, LIU Qian, HOU Xinhua, LIU Xin, WANG Ligang, ZHAO Fuping, GAO Hongmei, SHI Lijun, WANG Lixian
, ZHANG Longchao
在脊椎动物进化中，猪是为数不多存在脊椎数变异的动物之一[1]。北京黑猪是20世纪60年代由巴克夏、大白以及中国地方猪种杂交形成的一个地方猪种[2]，其脊椎数(胸椎和腰椎的总和)存在从20~23节的表型变异。脊椎数是高遗传力(0.6~0.62)的经济性状[3]，它的增加对于动物的体尺、胴体长、胴体重和生产性能有显著的正向影响[4]。在猪中胸腰椎数的变异极大，颈椎和荐椎数基本固定，颈椎数一直固定在7节，荐椎数固定在4节，尾椎数虽有较大差异但与胴体长无关。研究表明，每增加一根脊椎胴体长将增加80 mm[4]。Wada等[5]将影响猪脊椎数的QTL定位在Sus scrofa 1号染色体上(SSC1)；随后，Sato等[6]构建了梅山母猪×杜洛克公猪的F2资源群体，将影响胸腰椎总数的QTL定位于SSC1和SSC7上。通过进一步的深入研究，在SSC1上发现了核受体亚家族6A组成员1(NR6A1)[7]，在SSC7上发现了椎骨发育相关基因(VRTN)[8-10]和潜在转化生长因子β结合蛋白2(LTBP2)[11-13]。
NR6A1是一个在胚胎发育中发挥重要作用的基因，在早期小鼠胚胎和后期发育中的神经系统广泛表达[7, 14]。在体节发生过程中，突变的胚胎会形成13体节而代替原来的25体节[15]。NR6A1是一个利用多种辅抑制因子复合物来抑制和沉默基因转录的转录抑制因子，错义变异发生在铰链结构域，这是NR6A1与核受体辅阻遏子1 (NCoR1)[16]和核受体相关蛋白80 (RAP80)[17]相互作用的必要条件。
VSX2亦称HOX10，是HOX基因家族中独一无二的一簇，它们在脊椎动物轴向骨骼进化中发挥着核心作用[18-20]。VRTN被认为是影响脊椎数强有力的候选基因[8, 21]。随后试验证明，VRTN是一种新型的位于细胞核中的DNA结合转录因子，在全基因组范围内与DNA结合，并调节一组含有VRTN结合基序的基因转录[10]。LTBP2是包含LTBPs 1-4和fibrillins 1、2和3的LTBP-fibrillin的基因家族中的一部分[22]，LTBP家族是一组细胞外多结构域蛋白，具有多种独特的生物学特性[23]。所有的4种LTBP异构体都与fibrillin微纤维相关，LTBP-1、2和4的C端都与fibrillin-1 N端相似的区域相互作用[24-26]。LTBP2是家族唯一一个不与TGFβ结合而可以独立存储和激活的成员[27]。
虽然上述4个基因已被认为是影响脊椎数及胴体性状的候选基因，但在北京黑猪中的多态性及与性状的关联分析尚未见报道。本研究旨在对4个基因的所有外显子区进行聚合酶链式反应(PCR)、突变位点检测及开展基因型与脊椎数及胴体性状的关联分析，以期探索调控性状变异的候选基因功能位点，为下一步阐释性状变异的遗传机理奠定基础。
1 材料与方法 1.1 组织样品的采集及表型数据的测定和记录收集(210±7)日龄的410头北京黑猪组织样并记录脊椎数和胴体性状。动物均饲养在北京黑六牧业科技有限公司。
1.2 DNA提取使用DNA提取试剂盒(QIAamp DNA Mini Kit)进行组织样品的DNA提取，使用超微量分光光度计(IMPLEN)进行DNA浓度、核酸与蛋白及酚类物质最高吸收峰的吸收波长比值(260 nm/280 nm)、核酸与碳水化合物最高吸收峰的吸收波长比值(260 nm/230 nm)的检测，并用2%的琼脂糖凝胶进行DNA质量检测评估，将质量合格的DNA样品放入－20 ℃的冰箱中存放。
1.3 引物设计及合成利用Primer Premier 5.0对NR6A1(NM_001097499.1)、VSX2(XM_021100021.1)、VRTN(NM_001195113.1)及LTBP2(XM_021099520.1)基因共设计53对引物，由于引物较多，本研究将找出突变位点的引物列于表 1，设计好的引物均有北京六合华大基因科技有限公司合成。
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表 1 引物信息 Table 1 Information of primer |
采用25 μL的反应体系(Code：P505-d1，Vazyme)：2×Phanta Max Buffer 12.5 μL，0.5 μL聚合酶，0.5 μL dNTP，1 μL上游引物，1 μL下游引物，8.5 μL无菌水，1 μL模板。PCR程序如下(ABI，Singapore)：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，57~62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30~90 s，35个循环；72 ℃延伸2 min。对410头北京黑猪使用96孔板采用以上程序进行PCR扩增，PCR产物通过1.5%凝胶进行切胶回收单一条带，在北京六合华大基因科技有限公司平台进行双向的Sanger测序。
1.5 数据统计分析对PCR扩增得到的产物测序后使用DNAStar中的SeqMan进行基因分型，使用Microsoft Excel 2016进行基因型频率和等位基因频率的统计。使用SAS 9.2进行表型与基因型的关联分析，采用Duncan′s多重检验评估不同基因型之间差异的显著性(P＜0.05)，数据使用“平均值±标准差”表示，P＜0.05判定为差异显著。
2 结果 2.1 北京黑猪表型数据的描述410头北京黑猪个体的表型值(脊椎数和胴体性状)，脊椎数的均值达21节，变异系数为2.76%；胴体长的均值达97.99 cm，变异系数为4.84%；胴体直长的均值达89.88 cm，变异系数为4.53%；胴体斜长的均值达76.12 cm，变异系数为4.35%；胴体重的均值达64.32 kg，变异系数为11.72%(表 2)。
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表 2 脊椎数和胴体性状的表型值统计 Table 2 Statistics of phenotypic values of the vertebral number and carcass traits |
通过对4个基因进行PCR扩增后共发现15个突变(表 3和表 4)分别在CDS和3′UTR区，其中1个为VSX2基因的同义突变，5个为VRTN基因的3′UTR突变和9个为LTBP2基因的3′UTR突变。这15个SNPs的基因型频率变化范围为4%~78%，其等位基因频率变化范围15%~85%。
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表 3 北京黑猪中VSX2和VRTN突变位点的基因型频率及等位基因频率统计 Table 3 Statistics of genotype and allele frequencies of mutated loci in VSX2 and VRTN genes in Beijing black pigs |
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表 4 北京黑猪中LTBP2突变位点的基因型频率及等位基因频率统计 Table 4 Statistics of genotype and allele frequencies of mutated loci in LTBP2 gene in Beijing black pigs |
NR6A1、VSX2、VRTN和LTBP2基因通过PCR扩增筛选得到的15个SNPs位点(VSX2上1个同义突变；VRTN上5个3′UTR；LTBP2上9个3′UTR)的基因型与北京黑猪的脊椎数、胴体长、胴体直长、胴体斜长及胴体重的关联分析结果见表 5和6。VSX2上1个同义突变c.536 G＞A与脊椎数显著相关，与与胴体长、胴体直长、胴体斜长及胴体重无显著相关；VRTN上c.2598 A＞G、c.2607 G＞T与脊椎数、胴体长、胴体直长和胴体斜长关联显著，与胴体重关联不显著，c.2715 C＞T与脊椎数、胴体长、胴体直长、胴体斜长和胴体重关联不显著，c.3087 G＞C只与胴体斜长关联显著，与脊椎数、胴体长、胴体直长和胴体重关联不显著，c.3094 A＞G与脊椎数和胴体斜长关联显著，与胴体长，胴体直长和胴体重关联不显著；LTBP2上6个(c.7158 A＞G、c.6869 C＞T、c.6319 G＞C、c.6246 G＞T、c.6170 A＞G、c.6079 G＞T)与脊椎数差异显著相关，但与胴体长、胴体直长、胴体斜长及胴体重关联均不显著。
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表 5 VSX2和VRTN基因6个SNPs与脊椎数和胴体性状的关联分析 Table 5 The association analysis of 6 SNPs of VSX2 and VRTN genes with vertebral number and carcass traits |
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表 6 LTBP2基因9个SNPs与脊椎数和胴体性状的关联分析 Table 6 The association analysis of 9 SNPs of LTBP2 gene with vertebral number and carcass traits |
猪的脊椎数是一个重要的影响猪体型性状的高遗传力经济性状。对猪的脊椎数经过长期的研究，将QTL定位在了SSC1和SSC7上[28]。研究表明，通过全基因组关联分析得到，SSC1上的NR6A1被认为是影响脊椎数和体长性状的候选基因[29-32]，并发现NR6A1(c.748C＞T)发生碱基替换，导致了192密码子脯氨酸突变为亮氨酸[7]。等位基因T在所研究的西方商业种猪中(杜洛克，大白和长白猪)似乎都是固定的，而在中国本地猪种和野猪中表现出更高的CC基因型频率[29, 33]。不仅如此，NR6A1基因的多态性对猪的体尺的增减[34]及家猪和野猪的区分[35]有重要影响。已有研究表明，NR6A1基因的渗入对于河南本土猪的体型大小和饲料转化率有显著影响[36]。本研究通过对NR6A1基因的全部外显子区在北京黑猪群体中进行PCR扩增，发现均是固定的TT基因型，也未发现其他与脊椎数和胴体性状显著相关的突变。
在SSC7上，VSX2(也称HOX10)由于可以阻止肋骨的形成，因此对脊椎动物脊柱腰椎区的形成至关重要[20, 37-38]。基于它的重要性，对其进行PCR扩增，发现了一个同义突变(c.536 G＞A)，这一突变对脊椎数有着显著影响。VRTN基因位于SSC7上，是影响猪多个性状的候选基因，如脊椎数变异、繁殖性状[39]等，且在脊椎形成过程中是一个关键的转录因子[40]。先前报道了VRTN变体与中国和西方猪种的胸椎数(肋骨数)显著相关，在研究中将VRTN作为获得猪高脊椎数和长度相关性状的有效选择标记，是影响几个西方猪种肉品质可能的基因标记[8-9, 41]。基于以上研究，Yang等[42]利用中国地方猪种二花脸以及白杜洛克与二花脸构建的F2群体和两个西方品种证明了VRTN突变的因果突变很可能是从中国猪种渗入欧洲猪种的。本研究在VRTN基因中发现5个3′UTR突变，3个(c.2598 A＞G、c.2607 G＞T、c.3094 A＞G)与脊椎数显著相关的SNPs；2个(c.2598 A＞G、c.2607 G＞T)与胴体长及胴体直长显著相关的SNPs；4个(c.2598 A＞G、c.2607 G＞T、c.3087 G＞C、c.3094 A＞G)与胴体斜长显著相关的SNPs。
随着研究的不断深入，在大白与民猪构建的F2资源群体中通过GWAS及单倍型的分析将SSC7上的区间缩小至951 kb，并将影响猪脊椎数的主效候选基因定位在此区间的LTBP2上[11, 13]。之后对长白猪与韩国本地猪的F2代群体进行了GWAS及单倍型的连锁与连锁不平衡分析，将关键区域定位在包括LTBP2在内的533.9 kb区域，更加验证了LTBP2基因可作为影响猪脊椎数的候选基因[12]。本研究在北京黑猪中共发现了9个3′UTR突变，其中c.7158 A＞G、c.6869 C＞T、c.6319 G＞C、c.6246 G＞T、c.6170 A＞G、c.6079 G＞T与脊椎数差异显著相关，但是与胴体性状关联不显著。
4 结论本研究通过使用410头北京黑猪对NR6A1、VSX2、VRTN和LTBP2等4个基因进行多态性探索及与脊椎数和胴体性状的关联分析，共发现15个SNPs，其中VSX2、VRTN和LTBP2上10个SNPs与脊椎数显著相关；仅VRTN上4个SNPs与胴体性状显著相关，为探索调控性状变异的候选基因功能位点和阐释性状变异的遗传机理奠定基础。
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(编辑 郭云雁)