.2”)，培养120 h后收集样品，提取病毒RNA进行RT-qPCR检测。结果显示，SAHA、TMP269、MGCD0103能显著(P < 0.05, P < 0.05, P < 0.01)降低PPRV N RNA水平(图 4)。
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*.P < 0.05;**.P < 0.01 图 4 SAHA、TMP269、MGCD0103处理PPRV感染的Vero细胞后，PPRV N RNA相对表达量 Fig. 4 Relative expression of PPRV N RNA in PPRV-infected Vero cells treated with SAHA, TMP269, MGCD0103 |
2.4.2 Western blot分析 SAHA、TMP269、MGCD0103处理感染PPRV的Vero细胞(同“2.4.1”)，分别培养24、48、72、96、120、144 h后收集样品，Western blot检测。结果显示，SAHA、TMP269、MGCD0103对PPRV N蛋白的表达均表现出显著的抑制作用，其中, TMP269和MGCD0103的抑制作用较SAHA的更强(图 5)。
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A、B.SAHA; C、D.TMP269; E、F.MGCD0103; A、C、E.Western blot; B、D、F.灰度值分析 A, B.SAHA; C, D. TMP269; E, F.MGCD0103; A, C, E.Western blot; B, D, F.Gray value analysis 图 5 SAHA、TMP269、MGCD0103处理不同时间对PPRV N蛋白表达的抑制 Fig. 5 Inhibition of PPRV N protein expression by SAHA, TMP269 and MGCD0103 at the different time of PPRV infection |
为了进一步分析SAHA、TMP269、MGCD0103对PPRV复制的抑制作用，以不同浓度抑制剂处理PPRV感染细胞(处理方法同“2.4.1”)，培养48 h后, Western blot检测。结果发现，SAHA、TMP269、MGCD0103对PPRV N蛋白表达的影响具有明显的剂量负相关性(图 6)。
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A、D.SAHA; B、E.TMP269;C、F.MGCD0103; A~C. Western blot; D~F.灰度值分析 A, D.SAHA; B, E.TMP269;C、F.MGCD0103; A-C. Western blot; D-F. Gray value analysis 图 6 不同浓度的SAHA、TMP269、MGCD0103对PPRV N蛋白表达的抑制 Fig. 6 Inhibition of different concentrations of SAHA, TMP269 and MGCD0103 on PPRV N protein expression |
2.4.3 TCID50检测 SAHA、TMP269、MGCD0103处理感染PPRV的Vero细胞(同“2.4.1”)，培养120 h收样，TCID50法检测病毒滴度。结果显示，SAHA、TMP269、MGCD0103均可显著降低病毒TCID50(图 7)。
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*.P < 0.05;**.P < 0.01 图 7 SAHA、TMP269、MGCD0103处理PPRV感染的Vero细胞后，PPRV病毒滴度的变化 Fig. 7 Changes of PPRV virus titers in PPRV-infected Vero cells treated with SAHA, TMP269, MGCD0103 |
组蛋白乙酰化修饰是基因转录调控的重要机制[9]，主要由组蛋白乙酰化酶(histoneacetylases，HATs)和组蛋白去乙酰化酶(histonedeacetylases，HDACs)共同催化完成[10]。HDACs在多种病毒感染中调控病毒复制和机体发病，比如疱疹病毒(herpesviruses)、流感病毒(influenzavirus)、柯萨奇病毒(coxsackievirus)、乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)和人类免疫缺陷病毒(HIV)、呼吸道合胞病毒(RSV)等[11]。本试验发现PPRV感染能够诱导HDAC2 mRNA的表达，表明HDAC2可能参与调控PPRV的复制过程。HDAC2表达水平的升高可影响Ⅰ型IFN受体和IRF9、STAT2的乙酰化水平，抑制ISGs的表达，从而抑制Ⅰ型IFN的抗病毒作用，促进病毒复制[12]。这与本试验中Ⅰ类HDACs抑制剂MGCD0103抑制PPRV RNA水平、蛋白水平的表达，降低病毒滴度的结果相吻合，推测PPRV诱导表达HDAC2以抑制Ⅰ型IFN信号通路可能是PPRV逃避宿主抗病毒反应的机制之一。与PPRV同属于副黏病毒科的RSV感染也能够上调HDAC2的表达，降低组蛋白H3的乙酰化水平，应用HDACs抑制剂SAHA和TSA处理后，组蛋白乙酰化水平升高，RIG-I、IFN-β1表达显著增加，不但抑制RSV的感染，还能减轻感染导致的气道炎症[11]。这是病毒逃避宿主先天抗病毒反应的另一种机制，即下调模式识别受体(RIG-I、TLR、MDA5等)或减少病原相关模式分子以避免被宿主识别，或者抑制IFN产生[13]。HDAC1和HDAC2也能通过调控细胞周期影响病毒复制，其特异性抑制剂FK228处理HBV感染的HepAD38细胞和HepG2细胞后，抑制细胞周期正调节因子(cyclin A、cyclin B1、cyclin D1、cyclin E、p-Rb、p-CDK2)的表达，诱导细胞周期阻滞，从而促进HBV的复制[14]。此外，PPRV感染后Vero细胞中其余HDAC家族成员的表达也有一定变化，HDAC1和HDAC5的表达有增加趋势，只是不显著，这可能与这些家族成员的表达量有关，尤其是HDAC8和HDAC9，在Vero细胞中几乎检测不到。因为HDACs表达具有组织特异性，人基因转录组中HDACs的组织分布显示，正常肾组织中仅有HDAC2表达量最高，HDAC1、HDAC3次之，约为HDAC2的四分之一，Ⅱa类HDACs表达量无数据或检测不到[5, 15]。本试验中Ⅱa类HDACs抑制剂TMP269能够显著下调PPRV RNA和蛋白表达，显著降低PPRV TCID50，说明Ⅱa类HDACs(HDAC4-5、HDAC7、HDAC9)可能也参与调控PPRV感染，促进病毒复制。HDAC4能够抑制TBK1和IKKε对IRF3的磷酸化，进而阻止IRF3转移到细胞核内，降低IRF3介导的IFN-β表达[16]。HDAC4也能够促进IFN-α诱导的JAK-STAT信号通路和ISGs的表达，是痘苗病毒(VACV)复制的限制因子，被C6蛋白降解[17]。HDAC5与HDAC4同源性最高，也能限制VACV复制，被C6蛋白降解[18]。后续试验中，作者将通过构建Ⅰ类和Ⅱa类HDACs敲除细胞系，进一步探究HDACs调控PPRV复制的机制。
目前，对PPR的防控、根除仍是以养羊业为主要经济来源地区和国家的一大难题，今年以来，我国新疆、青海部分地区仍有散发疫情。抗病毒药物可以作为疫苗防疫的补充措施，降低PPR引起的经济损失，有助于全球小反刍兽疫根除计划。现已证实，合欢属植物提取物和一些合成的化合物、银纳米颗粒等具有抑制PPRV作用[19-26]。抗病毒药物的靶点主要是病毒相关分子和宿主相关分子，病毒对作用于宿主分子的抗病毒药物更难产生抗性。Favipiravir是病毒RdRp的抑制剂，能够抑制PPRV吸附、侵入、复制和子代病毒颗粒的释放[27]。而brequinar、leflunomide、6-azauracil、ribavirin、mycophenolic acid是细胞内嘧啶核苷酸和嘌呤核苷酸合成所需酶的抑制剂，通过阻碍核苷酸合成进而抑制病毒DNA/RNA合成[28-29]。作用于宿主细胞HDACs的抑制剂已表现出清除病毒感染的作用[30-31]。随着对HDACs与病毒感染研究的不断深入，HDACs抑制剂为治疗病毒感染及相关疾病提供了一种新的选择。本试验中，Ⅱa类HDACs抑制剂TMP269的细胞毒性低，且对PPRV病毒复制的抑制作用显著，在后续试验中进一步探究其作用机制，或许可以为抗PPRV感染提供新的思路。
4 结论PPRV感染能够诱导HDAC2的表达，HDACs抑制剂SAHA、TMP269、MGCD0103在PPRV RNA、蛋白水平和病毒滴度方面均表现出明显的抑制作用，表明Ⅰ类HDACs和Ⅱa类HDACs在PPRV复制过程中发挥重要作用。
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(编辑 白永平)