2. 广东省兽用中药与天然药物工程技术研究中心，广州 510642
2. Guangdong Technology Research Center for Traditional Chinese Veterinary Medicine and Nature Medicine, Guangzhou 510642, China
酗酒是一个重要的全球健康问题，酒精摄入过多会引起机体肝损伤、免疫功能及脂质代谢紊乱，其中免疫功能失调在急性酒精损伤的发展中扮演着重要角色[1]。研究表明，酒精诱导的急性损伤模型中，小鼠体内炎性细胞因子、趋化因子增加，激活体内免疫系统[2]。在中医理论中，酒性湿热，过量饮酒之后，湿热毒邪蕴结体内，损伤及脾，致脾之运化功能失司，机体免疫力下降[3]。党参(Codonopsis pilosula(Franch)Nannf.)作为我国传统药物，具有健脾益气、养血生津之功效，常用于脾肺气虚、食少倦怠、咳嗽虚喘等方面的治疗[4]。现代研究表明，党参含有多种天然药理活性成分，如多糖、皂苷、生物碱、黄酮类等[5]，其中党参多糖(Codonopsis pilosula polysaccharide, CP)具有包括免疫调节、抗氧化、抗肿瘤等[6]广泛的药理作用。研究表明，CP可改善由环磷酰胺所致免疫抑制大鼠的胸腺指数、脾脏指数，提高血清免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、补体C3、补体C4水平，增强大鼠的免疫功能[7]。近年来，利用硫酸化修饰获得的硫酸化多糖具有较好的免疫调节作用[8]。本研究旨在探究硫酸化党参多糖(sulphated Codonopsis pilosula polysaccharide, SCP)对小鼠急性酒精损伤的保护作用，筛选出对急性损伤具有良好保护作用的中草药活性成分，为研制新型中兽药提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 细胞RAW 264.7细胞，来源于ATCC细胞库。
1.2 试验动物四周龄雄性昆明小鼠，体重20~25 g，购自济南朋悦实验动物繁殖有限公司，实验单位使用许可证编号：SYXK(粤)2014-0136，合格证号：37009200008032。试验期间饲喂小鼠全价饲料，自由饮水及采食，室温控制在19~25 ℃，相对湿度为30%~70%。
1.3 主要仪器与试剂BDS系列倒置生物显微镜购自重庆奥特光学仪器责任有限责任公司；Thermo 3111CO2培养箱购自美国Thermo Fisher Scientific；MK3型酶标仪购自赛默飞(上海)仪器有限公司；DMEM培养液、胎牛血清购自Gibco公司；磷酸缓冲盐溶液(PBS)、青链霉素双抗购自北京鼎国生物技术有限公司；二甲基亚砜(DMSO)购自天津市灏洋生物制品科技责任有限公司；噻唑蓝(MTT)购自索莱宝生物科技有限公司；30% H2O2试剂购自广州化学试剂厂，批号：20160401-1；ELISA检测试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司，批号：201709。
1.4 制备CP与SCP用水煎醇沉法[9]从党参饮片中提取总多糖，选用sevage法[9]去除蛋白，以DEAE-52纤维柱分离纯化，制备CP。采用氯磺酸-吡啶法[10]，以氯磺酸-吡啶(1∶6)制备酯化试剂，将CP在80 ℃下震荡反应3 h，乙醇沉淀后制备SCP。SCP的制备方法参照文献[11]；采用苯酚-硫酸法[12]，测定CP糖含量为81.20%，SCP糖含量为66.30%。
1.5 体外试验1.5.1 RAW 264.7细胞急性损伤模型建立 以10%胎牛血清DMEM培养液培养RAW 264.7细胞，待其生长至对数生长期时用于试验。将细胞浓度调整至5×104个·mL-1加入96孔板，每孔100 μL，37 ℃、5% CO2培养17 h后，在每孔分别加入不同浓度的H2O2，从浓度为200 mmol·L-1倍比稀释11个浓度，分别于0.5、1 h后，用PBS漂洗2次，DMEM培养液换液，加入MTT 30 μL，继续培养4 h，加入DMSO 100 μL，摇匀，酶联免疫仪检测570 nm处吸光值(A570值)，计算RAW 264.7细胞经H2O2氧化损伤刺激的抑制率：细胞抑制率(%)=(空白组OD组-H2O2组OD值/空白组OD值)×100。
1.5.2 SCP对H2O2诱导细胞的生长状态的影响 将处于对数生长期的RAW 264.7细胞浓度调至5×104个·mL-1，加入96孔板中，每孔100 μL，37 ℃、5% CO2培养24 h后，分别加入不同浓度的CP与SCP，加入的CP和SCP浓度根据前期预试验结果[13]筛选得出，CP浓度为2-3、2-4、2-5mg·mL-1，SCP浓度为2-5、2-6及2-7mg·mL-1。另设空白对照组(加含10%胎牛血清DMEM培养液)及阳性对照组(10 μg·mL-1)，继续培养24 h后，加入终浓度为12.5 mmol·L-1的H2O2培养1 h，建立H2O2氧化损伤；应用倒置显微镜观察H2O2刺激下各组RAW 264.7细胞生长状态。
1.5.3 SCP对H2O2诱导细胞的吞噬功能的影响 如“1.5.2”所述建立H2O2氧化损伤后，收集细胞，PBS洗涤细胞2次，各组分别加入FITC-葡聚糖，37 ℃避光孵育30、60、90 min，另设4 ℃对照组；孵育后各组加入PBS，2 000 r·min-1离心10 min，弃去上清，重复洗涤2次，除去未吸附的FITC-葡聚糖；PBS重悬细胞，配成1×106个·mL-1悬浮液，以未加FITC-葡聚糖的RAW 264.7作为阴性对照，流式细胞仪检测染色细胞荧光。
1.5.4 SCP对H2O2诱导细胞的细胞因子释放的影响 如“1.5.2”所述建立H2O2氧化损伤后，收集各组细胞上清液，采用ELISA法分别测定上清液白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-10(IL-10)、干扰素-γ(IFN-γ)的含量。
1.6 体内试验1.6.1 试验分组与处理 90只雄性昆明小鼠，适应性饲养7 d，随机分成9组，分别为空白对照组(B)，模型对照组(MO)，VC对照组(VC)，CP低、中、高剂量组(CPL、CPM、CPH)，SCP低、中、高剂量组(SCPL、SCPM、SCPH)。CP与SCP的3个剂量组分别按100、200、300 mg·kg-1小鼠体重每天进行灌胃维生素C，VC组按100 mg·kg-1小鼠体重每天进行灌胃，B和MO组给予同体积双蒸水，连续灌胃30 d，末次灌胃后，禁食16 h，除B组外其余组小鼠灌胃50%乙醇12 mL·kg-1建立小鼠急性酒精损伤模型。
1.6.2 生长情况 试验期间观察各组小鼠生长情况。分别于给药前(D0)和给药后第7(D7)、14(D14)、21(D21)及30(D30)天称量各组小鼠体重，计算平均体重，并计算平均日增重(ADG)=(终末体重-初始体重)/天数。
1.6.3 血液生理学检测 灌服乙醇6 h后，每组随机抽取5只小鼠，摘眼球采抗凝血，用全自动血细胞分析仪测定血液中白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血小板(PLT)、血红蛋白(HGB)、淋巴细胞(LYM)和红细胞比容(HCT)的含量变化。
1.6.4 血清生化学检测 灌服乙醇6 h后，每组随机抽取5只小鼠，摘眼球采血，析出血清，用全自动血生化分析仪测定血清中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、乳酸脱氢酶(LDH)的含量变化。
1.6.5 血清免疫因子测定 灌服乙醇6 h后，每组随机抽取5只小鼠，摘眼球采血，分离血清，用ELISA法测定IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的含量。
1.6.6 脏器指数 造模6 h后，分别对每组小鼠称量体重，剖检，取心、肝、脾、肺、肾，称重，计算脏器指数。脏器指数=脏器重量(mg)/体重(g)。
1.7 数据处理试验数据用SPSS 22.0统计分析软件单因素ANOVA分析各组间的差异显著性，通过Duncan’s新复极差检验法进行各组间的多重比较，结果以“平均数±标准误”表示。采用GraphPad Prism 5软件制作柱状图。
2 结果 2.1 RAW 264.7细胞急性损伤模型建立不同浓度、不同作用时间下H2O2刺激RAW 264.7细胞的抑制率如图 1所示，200 mmol·L-1的H2O2对RAW 264.7的抑制率均最高，随着H2O2浓度的降低对RAW 264.7细胞的抑制作用呈下降趋势，25~200 mmol·L-1的H2O2作用0.5 h下对RAW 264.7细胞的抑制率>50%；12.5~200 mmol·L-1 H2O2作用1 h对RAW 264.7细胞的抑制率>50%，且12.5与25、50 mmol·L-1 H2O2作用1 h的抑制率无显著差异(P>0.05)。因此，选择12.5 mmol·L-1H2O2作用1 h建立RAW 264.7细胞急性损伤模型。
|
A. H2O2刺激0.5 h；B. H2O2刺激1 h。柱上不同字母表示差异显著(P < 0.05) A. H2O2 stimulate 0.5 h; B. H2O2 stimulate 1 h. Different letters on the colum indicate significant difference (P < 0.05) 图 1 不同浓度H2O2对RAW 264.7细胞的抑制率 Fig. 1 Inhibition rate of different concentrations of H2O2 on RAW 264.7 cells |
各组RAW 264.7细胞生长状态如表 1所示，B组细胞生长状态良好，贴壁性好，个别细胞有轻微分化，细胞密度大，局部细胞发生复层；MO组细胞贴壁不良，大部分细胞发生完全分化，细胞较为稀疏，密度较B组低，培养液中略微存在细胞碎片。除CPL组细胞密度较低外，其余各给药组细胞生长状态良好，密度较大，局部细胞出现复层，与B组相似。其中SCP各组的细胞密度、生长状态较佳，与B组及VC组相似。
|
表 1 各组对H2O2刺激下RAW 264.7细胞生长状态的影响 Table 1 Effects of each group on cell growth of RAW 264.7 stimulated by H2O2 |
由表 2可知，4 ℃条件下，除SCPL组外，各组细胞的吞噬率均最低；37 ℃条件下，随作用时间的延长，各组细胞的吞噬率呈上升趋势。不同温度与作用时间下MO组的细胞吞噬率均最低，37 ℃时显著低于B组。4 ℃条件下，SCPL、SCPM、CPL组显著高于MO组(P < 0.05)，且SCPL、SCPM、CPL组吞噬率与VC组差异不显著(P>0.05)；37 ℃下作用30 min，除SCPL组外，其余各组吞噬率均显著高于MO组(P < 0.05)，其中SCPH、CPM组与VC组差异不显著(P>0.05)；作用60 min，SCPL、CPL组与VC组差异不显著(P>0.05)，SCPM组显著高于VC组(P < 0.05)；作用90 min，除CPM组外，各组吞噬率均显著高于MO组(P < 0.05)，其中SCPL、SCPM组与VC组差异不显著(P>0.05)。SCP对H2O2刺激下RAW 264.7细胞的吞噬作用优于CP，尤其是SCPL、SCPM组。
|
|
表 2 各组对H2O2刺激下RAW 264.7细胞的吞噬率影响 Table 2 Effects of each group on the phagocytosis rate of RAW 264.7 cells stimulated by H2O2 |
由表 3可知，各组IL-2水平，与B组相比，MO组显著降低(P < 0.05)，各SCP与CP组的IL-2水平均升高，与B组无显著差异(P>0.05)；IL-4水平，与B组相比，MO组IL-4水平显著升高(P < 0.05)，SCPL、SCPM、SCPH及CPH组IL-4水平显著低于VC组(P < 0.05)；IL-10水平，与B组相比，MO组IL-10水平降低，VC、CPL、SCPH和SCPL组IL-10水平高于MO组，且SCPH组IL-10水平高于VC组，但各组之间差异不显著(P>0.05)；IFN-γ水平，与B组相比，MO组IFN-γ水平显著降低(P < 0.05)，各SCP与CP组的IFN-γ含量显著高于MO组(P < 0.05)，其中SCPL、CPL组与B组、VC组差异不显著(P>0.05)。SCP各组对IL-4分泌的抑制作用以及对IFN-γ、IL-10分泌的促进作用优于CP各组，对IL-2分泌的促进作用与CP各组无显著差异，因此SCP对急性损伤细胞分泌细胞因子的调节作用效果优于CP。
|
|
表 3 各组对RAW 264.7细胞分泌细胞因子水平影响(n=5) Table 3 Effects of each group on the cytokine secretion level of RAW 264.7 cells (n=5) |
观察各组小鼠30 d内的生长情况，各组小鼠均精神正常、饮食正常，被毛顺滑，无脱毛或毛发杂乱现象。如表 4所示，在D0，各组小鼠体重无显著差异(P>0.05)；在D7，SCPH组小鼠体重显著高于B组与MO组体重(P < 0.05)；D14，SCPH组小鼠体重显著高于B组(P < 0.05)；在D21，SCPH、CPM组小鼠较其他组高，但无显著差异(P>0.05)；在D30，SCPH、CPL组小鼠体重较其余组高，但无显著差异(P>0.05)；各组小鼠平均日增重无显著差异(P>0.05)。
|
|
表 4 各组小鼠的生长情况(n=10) Table 4 Growth of mice in each group (n=10) |
根据表 5，各组WBC结果显示，与B组相比，MO组WBC数量升高，且高于正常范围4.63×109~ 7.63×109个·L-1[14]，SCPL、SCPM、CPL和CPH组能够使WBC恢复至正常水平(P < 0.05)；RBC结果显示，MO组处于正常范围9.11×1012~13.17×1012个·L-1，但与B组相比显著下降(P < 0.05)，各给药组RBC数量均较MO组上升，其中SCPH以及CP各组显著升高(P < 0.05)；小鼠PLT正常范围为762.93×109~1 189.91×109个·L-1，而本研究中VC组PLT以及各给药组均高于正常范围，这可能是因为雄性小鼠PLT水平会随着年龄的增长而增加；HGB正常范围为141.69~173.81 g·L-1，MO组HGB低于正常范围，除SCPM组外，各给药组可升高HGB至正常范围；LYM的正常范围为57%~85%，MO组LYM在正常范围内，但有升高趋势，SCPM以及CP各组LYM较MO组显著下降(P < 0.05)；HCT的正常范围为44%~56%，MO组HCT处于正常范围，但存在下降趋势，SCPH组以及CP各组HCT较MO组显著上升(P < 0.05)。SCP能够恢复小鼠血液中WBC、HGB至正常水平，一定程度上改善酒精损伤小鼠的血液生理学指标。
|
|
表 5 各组小鼠的血液生理指标(n=5) Table 5 Blood physiological indexes of mice in each group (n=5) |
TG正常生理范围为1.06~2.20 mmol·L-1 [14]，由表 6可知，MO组为(4.10±0.78)mmol·L-1，显著高于正常生理范围(P < 0.05)，SCPL和SCPM组能够使TG含量恢复至正常范围(P < 0.05)；TC正常生理范围为2.86~3.64 mmol·L-1 [15]，MO组为(1.96±0.17)mmol·L-1，显著低于生理范围(P < 0.05)，除SCPL和VC组外，各给药组显著升高(P < 0.05)，其中SCPM和SCPH组使TC恢复至正常范围，效果最佳；LDH正常生理范围为1 325.8~2 193.3 U·L-1 [16]，MO组小鼠LDH为(607.25±245.00)U·L-1，显著低于生理范围(P < 0.05)，SCP和CP均能显著升高LDH至正常范围(P < 0.05)。SCP和CP均能恢复小鼠血清中TG、TC、LDH至正常水平，改善酒精损伤小鼠的血清生化学指标，其中SCP对TG和TC的恢复作用优于CP。
|
|
表 6 各组小鼠的血液生化指标(n=5) Table 6 Blood biochemical indexes of mice in each group (n=5) |
由表 7可看出，与B组相比，MO组IL-2水平显著下降(P < 0.05)，与MO组相比，各给药组IL-2水平显著升高(P < 0.05)，与B组无明显差异(P＞0.05)，其中SCPL、SCPM、CPH组IL-2水平最高；在分泌IL-4水平上，MO组对比B组显著升高(P < 0.05)，各给药组较MO组显著降低(P < 0.05)，其中SCPL、SCPM、SCPH、CPM、CPH组显著低于VC组(P < 0.05)，SCP各组的IL-4水平最低；IL-10水平，MO组对比B组有下降趋势，CPL、CPM组较MO组略有升高；各组分泌IFN-γ水平中，与B组相比，MO组显著下降(P < 0.05)，与MO组相比，除CPH、SCPL组外，各给药组显著升高(P < 0.05)，与B组无明显差异(P＞0.05)，其中SCPH、CPL组IFN-γ水平最高。SCP各组对IL-4分泌的抑制作用优于CP各组，对IL-2、IFN-γ分泌的促进作用与CP各组无显著差异。说明SCP和CP对急性损伤小鼠分泌细胞因子具有一定调节作用，且SCP对IL-4分泌的抑制作用优于CP。
|
|
表 7 各组小鼠血清细胞因子水平(n=5) Table 7 Serum cytokine levels of mice in each group (n=5) |
如表 8所示，与B组相比，MO组小鼠肝脏指数显著升高(P < 0.05)，与MO组相比，各给药组肝脏指数显著降低(P < 0.05)，且与B组差异不显著(P>0.05)，其中SCPL、CPL、CPM组肝脏指数最低；各组小鼠心、脾、肺、肾等器官的脏器指数无显著差异(P>0.05)。SCP各组对小鼠肝脏指数恢复作用与CP无显著差异，说明SCP与CP均能改善酒精造成的小鼠急性肝损伤。
|
|
表 8 各组小鼠的脏器指数(n=10) Table 8 Organ index of mice in each group (n=10) |
吞噬作用是生物体内巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞等免疫细胞识别和吞噬外来物质的功能，是生物体的基本防御机制[17]。其中，巨噬细胞能够参与特异性免疫和非特异性免疫，对特定的细胞碎片及病原体进行吞噬和消化，并且分泌白介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-12(IL-12)等促炎因子，进行免疫调节[18]。研究表明，CP可显著提升小鼠巨噬细胞吞噬能力[19]，且能显著提高巨噬细胞TNF-α和IL-1β的分泌量[20]，促进抗体产生，增强小鼠非特异性免疫功能[21]。目前许多研究显示，硫酸化修饰后的多糖免疫活性增强，如硫酸化枸杞多糖能显著促进巨噬细胞的增殖，提高其吞噬功能[22]，紫菜硫酸多糖可通过调节巨噬细胞、T细胞、B细胞等发挥其免疫调节作用[23]。本试验结果显示，不同温度与作用时间下MO组的细胞吞噬率均最低，显著低于B组，表明H2O2刺激下RAW 264.7细胞的吞噬作用降低，4 ℃条件下，SCPL、SCPM及CPL组的细胞吞噬率显著高于MO组；37 ℃条件下，随作用时间的延长，RAW 264.7细胞的吞噬率逐渐升高，SCP对H2O2刺激下RAW 264.7细胞的吞噬作用优于CP，尤其是SCPL、SCPM组。因此，SCP促进细胞吞噬的效果优于CP，这可能是由于SCP促进了巨噬细胞的增殖，并诱导其向M1型分化，故能显著提高巨噬细胞的吞噬功能。
3.2 SCP对乙醇刺激小鼠脏器指数的影响脏器指数能够反映出动物机体中各脏器的生长发育情况，间接体现出各脏器的功能强弱、损伤程度，其中肝是动物体内重要的代谢器官之一[24]。试验第30天，采取乙醇灌胃的方法制造小鼠急性损伤模型。此方法对于急性损伤的研究领域比较常见，灌胃乙醇后小鼠肝细胞排列紊乱、出现水肿、炎性细胞浸润[25]。本试验中，SCP和CP能够降低肝脏指数，说明SCP与CP能够缓解乙醇造成的肝损伤。
3.3 SCP对乙醇刺激小鼠血液生理指标的影响血常规检测是诊断血液疾病的基础检查手段，可判断体内炎症、贫血或凝血等问题[26]。WBC、LYM、PLT升高常见于各种感染与炎症性疾病，RBC、HGB、HCT的降低则表示有贫血、出血等现象。本试验中MO组小鼠血液WBC、LYM水平显著升高，其中WBC高于正常生理范围，提示小鼠存在炎症；RBC、HGB、HCT、PLT水平降低，其中HGB低于正常生理范围，提示小鼠存在出血、贫血现象。SCP和CP则可以不同程度地改善小鼠血液生理学指标，将WBC和HGB恢复至正常水平，具有一定的抗炎、促凝作用。其作用机制可能与抑制白细胞的产生以及促进血小板的产生有关，从而起到降低体内炎症、调节机体免疫功能的作用。
3.4 SCP对乙醇刺激小鼠血清生化指标的影响血清生化检测可反映机体各器官的代谢水平，用于内脏疾病的诊断[27]。TG表示血清中的血脂含量，TG过高提示肝和肾存在炎症或损伤。本试验中MO组小鼠TG显著高于正常生理范围，而SCP和CP均将其恢复至正常范围，从而缓解肝和肾损伤。TC为血清总胆固醇，TC过低提示存在肝损伤。MO组TC显著低于生理范围，除SCPL组外，各给药组升高TC至正常范围，改善肝损伤。LDH表示乳酸脱氢酶，广泛分布于各个器官，其中心、肾、骨骼肌中含量最丰富。因此LDH异常提示肾或心存在损伤。MO组小鼠LDH显著低于生理范围，SCP和CP均能升高LDH至正常范围，改善肾损伤。本试验中MO组小鼠血清中TG、TC、LDH含量异常，超出正常生理范围，提示小鼠造模后出现肝和肾损伤，因此，本试验中酒精诱导小鼠急性损伤模型造模成功。SCP和CP均能使TG、TC、LDH恢复至正常水平，改善急性酒精性损伤小鼠血生化指标，其中SCP对TG和TC的恢复效果优于CP，对小鼠急性损伤具有保护作用。
3.5 SCP对H2O2刺激的巨噬细胞以及乙醇刺激的小鼠分泌免疫因子的影响IL-2是一种T细胞生长因子，对T细胞的成熟、增殖、分化至关重要[28]，还可增强NK细胞的细胞溶解活性，并促进B细胞产生免疫球蛋白[29]。机体内IL-2的表达失调与免疫疾病相关，常作为治疗疾病的靶点[30]。研究表明，正常小鼠服用复方党参口服液后血清中的IL-2基因的表达量显著升高[31]。硫酸化后的多糖能够升高免疫抑制型鸡外周血IL-2水平[32]，从而提高免疫功能，还能够显著提高雏鸭体内IL-2水平[33]，提高其抗病毒功能。在本研究中，体外试验结果显示，各SCP与CP组的IL-2水平均升高，且与B组无显著差异，表明SCP和CP能够显著促进细胞分泌IL-2。在体内试验中，SCP和CP能够显著提升IL-2水平，其中SCPL及CPH组效果最佳，优于VC组。体内试验结果与体外试验结果相一致。提示SCP和CP可能通过提高IL-2的分泌量，促进T细胞的增殖与分化，刺激B细胞的增殖，从而提高机体免疫功能。
IL-4是一种来源于T细胞的B细胞生长因子，可以触发Th2细胞分化、M2巨噬细胞极化[34]，还能够促进巨噬细胞表达抗原，杀死肿瘤细胞，参与MHCⅡ类抗原的调节和FcR的表达[35]。研究显示，党参炮制品能够降低免疫抑制家兔血清中过高的IL-4水平[36]。硫酸化后的多糖降低IL-4效果更加显著[37]，能够降低鸡骨髓源树突状细胞分泌IL-4水平[32]。在体外试验与体内试验中，SCP和CP均能显著降低IL-4水平，说明SCP和CP可能通过抑制机体分泌IL-4，降低机体特异性免疫反应，增强非特异性免疫反应，从而调节免疫功能；其中SCP各组IL-4水平显著低于VC组(P < 0.05)，表明SCP降低IL-4水平作用优于CP。
IL-10是一种炎症与免疫抑制因子，能够抑制Th1细胞IL-2和IFN-γ的分泌[38]，抑制IL-22、IL-20、IL-19等促炎细胞因子、趋化因子和趋化因子受体的表达[39]。本试验中SCP和CP在一定程度上能够促进IL-10水平，且SCP各组的促进效果优于CP，与前人报道一致[40]，说明SCP可能通过抑制促炎因子，缓解机体炎症反应，起到免疫调节作用。
IFN-γ能够激活巨噬细胞，诱导巨噬细胞趋向于M1型极化[41]，还能够调节癌细胞和受感染细胞的免疫状态[42]。研究显示，党参多糖纳米乳灌胃免疫抑制模型小鼠能够提高其IFN-γ水平[43]。本研究体外试验结果显示，SCP和CP能够显著促进IFN-γ分泌，与前人研究结果相一致[34, 44]。体内试验结果与体内试验结果相近，其中SCPH组对IFN-γ分泌的促进作用优于CP，尤其是SCPH组。说明SCP能够通过促进IFN-γ分泌，刺激巨噬细胞向M1型分化，增强其吞噬活功能，从而提高机体的非特异性免疫功能。
4 结论一定浓度的SCP和CP可缓解H2O2建立的RAW 264.7细胞急性损伤的细胞贴壁不良、密度降低、细胞死亡等现象，促进细胞分泌IL-2、INF-γ，在促进巨噬细胞吞噬、抑制细胞分泌IL-4方面，SCP的效果优于CP。乙醇建立的小鼠急性损伤模型中，一定浓度的SCP和CP可升高小鼠血液中RBC、HGB、HCT、PLT含量，降低WBC、LYM含量；升高血清中TC、LDH含量，降低TG含量；提高细胞因子IL-2、INF-γ分泌水平，降低IL-4分泌水平。在改善血清中IL-4、TG和TC含量方面，SCP效果优于CP。
| [1] |
卓怡云, 吕婧, 刘颖, 等. 纳豆激酶对大鼠酒精性肝损伤的改善效果及免疫调节作用[J]. 食品科学, 2019, 40(7): 156-162. ZHUO Y Y, LV J, LIU Y, et al. Nattokinase alleviates alcoholic liver injury and modulates immune function in rats[J]. Food Science, 2019, 40(7): 156-162. (in Chinese) |
| [2] |
LAMAS-PAZ A, HAO F J, NELSON L J, et al. Alcoholic liver disease: Utility of animal models[J]. World J Gastroenterol, 2018, 24(45): 5063-5075. DOI:10.3748/wjg.v24.i45.5063 |
| [3] |
赵瑜, 唐义爽, 毛羽丰, 等. 脾虚血瘀——酒精性肝损伤的基本病机[J]. 世界科学技术-中医药现代化, 2016, 18(9): 1488-1492. ZHAO Y, TANG Y S, MAO Y F, et al. Spleen-deficiency and blood-stasis is the basic pathogenesis of alcoholic liver injury[J]. World Science and Technology-Modernization of Traditional Chinese Medicine, 2016, 18(9): 1488-1492. (in Chinese) |
| [4] |
徐灵胎. 徐灵胎《神农本草经百种录》[J]. 光明中医, 2015, 30(2): 232-251. XU L T. Xu Lingtai's hundred species records of Shennong Materia Medica[J]. Bright Traditional Chinese Medicine, 2015, 30(2): 232-251. (in Chinese) |
| [5] |
谢琦, 程雪梅, 胡芳弟, 等. 党参化学成分、药理作用及质量控制研究进展[J]. 上海中医药杂志, 2020, 54(8): 94-104. XIE Q, CHENG X M, HU F D, et al. Research advance on chemical constituents, pharmacological action and quality control of Radix Codonopsis[J]. Shanghai Journal of Traditional Chinese Medicine, 2020, 54(8): 94-104. (in Chinese) |
| [6] |
金俊奇, 陈代文, 毛湘冰, 等. 党参多糖的生物学功能及其在畜牧生产中的应用[J]. 动物营养学报, 2021, 33(5): 2527-2534. JIN J Q, CHEN D W, MAO X B, et al. Biological function and application of Codonopsis pilosula polysaccharide in animal production[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2021, 33(5): 2527-2534. (in Chinese) |
| [7] |
许朋, 余兰, 冯昆. 党参多糖的提取及体内外免疫作用的研究[J]. 哈尔滨医药, 2018, 38(4): 301-303. XU P, YU L, FENG K. Extraction of polysaccharides from Codonopsis pilosula in vivo, in vitro immunization of polysaccharide[J]. Harbin Medical Journal, 2018, 38(4): 301-303. (in Chinese) |
| [8] |
CUI M X, WU J W, WANG S Y, et al. Characterization and anti-inflammatory effects of sulfated polysaccharide from the red seaweed Gelidium pacificum Okamura[J]. Int J Biol Macromol, 2019, 129: 377-385. DOI:10.1016/j.ijbiomac.2019.02.043 |
| [9] |
李启艳, 胡德福, 张雪梅, 等. 党参多糖提取纯化工艺优化及其组成研究[J]. 中草药, 2016, 47(15): 2663-2667. LI Q Y, HU D F, ZHANG X M, et al. Optimization of extraction process of Codonopsis pilosula polysaccharides and study on its composition[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2016, 47(15): 2663-2667. (in Chinese) |
| [10] |
WANG Z J, XIE J H, KAN L J, et al. Sulfated polysaccharides from Cyclocarya paliurus reduce H2O2-induced oxidative stress in RAW264.7 cells[J]. Int J Biol Macromol, 2015, 80: 410-417. DOI:10.1016/j.ijbiomac.2015.06.031 |
| [11] |
LIU C, CHEN J, LI E T, et al. The comparison of antioxidative and hepatoprotective activities of Codonopsis pilosula polysaccharide (CP) and sulfated CP[J]. Int Immunopharmacol, 2015, 24(2): 299-305. DOI:10.1016/j.intimp.2014.12.023 |
| [12] |
王彦平, 娄芳慧, 陈月英, 等. 苯酚-硫酸法测定紫山药多糖含量的条件优化[J]. 食品研究与开发, 2021, 42(4): 170-174. WANG Y P, LOU F H, CHEN Y Y, et al. Optimization of analytical conditions for the determination of polysaccharides contents in purple yam by phenol-sulfuric acid method[J]. Food Research and Development, 2021, 42(4): 170-174. (in Chinese) |
| [13] |
孙嘉琪. 硫酸化党参多糖对巨噬细胞及小鼠急性氧化损伤的保护作用[D]. 广州: 华南农业大学, 2018. SUN J Q. Protective effeet of sulfated codonopsis pilosula polysaccharide on oxidative injury in macrophages and mice[D]. Guangzhou: South China Agricultural University, 2018. (in Chinese) |
| [14] |
王俊风, 施美莲, 吴艳秋, 等. GF级KM小鼠生长曲线、主要脏器参数及生理生化指标的测定分析[J]. 中国比较医学杂志, 2012, 22(3): 17-22. WANG J F, SHI M L, WU Y Q, et al. Analysis of growth curve, organ parameter and physiology and biochemistry indicators in germ-free KM mice[J]. Chinese Journal of Comparative Medicine, 2012, 22(3): 17-22. DOI:10.3969/j.issn.1671.7856.2012.03.004 (in Chinese) |
| [15] |
夏介英, 雷培琪, 曾晓兰, 等. SPF级KM小鼠主要脏器重量和血液生化值的测定[J]. 四川生理科学杂志, 2009, 31(3): 104-107. XIA J Y, LEI P Q, ZENG X L, et al. Determinations to the weight of main organs and biochemical indexes of SPF KM mice[J]. Sichuan Journal of Physiological Sciences, 2009, 31(3): 104-107. DOI:10.3969/j.issn.1671-3885.2009.03.004 (in Chinese) |
| [16] |
王冬平, 李慕, 尚世臣, 等. 不同日龄SPF级KM小鼠血液生理生化正常指标的探讨[J]. 实验动物科学, 2008, 25(4): 5-8. WANG D P, LI M, SHANG S C, et al. Establishment of normal range and values of blood physiological and biochemiccal data measurements in SPF KM mice[J]. Laboratory Animal Science, 2008, 25(4): 5-8. DOI:10.3969/j.issn.1006-6179.2008.04.002 (in Chinese) |
| [17] |
GORDON S. Phagocytosis: An immunobiologic process[J]. Immunity, 2016, 44(3): 463-475. DOI:10.1016/j.immuni.2016.02.026 |
| [18] |
SHAPOURI-MOGHADDAM A, MOHAMMADIAN S, VAZINI H, et al. Macrophage plasticity, polarization, and function in health and disease[J]. J Cell Physiol, 2018, 233(9): 6425-6440. DOI:10.1002/jcp.26429 |
| [19] |
褚旭, 刘晓菊, 邱敬满, 等. 党参多糖对细颗粒物所致慢性阻塞性肺疾病小鼠肺泡巨噬细胞吞噬功能障碍加剧的抑制作用[J]. 中华医学杂志, 2016, 96(14): 1134-1138. CHU X, LIU X J, QIU J M, et al. Inhibitory effects of Codonopsis pilosula polysaccharides on the deterioration of impaired phagocytosis of alveolar macrophage induced by fine particulate matter in chronic obstructive pulmonary disease mice[J]. National Medical Journal of China, 2016, 96(14): 1134-1138. DOI:10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2016.14.016 (in Chinese) |
| [20] |
史宝忠, 胡建燃, 李平, 等. 党参多糖对Ana-1巨噬细胞和小鼠的免疫调节作用[J]. 生物技术通报, 2019, 35(6): 114-118. SHI B Z, HU J R, LI P, et al. Immunoregulatory effect of polysaccharides from Codonopsis pilosula on the Ana-1 macrophages in mice[J]. Biotechnology Bulletin, 2019, 35(6): 114-118. (in Chinese) |
| [21] |
曹发昊, 王艳萍. 党参总皂苷纳米乳对小鼠免疫功能的影响[J]. 西北农林科技大学学报: 自然科学版, 2019, 47(5): 125-131. CAO F H, WANG Y P. Effect of total saponins of Codonopsis pilosula nanoemulsion on immunologic function of mice[J]. Journal of Northwest A&F University: Natural Science Edition, 2019, 47(5): 125-131. (in Chinese) |
| [22] |
孙玉姣, 高润凝, 崔湘怡, 等. 枸杞多糖及其硫酸化产物的免疫调节活性[J]. 陕西科技大学学报, 2020, 38(1): 44-49, 70. SUN Y J, GAO R N, CUI X Y, et al. The immunoregulatory activity of Lycium barbarum polysaccharides and their sulfated products[J]. Journal of Shaanxi University of Science & Technology, 2020, 38(1): 44-49, 70. DOI:10.3969/j.issn.1000-5811.2020.01.008 (in Chinese) |
| [23] |
周钰, 刘庆梅, 张亚芬, 等. 紫菜硫酸多糖对修复过敏引起的肠道屏障损伤和改善肠道菌群的机理研究[C]//第十五届益生菌与健康国际研讨会摘要集. 南京: 中国食品科学技术学会, 2020: 2. ZHOU Y, LIU Q M, ZHANG Y F, et al. Study on the effect of nori sulfate polysaccharide on the repair of intestinal barrier damage caused by allergy and the improvement of intestinal microflora[C]//Abstracts of the 15th International Symposium on Probiotics and Health. Nanjing: Chinese Society of Food Science and Technology, 2020: 2. (in Chinese) |
| [24] |
伏晓玉, 王欣荣, 杨洋, 等. 重金属蓄积对小鼠生长发育及脏器生理的影响[J]. 畜牧兽医杂志, 2021, 40(4): 38-42. FU X Y, WANG X R, YANG Y, et al. Effects of heavy metal accumulation on growth and organ physiology of mice[J]. Journal of Animal Science and Veterinary Medicine, 2021, 40(4): 38-42. (in Chinese) |
| [25] |
张瞭飞, 姜欣, 李一澍, 等. 4-甲基愈创木酚对酒精性肝损伤小鼠的保护作用[J]. 食品与发酵工业, 2021, 47(18): 92-98. ZHANG L F, JIANG X, LI Y S, et al. Protective effect of 4-methyl guaiacol on alcoholic liver injury in mice[J]. Food and Fermentation Industries, 2021, 47(18): 92-98. (in Chinese) |
| [26] |
王志伟. 血常规指标综合分析在白血病诊断的临床应用分析[J]. 中外医疗, 2016, 35(1): 65-66. WANG Z W. Application value of comprehensive analysis of blood routine index in the diagnosis of Leukaemia[J]. China & Foreign Medical Treatment, 2016, 35(1): 65-66. (in Chinese) |
| [27] |
于春艳. 血生化指标和纤维化指标在肝硬化患者中的表达价值分析及临床意义研究[J]. 中国医学创新, 2021, 18(14): 159-163. YU C Y. Study on the expression value and clinical significance of blood biochemical indexes and fibrosis indexes in patients with liver cirrhosis[J]. Medical Innovation of China, 2021, 18(14): 159-163. DOI:10.3969/j.issn.1674-4985.2021.14.038 (in Chinese) |
| [28] |
ABBAS A K, TROTTA E, SIMEONOV D R, et al. Revisiting IL-2:biology and therapeutic prospects[J]. Sci Immunol, 2018, 3(25): eaat1482. DOI:10.1126/sciimmunol.aat1482 |
| [29] |
GAFFEN S L, LIU K D. Overview of interleukin-2 function, production and clinical applications[J]. Cytokine, 2004, 28(3): 109-123. DOI:10.1016/j.cyto.2004.06.010 |
| [30] |
MITRA S, LEONARD W J. Biology of IL-2 and its therapeutic modulation: mechanisms and strategies[J]. J Leukoc Biol, 2018, 103(4): 643-655. DOI:10.1002/JLB.2RI0717-278R |
| [31] |
张新强, 白凌云. 复方党参口服液对正常小鼠IL-2基因表达的影响[J]. 畜牧兽医科技信息, 2013(8): 16-17. ZHANG X Q, BAI L Y. Effects of compound Dangshen oral liquid on expression of IL-2 gene in normal mice[J]. Chinese Journal of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, 2013(8): 16-17. DOI:10.3969/J.ISSN.1671-6027.2013.08.011 (in Chinese) |
| [32] |
姚丽丽, 白霖, 谭盈, 等. 紫锥菊多糖与硫酸化紫锥菊多糖颉颃环磷酰胺对雏鸡免疫抑制作用的研究[J]. 中国畜牧兽医, 2019, 46(10): 3084-3094. YAO L L, BAI L, TAN Y, et al. Study on antagonistic effects of Echinacea purpurea polysaccharide and sulfated Echinacea purpurea polysaccharide on immunosuppression of cyclophosphamide in chickens[J]. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2019, 46(10): 3084-3094. (in Chinese) |
| [33] |
BROWN M A, HURAL J. Functions of IL-4 and control of its expression[J]. Crit Rev Immunol, 2017, 37(2-6): 181-212. DOI:10.1615/CritRevImmunol.v37.i2-6.30 |
| [34] |
CHEN Y, SONG M Y, WANG Y X, et al. The anti-DHAV activities of Astragalus polysaccharide and its sulfate compared with those of BSRPS and its sulfate[J]. Carbohydr Polym, 2015, 117: 339-345. DOI:10.1016/j.carbpol.2014.09.071 |
| [35] |
HO I C, MIAW S C. Regulation of IL-4 expression in immunity and diseases[J]. Adv Exp Med Biol, 2016, 941: 31-77. |
| [36] |
刘佳, 杨显朝, 刘娟. 党参炮制品对脾虚家兔胃肠激素、免疫功能及环核苷酸水平的影响[J]. 中国兽医学报, 2020, 40(3): 620-624, 659. LIU J, YANG X C, LIU J. Effects of Codonopsis pilosula on gastrointestinal hormone, immune function and cyclic nucleotide level in rabbits with spleen[J]. Chinese Journal of Veterinary Science, 2020, 40(3): 620-624, 659. (in Chinese) |
| [37] |
YAO L L, BAI L, TAN Y, et al. The immunoregulatory effect of sulfated Echinacea purpurea polysaccharide on chicken bone marrow-derived dendritic cells[J]. Int J Biol Macromol, 2019, 139: 1123-1132. DOI:10.1016/j.ijbiomac.2019.08.028 |
| [38] |
BEDKE T, MUSCATE F, SOUKOU S, et al. IL-10-producing T cells and their dual functions[J]. Semin Immunol, 2019, 44: 101335. DOI:10.1016/j.smim.2019.101335 |
| [39] |
OUYANG W J, RUTZ S, CRELLIN N K, et al. Regulation and functions of the IL-10 family of cytokines in inflammation and disease[J]. Annu Rev Immunol, 2011, 29: 71-109. DOI:10.1146/annurev-immunol-031210-101312 |
| [40] |
刘庆梅. 海洋来源的龙须菜硫酸寡糖和Butyrolactone-Ⅰ的抗食物过敏活性研究[D]. 厦门: 集美大学, 2019. LIU Q M. The anti-food allergic activities of marine-derived Gracilaria Lemaneiformis sulfated oligosaccharides and butyrolactone-I[D]. Xiamen: Jimei University, 2019. (in Chinese) |
| [41] |
MEZOUAR S, MEGE J L. Changing the paradigm of IFN-γ at the interface between innate and adaptive immunity: macrophage-derived IFN-γ[J]. J Leukoc Biol, 2020, 108(1): 419-426. DOI:10.1002/JLB.4MIR0420-619RR |
| [42] |
LIN C F, LIN C M, LEE K Y, et al. Escape from IFN-γ-dependent immunosurveillance in tumorigenesis[J]. J Biomed Sci, 2017, 24(1): 10. DOI:10.1186/s12929-017-0317-0 |
| [43] |
时菲菲, 王妲妲, 曹金花, 等. 双连续型党参多糖纳米乳对免疫抑制小鼠的免疫调节作用[J]. 动物营养学报, 2020, 32(12): 5925-5931. SHI F F, WANG D D, CAO J H, et al. Immunomodulatory effects of W/O/W Codonopsis pillosula polysaccharide nanoemulsion on immunosuppressed mice[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2020, 32(12): 5925-5931. (in Chinese) |
| [44] |
邵明惠. 松花粉多糖酯化前后对H22荷瘤小鼠抗肿瘤及免疫调节的研究[D]. 济南: 山东师范大学, 2019. SHAO M H. Studies on the anti-tumor and immunomodulatory effects of pine pollen polysaccharide on H22 tumor-bearing mice before and after sulfated[D]. Ji'nan: Shandong Normal University, 2019. (in Chinese) |
(编辑 范子娟)