环状RNA(circRNAs)是一种由前体mRNA在反向剪接过程中形成的非编码RNA[1]。circRNAs根据来源主要分为四类：由外显子组成的外显子环状RNA；由内含子组成的内含子环状RNA；外显子和内含子共同组成的外显子-内含子环状RNA；来自基因间区的基因间环状RNA[2]。circRNAs的分布十分广泛，在人[3]、动物[4]和植物[5]体内都可以检测到。此外，circRNAs具有时空表达特性[6]和序列保守性[7]，并且在畜禽的各个组织器官中表达丰度不同[8]。随着RNA-seq技术的发展，陆续有研究报道circRNAs可以参与基因转录后的调控[9]，与蛋白质结合发挥作用[10]，也可以结合microRNA(miRNA)进而调控靶基因的表达[11]以及可以编码蛋白[12]。近年来，在鸡体内发现circRNAs可以参与到肌肉生长发育过程，例如circTMTC1通过吸附miR-128-3p抑制鸡骨骼肌卫星细胞的分化[13]；circHIPK3吸附miR-30a-3p从而促进鸡成肌细胞增殖分化[14]；circFAM188B可以编码一种调节鸡骨骼肌卫星细胞增殖和分化的蛋白[15]；circSVIL通过吸附miR-203促进鸡成肌细胞增殖和分化[16]等。
Sestrins家族中的SESN1、SESN2和SESN3三个基因广泛存在于哺乳动物的各个组织中，且SESN1在骨骼肌的表达量较高[17]，在分化的肌管也高表达[18]。Sestrins是胰岛素和葡萄糖敏感型的基因，可以与GATOR2相互作用，参与mTORC1上游的氨基酸感知通路的负向调控[19]。在小鼠的研究中还发现，Sestrins是促进长期运动对机体代谢和身体耐力产生好处的关键整合因子，运动后敲除SESN1的小鼠比野生型小鼠表现出更高的葡萄糖不耐受[20]。此外，还有研究发现，在鸡体内miR-16-5p通过靶向SESN1从而抑制成肌细胞增殖，促进成肌细胞凋亡，抑制成肌细胞分化[18]。SESN1是p53基因的主要靶点，下调SESN1后可以减少自噬进而减轻多囊卵巢综合征[21]。SESN1也是一种抗氧化剂，在氧化应激诱导的细胞增殖和损伤的调节中发挥着不同的作用[22]。此外有研究发现，SESN1基因突变型的秀丽隐杆线虫的寿命明显缩短，而且肌细胞会严重受损，肌动蛋白纤维异常弯曲[23]。
目前尚未见关于SESN1的环状RNA的相关报道。本课题组前期从肉鸡和乌鸡胸肌的高通量测序数据(数据未发表)中发现了一个由SESN1外显子形成的circRNA(circSESN1)。本研究通过鉴定鸡体内circSESN1，预测circSESN1的潜在性功能，检测鸡circSESN1的时空表达特性，并对鸡进行胰岛素、葡萄糖、丙酮酸钠和饲粮限饲等外源性刺激探究circSESN1在鸡体内的表达调控特性。为今后深入研究鸡circSESN1在胰岛素代谢和肌肉发育过程中的作用奠定基础。
1 材料方法 1.1 试验动物试验一：取丝羽乌骨鸡(乌鸡)种蛋(n=50)进行孵化，在孵化期间分别挑选10胚龄(E10)和19胚龄(E19)乌鸡各4只采集胸肌组织，剩余鸡胚继续孵化，出壳后自由采食、自由饮水，饲粮配制参考《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)，光照时间为23 h·d－1，出壳后第1周鸡舍温度控制在33~35 ℃，以后每周温度递减2~3 ℃[24]。饲喂至21日龄(21 d)时，分别挑选4只雄性乌鸡，采集其心、肝、肌胃、腺胃、胸肌、腿肌、脑和胰腺8个组织样；饲养至49日龄(49 d)时，挑选4只雄性乌鸡，采集胸肌组织，均迅速冻于液氮后－80 ℃保存。
试验二：1 d艾拔益加雄性肉鸡(肉鸡)在相同条件下饲养(同试验一)，并分别选取40只体重相近的肉鸡开展葡萄糖耐受试验(18 d)、丙酮酸耐受试验(21 d)和胰岛素耐受试验(24 d)，试验前禁食12 h[25-26]，分别于试验前采集不做处理鸡的胸肌样品为基础状态(或0 min，n=6)。①葡萄糖耐受试验：试验组按照2 g·kg-1的剂量腹腔注射10%葡萄糖溶液，对照组注射同等剂量的0.9%生理盐水，分别于注射后10和60 min，采集6只鸡胸肌组织样品。②丙酮酸耐受试验：试验组按照2 g·kg-1的剂量腹腔注射丙酮酸钠(用0.9%生理盐水稀释)，对照组注射等剂量的0.9%生理盐水，注射后60 min采集6只鸡的胸肌组织。③胰岛素耐受试验：试验组按照0.05 mL·kg-1的剂量腹腔注射胰岛素，对照组腹腔注射等剂量的磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)。试验所用胰岛素用PBS进行稀释(胰岛素∶PBS=1∶9)，在胰岛素和PBS注射后15、120和240 min分别采集6只鸡的胸肌组织。所有采集的样品迅速于液氮冷冻后转移到－80 ℃冰箱保存。
试验三：1 d的艾拔益加肉鸡于相同条件下饲养，饲粮配方参照本实验室前期研究的限饲配方[27-29]。饲喂至7 d时随机挑选30只体重相近的雌性肉鸡分为3组(对照组、15%能量限饲组和15%蛋白限饲组)。对照组饲喂常规日粮，自由采食；15%能量限饲组自由采食能量限制饲粮(代谢能是对照组的85%，其它各营养水平与对照组相同)；15%蛋白限饲组自由采食蛋白限制饲粮(粗蛋白质含量是对照组的85%，其它各营养水平均与对照组相同)，饲养试验进行至21 d时，每组各采集10只鸡胸肌组织。采集的组织样品迅速放于液氮中，转移至－80 ℃冰箱保存。
1.2 引物设计与合成采用Primer Premier 5.0软件，根据circSESN1剪接位点附近100~200 bp序列设计背靠背引物扩增circSESN1，并设计面对面引物扩增SESN1(登录号：XM_004940327.4)和β-actin(登录号：NM_205518.1)，引物序列见表 1。委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物。
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表 1 引物信息 Table 1 Primer information |
按照动物组织基因组DNA小量提取试剂盒(莱枫，上海)说明书要求，提取21 d乌鸡肝组织中的基因组DNA。采用TRIzol法提取各个组织样品的RNA，利用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量与完整性，利用分光光度计测定RNA的浓度以及OD 260/280 nm。参照HiScriptⓇ Ⅲ 1 st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)(诺唯赞，南京)说明书进行RNA的反转录。反转录过程分为两步，第一步首先去除基因组DNA：Total RNA 1 μg、5× gDNA wiper Mix 2 μL，用ddH2O补充至10 μL，于42 ℃孵育2 min。第二步合成cDNA：第一步的混合液10 μL、10× RT Mix 2 μL、HiScript Ⅲ Enzyme Mix 2 μL、Oligo(dT)20VN 1 μL、Random hexamers 1 μL、ddH2O 4 μL，于37 ℃孵育15 min，85 ℃孵育5 s。得到的cDNA保存于－20 ℃备用。
1.4 RNase R酶处理将提取21 d乌鸡肝组织RNA样品分为两份，一份参照RNase R酶试剂(吉赛，广州)说明书进行RNase R酶处理(RNase R+)；另一份作为对照(RNase R-)。处理组在2 μg RNA中加入6 U RNase R酶，对照组加入等量缓冲液，于37 ℃孵30 min，然后于70 ℃，10 min使酶失活后直接进行逆转录反应。
1.5 qRT-PCR以β-actin为内参基因，使用荧光定量PCR仪(Light CyclerⓇ96，美国)进行qRT-PCR，qRT-PCR反应体系(10 μL)包括：cDNA 1 μL，上、下游引物各0.2 μL，2× ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 5 μL(诺唯赞，南京)，加ddH2O补充体系至10 μL，反应程序：95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共35个循环。在qRT-PCR试验中均设置3个生物学重复和3个技术重复进行试验，设置不添加cDNA的组别为阴性对照。采用2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量[30]。
1.6 潜在性功能预测通过miRanda[31]软件预测剪切后的circSESN1和miRNA的结合位点。用Cytoscape软件构建circSESN1-miRNA互作网络。利用IRESfinder[32]软件，寻找circSESN1序列上是否包含内部核糖体进入位点(IRES)信息，分析circSESN1是否具备不依赖5′帽子结构而启动翻译的功能，从而对circSESN1的蛋白翻译潜能进行预测。
1.7 统计分析采用SPSS 26.0的单因素方差分析和邓肯法多重比较对试验数据进行统计分析。P < 0.05为差异显著，P < 0.01为差异极显著。使用GraphPad Prism 8.0对试验结果进行绘图。
2 结果 2.1 circSESN1的鉴定和成环验证高通量测序获得的circSESN1是由SESN1三个外显子(XM_004940327.4，位置：510~1 136 bp)反向剪切形成的环状RNA，总长627 bp。为了对circSESN1进行鉴定和成环验证，利用试验一采集的21 d乌鸡肝组织，根据表 1的引物信息，对circSESN1和来源基因SESN1进行了RT-PCR扩增(图 1A)。结果发现，在以cDNA为模板时可以同时检测到circSESN1和SESN1的表达，但以gDNA为模板时仅可检测到SESN1的表达，而不能检测到circSESN1的表达。将PCR产物进行Sanger测序后发现circSESN1连接处的测序结果和高通量测序结果相符(图 1B)，与SESN1外显子反向连接处的序列也一致。从而表明circSESN1是反向剪切成环存在的。对circSESN1与SESN1的稳定性进行检测(图 1C)，结果发现使用RNase R酶处理后，与对照组相比，线性基因β-actin和SESN1表达量均发生了极显著的降低(P＜0.01)，而RNase R酶处理后circSESN1的表达与对照组相比差异不显著(P＞0.05)，表明circSESN1能够耐受RNase R酶的消化，对于RNase R酶具有较强的抵抗性，也再次证明了circSESN1是以环状形式真实存在的。
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A. circSESN1与来源基因SESN1分别以cDNA和gDNA为模板进行RT-PCR扩增，白色三角形表示circSESN1背对背引物，黑色三角形表示来源基因SESN1面对面引物；B. circSESN1连接位点的Sanger测序验证；C. circSESN1和SESN1的稳定性检测。*表示P < 0.05，**表示P < 0.01，ns表示P>0.05。下同 A. circSESN1 and source gene SESN1 were amplified by RT-PCR using cDNA and gDNA as templates, respectively. The white triangle represents the divergent primer of circSESN1, and the black triangle indicates the convergent primer of the source gene SESN1. B. Sanger sequencing verification of circSESN1 junction site. C. Stability detection of circSESN1 and SESN1. * meansP < 0.05, ** means P < 0.01, ns means P>0.05. The same as below 图 1 circSESN1的鉴定和成环验证 Fig. 1 Identification and cycling verification of circSESN1 |
为了探究circSESN1的组织表达特性，通过qRT-PCR技术检测了circSESN1和来源基因SESN1在乌鸡各个组织中的表达量(图 2A、2B)。结果发现circSESN1和其来源基因SESN1具有相似的组织表达模式，在骨骼肌和胰腺中高表达，在其它组织中低表达。circSESN1在胸肌中的表达极显著高于其它几个组织(P＜0.01)，腿肌和胰腺中circSESN1的表达极显著高于心、肝、肌胃、腺胃和脑(P＜0.01)，而circSESN1在心、肝、肌胃、腺胃和大脑的表达无显著差异(P>0.05)。来源基因SESN1在胸肌的表达也极显著高于其它几个组织(P＜0.01)；此外在腿肌和胰腺中SESN1的表达极显著高于肝、肌胃、腺胃和脑(P＜0.01)。进一步对鸡不同发育阶段的胸肌中circSESN1和SESN1的表达特性进行分析(图 2C、2D)，发现circSESN1和其来源基因SESN1随鸡的生长发育表现了相似的变化趋势，以胚胎发育(E10)早期最低，而在胚胎发育后期和出生后保持相对高的表达。circSESN1在21 d鸡胸肌中的表达量最高，极显著高于E10、E19和49 d胸肌中的表达量(P < 0.01)，大约是E10胸肌中表达量的450倍。而SESN1在E19胸肌中表达量高于E10、21和49 d胸肌中的表达量，与E10胸肌中的表达量相比大约提高了20倍。
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A. circSESN1在21 d乌鸡组织表达谱；B. 来源基因SESN1在21 d乌鸡组织表达谱；C. circSESN1在鸡不同发育阶段胸肌中的表达；D. SESN1在鸡不同发育阶段胸肌中的表达。不同大写字母表示基因在不同组织或时间点差异极显著(P < 0.01)，不同小写字母表示基因在不同组织或时间点差异显著(P < 0.05)，相同字母表示基因在不同组织或时间点差异不显著(P>0.05) A. The tissue expression profile of circSESN1 on 21 d in silky fowl. B. The tissue expression profile of source gene SESN1 on 21 d in silky fowl. C. The expression of circSESN1 in pectoralis at different developmental stages of chicken. D. The expression of SESN1 in pectoralis at different developmental stages of chicken. Different capital letters indicated extremely significant differences in genes at different tissues or time points (P < 0.01). Different lowercase letters indicate significant differences in genes at different tissues or time points (P < 0.05). Same letter means no significant difference in gene expression at different tissues or time points (P>0.05) 图 2 circSESN1与来源基因SESN1的组织表达特性 Fig. 2 Tissue expression characteristics of circSESN1 and source gene SESN1 |
为了探究外源性刺激对circSESN1表达的影响，首先检测了胰岛素注射对胸肌中circSESN1表达的效应(图 3A)。qRT-PCR结果显示，胸肌中circSESN1的表达量在胰岛素注射后不同时间点呈现出了较大的变化，尤其是在胰岛素注射120 min后表达量最高。与0 min相比，在胰岛素注射120 min后circSESN1的表达量发生了极显著升高(P＜0.01)，同时与注射PBS 120 min后相比也发生了极显著升高(P＜0.01)。与0 min基础状态相比，在PBS注射后120 min后circSESN1的表达发生了低幅度的升高(P＜0.05)。使用丙酮酸钠处理后发现胸肌中circSESN1在注射后60 min与基础状态相比没有发生显著性变化(P>0.05)，与注射生理盐水的对照组相比也没有发生显著性变化(图 3B)。同样注射葡萄糖不同时间点后circSESN1的表达量没有显著性变化(P>0.05，图 3C)，与注射生理盐水的对照组相比也没有发生显著性变化(P>0.05)。
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A. 胰岛素处理后对胸肌中circSESN1表达的影响；B. 丙酮酸钠处理后对胸肌中circSESN1表达的影响；C. 葡萄糖处理后对胸肌中circSESN1表达的影响 A. Effect of insulin treatment on circSESN1 expression in pectoralis. B. Effect of sodium pyruvate treatment on circSESN1 expression in pectoralis. C. Effect of glucose treatment on circSESN1 expression in pectoralis 图 3 注射胰岛素、丙酮酸钠和葡萄糖对circSESN1表达的影响 Fig. 3 Effects of insulin, sodium pyruvate and glucose injection on circSESN1 expression |
利用实验室构建的限饲群体，进一步研究了15%能量限饲和15%蛋白限饲对circSESN1表达的效应(图 4)。结果表明，与对照组相比，15%能量限饲显著下调了胸肌中circSESN1的表达(P＜0.05，图 4A)，大约降低了五分之四。15%蛋白限饲处理后与对照组相比胸肌中circSESN1的表达也发生了显著性降低(P＜0.05，图 4B)，下调了二分之一左右。
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A. 15%能量限饲对胸肌中circSESN1表达的影响；B. 15%蛋白限饲对胸肌中circSESN1表达的影响 A. Effect of 15% energy restriction on circSESN1 expression in pectoralis. B. Effects of 15% protein restriction on circSESN1 expression in pectoralis 图 4 限饲对肉鸡胸肌circSESN1表达的影响 Fig. 4 Effect of feeding restriction on circSESN1 expression in pectoralis of broilers |
为了研究circSESN1的功能，对circSESN1的靶向miRNAs进行了功能预测。结果发现，circSESN1可以和71个miRNAs发生互作(图 5)，提示circSESN1可能通过结合miRNA进而发挥作用。
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图 5 circSESN1-miRNA互作网络 Fig. 5 circSESN1-miRNA interaction network |
对circSESN1序列中的IRES信息进行分析，结果发现circSESN1序列上和剪接位点都不存在IRES，评分都在0.5以下(表 2)，说明circSESN1不存在潜在的翻译蛋白能力，而是作为非编码RNA行使功能。
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表 2 circSESN1翻译蛋白潜能分析 Table 2 The analysis of protein-coding ability of circSESN1 |
circRNAs由于结构的特殊性，需要对其进行鉴定是否成环[33]。根据circRNAs反向剪接处的序列，分别设计相应的背对背引物和面对面引物，并检测以cDNA和gDNA为模板时能否通过PCR扩增出相应的目的条带。面对面引物在cDNA和gDNA中均能检测出相应的目的条带，而背对背引物只在cDNA模板中检测出相应的目的条带，在gDNA中检测不到[34]。与线性基因相比，circRNAs由于不具备5′端和3′端的结构，所以具有较强的稳定性不易被RNase R酶消化[35]。本研究通过使用RNase R酶进行处理后发现circSESN1的表达确实不受RNase R酶的影响。从而证明了circSESN1是反向成环并真实存在的。
已有文献报道circRNAs可正向调控来源基因发挥功能，如敲低circEIF3 J和circPAIP2后分别导致HeLa和HEK293细胞中来源基因mRNA水平的下降[36]；在食管鳞状细胞癌中，circITCH作为miRNA海绵从而促进miRNA靶基因ITCH的表达[37]。本研究发现，circSESN1和来源基因SESN1具有相似的时空表达模式，提示circSESN1和来源基因SESN1在胸肌中可能存在潜在的协同作用。circSESN1-miRNA互作网络分析发现，circSESN1具有丰富的miRNA结合位点，推测circSESN1可作为竞争性内源性RNA[37-38]，通过碱基互补海绵吸附miRNA的方式调控SESN1的表达。在这些存在结合位点的miRNAs中，miR-184[39]和miR-17[40]已报道与胰岛素代谢有关，这也预示着circSESN1可能通过与这些miRNAs互作进而调节鸡体内胰岛素的代谢。circSESN1和其来源基因SESN1均在骨骼肌中高表达，提示其在肌肉发育上的潜在功能。有研究表明，出壳前鸡胚的肌肉发育主要源于肌纤维数目的增加，而出壳后肌肉的增加是来源于肌纤维细胞的肥大[41]。本研究发现，circSESN1和其来源基因SESN1在胚胎发育早期(E10)胸肌中低表达，而在胚胎后期(E19)、21和49 d中高表达，也提示其与鸡骨骼肌在胚胎后期和出壳后的高速生长发育有关，且已有研究发现SESN1可促进鸡成肌细胞增殖，抑制成肌细胞凋亡，诱导成肌细胞分化[20]。
胰岛素是维持机体血糖平衡、供给各种组织和器官能量的一类重要激素。circRNAs可以参与胰岛素代谢调控，有研究发现环状RNA Cdr1as通过miR-7及其靶点调控胰岛细胞的胰岛素分泌[42]，也有研究在果蝇体内鉴定到胰岛素敏感型环状RNA[43]。此外，SESN3可通过mTORC2激活AKT信号通路，从而增强小鼠肝的胰岛素敏感性[44]；同时敲减SESN2和SESN3也会引起肝mTORC1-S6K信号通路的激活和胰岛素抵抗[45]。本研究发现，circSESN1和其来源基因SESN1均在胰腺组织高表达，且外源胰岛素显著上调了鸡胸肌circSESN1(120 min)的表达量。推测SESN1及其形成的circSESN1可能通过影响胰岛素的分泌从而参与鸡体内的胰岛素信号调控。胰岛素可促进肌肉葡萄糖的吸收[46]，肌肉葡萄糖可通过糖酵解途径转化为丙酮酸，而丙酮酸可通过糖异生转化为葡萄糖，本研究发现肌肉中circSESN1的表达既非丙酮酸敏感型，也非葡萄糖敏感型的，而是胰岛素敏感型的。此外有研究发现，在丙酮酸钠和葡萄糖注射30 min后血糖浓度变化幅度最大，在60 min的变化不大[25]，这也能进一步解释本试验中注射葡萄糖和丙酮酸钠60 min后，circSESN1的表达量虽然发生了变化但是差异不显著。本课题组前期的研究还发现，在胰岛素注射后120 min内肉鸡血糖浓度呈线性下降，并在120 min时降低至最低点[24]。本研究中胰岛素注射后胸肌中circSESN1表达呈现出和血糖相反的变化规律，提示鸡胸肌circSESN1通过胰岛素信号通路对血糖浓度进行负向调控。
限饲会影响鸡体内糖代谢。石秀文[47]发现，限饲可以提高肉鸡的空腹血糖。在鸡线粒体中限饲可以通过改变基因的表达进而降低线粒体DNA拷贝数[27]。本研究中，15%能量限饲和15%蛋白限饲均显示了和外源胰岛素相反的效应，下调了胸肌中circSESN1的表达。Sestrins家族可以通过P53、MAPK、AKT和mTOR等信号通路参与到应激和自噬等机体调控[48]。其中SESN2和SESN3通过AKT和mTOR参与到葡萄糖代谢和胰岛素抵抗过程[44-45]。因此推测，限饲会通过影响相关信号通路进而降低circSESN1的表达。
4 结论本研究鉴定了鸡体内存在一个不被RNase R酶消化降解、具有高度稳定性的circSESN1，并预测circSESN1存在多个miRNAs结合位点。circSESN1和其来源基因SESN1呈现了相似的时空表达特性，均在骨骼肌和胰腺组织具有较高的表达丰度，其表达也均在鸡胚胎发育后期(E19)的胸肌中急剧上升。注射外源胰岛素显著上调胸肌中circSESN1(120 min)的表达，15%能量限饲和15%蛋白限饲均可显著下调胸肌中的circSESN1的表达。
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(编辑 范子娟)