当机体的凝血过程被异常触发时，心血管系统中流动的血液发生凝集，形成血栓[1]。血栓的形成会引起肺梗死、心肌梗死等各种血栓性疾病，造成机体各组织和器官的坏死。目前，临床上经常使用抗凝药物来治疗血栓性疾病，但是抗凝药物或制剂使用过多可造成机体出血、凝血功能障碍等副作用[2]。因此，寻找一种对凝血和抗凝血功能具有双向调控作用的药物有助于为兽医临床治疗血栓和出血提供参考。微血管内皮细胞(microvascular endothelial cells, MECs)作为微血管通透性的主要物理屏障，通过分泌血小板激活因子和黏附蛋白、血栓调节蛋白、纤溶酶原激活剂抑制物和蛋白聚糖等活性因子调控和维持正常血液状态[3-4]，是一种具有多种功能的分泌细胞[5]。
益母草历有“经产良药”、“血家圣药”之称，不仅具有活血通经的功效[6-7]，还具有一定的止血和凝血作用[8-9]。iTRAQ技术作为蛋白组学的核心技术之一，具有通量高、重复性好、定量准确的优势[10]，被广泛应用在中药及中药方剂、中医证候、药效评价和药物安全性的研究中[11]。本实验室前期研究证明，益母草水煎液可以提高人合谷穴微血管舒缩活动振幅(数据未发表)，所以本研究选取人真皮微血管内皮细胞(human dermal microvascular endothelial cells, HDMECs)通过iTRAQ技术探究益母草水煎液对HDMECs凝血级联通路相关活性因子的作用，有助于益母草对兽医临床血栓和出血相关病症治疗的深入研究。
1 材料与方法 1.1 主要材料永生化改造后的人真皮微血管内皮细胞(HDMECs)由兽医学(中医药)北京市重点实验室留存；益母草(北京同仁堂)，ECM(美国Sciencell)，MTT(美国Sigma)，DMSO(美国Sigma)，血浆去高丰度蛋白试剂盒(美国ThermoFisher)，TiO2(日本岛津)，反转录试剂盒(江苏康为世纪)，人抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)试剂盒、人凝血酶原片段F2试剂盒购自江苏雨桐生物科技有限公司，qPCR试剂盒(美国KAPA Biosystems)，TRIzol(美国invitrogen)，TMT标记试剂盒、iTRAQ标记试剂盒、TFA、TEAB、DTT均购自上海生工生物工程有限公司。
1.2 益母草水煎液的制备称取200 g益母草，2 L蒸馏水浸泡30 min，武火煮沸后转文火煮1 h，过滤倒出药液；药渣重复煎煮1次，合并2次药液，过滤3次，旋转蒸发仪浓缩至相应浓度(0.49、0.98、1.96、3.92、7.84、15.68、31.36、50.00、62.72、100.00、125.00、500.00和1 000.00 μg·mL-1)于4 ℃冰箱保存备用。
1.3 MTT法筛选益母草对HDMECs的最大安全浓度取第10代HDMECs接种于96孔板中，待细胞融合后将细胞随机分为12组：空白组(仅5%ECM)和各浓度益母草水煎液组(5%ECM+0.49、0.98、1.96、3.92、7.84、15.68、31.36、62.72、125.00、500.00和1 000.00 μg·mL-1益母草水煎液)。培养24 h后，每孔加入10 μL 5 mg·mL-1 MTT，避光4 h，每孔加入100 μL DMSO，振荡混匀，在吸光度为490 nm下检测。
1.4 胰蛋白酶酶解及肽段标记取第10代HDMECs细胞，分为空白组(仅5%ECM)、50 μg·mL-1益母草水煎液组(5%ECM+50 μg·mL-1益母草水煎液)、100 μg·mL-1益母草水煎液组(5%ECM+100 μg·mL-1益母草水煎液)，处理24 h后提取蛋白并鉴定，每个样品取100 μg的蛋白溶液，加入DTT，使其终浓度为5 mmol·L-1，55 ℃还原30 min。加入碘乙酰胺，使得终浓度为10 mmol·L-1，室温避光孵育15 min。加入丙酮沉淀蛋白，-20 ℃放置4 h以上。离心收集沉淀，加入TEAB复溶沉淀，加入胰酶37 ℃消化过夜，随后冻干，按TMT标记试剂盒和iTRAQ标记试剂盒说明书进行肽段标记反应。
1.5 反相色谱分离与质谱每份样品用纳升流速Easy-nLC液相系统进行分离，流动相A相为ACN-H2O(2∶98)，流动相B相为ACN-H2O(90∶10)，色谱柱为Agilent Zorbax Extend-C18窄径柱，流速为300 μL·min-1。待后肽段结束色谱分离后，进行Q Exactive质谱分析。
1.6 荧光定量PCR取第10代HDMECs细胞，分为空白组(仅5%ECM)、50 μg·mL-1益母草水煎液组(5%ECM+50 μg·mL-1益母草水煎液)、100 μg·mL-1益母草水煎液组(5%ECM+100 μg·mL-1益母草水煎液)，处理24 h后提取RNA并进行质检，按照qPCR试剂盒说明书进行相对定量分析。
1.7 ELISA法检测凝血级联相关因子将第10代HDMECs接种至6孔细胞培养板中，待细胞融合后，分为空白组(仅5%ECM)、50 μg·mL-1益母草水煎液组(5%ECM+50 μg·mL-1益母草水煎液)、100 μg·mL-1益母草水煎液组(5%ECM+100 μg·mL-1益母草水煎液)，24 h后收取细胞上清液，根据AT-Ⅲ和人凝血酶原片段F2试剂盒说明书检测F2和AT-Ⅲ因子水平。
1.8 数据分析对筛选得到的差异蛋白进行GO分析和Pathway分析，使用2-△△Ct方法分析荧光定量PCR，其余均使用Graphpad Prism 8.2.0进行两组间t检验和多组间ANOVA (one-way analysis of variance) 分析，以*P < 0.05表示差异显著，**P < 0.01表示差异极显著。
2 结果 2.1 益母草水煎液对HDMECs细胞活力的影响如图 1所示，与空白组(Control)相比，不同浓度的益母草水煎液作用24 h后，细胞增殖能力未显著降低，表明1 mg·mL-1以下益母草水煎液作用于HDMECs细胞无毒副作用，可以进行后续试验。
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*.P < 0.05;**.P < 0.01。下同 *.P < 0.05;**.P < 0.01。The same as below 图 1 益母草水煎液对HDMECs细胞活力的影响 Fig. 1 The effect of Leonurus artemisia decoction on HDMECs cell viability |
共鉴定到37 915个肽段、5 792个蛋白。如图 2所示，蓝色的点表示下调差异表达蛋白，红色的点为上调差异表达蛋白，灰色的点为非显著差异表达蛋白。与空白组相比，50 μg·mL-1益母草水煎液组的差异表达蛋白有67个，其中上调蛋白27个，下调蛋白40个(图 2A)；100 μg·mL-1益母草水煎液组的差异蛋白有34个，其中上调蛋白15个，下调蛋白19个(图 2B)。50 μg·mL-1益母草水煎液组和100 μg·mL-1益母草水煎液组相比，差异蛋白有61个，其中上调蛋白28个，下调蛋白33个(图 2C)。
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A. 50 μg·mL-1益母草水煎液组与空白组差异表达蛋白火山图；B. 100 μg·mL-1益母草水煎液组与空白组差异表达蛋白火山图；C. 50和100 μg·mL-1益母草水煎液组差异表达蛋白火山图 A. The differentially expressed protein volcano graph between the 50 μg·mL-1 Leonurus artemisia decoction group and control group; B. The differentially expressed protein volcano graph between the 100 μg·mL-1 Leonurus artemisia decoction group and control group; C. The differentially expressed protein volcano graph in 50 and 100 μg·mL-1 Leonurus artemisia decoction groups 图 2 差异表达蛋白火山图 Fig. 2 Differentially expressed protein volcano maps |
如图 3A和表 1所示，50 μg·mL-1益母草水煎液组与空白组差异表达蛋白主要富集到生物学过程、细胞组成、分子功能，参与调节细胞外泌体、血管生成、血小板α颗粒、血小板脱颗粒、肝素结合、血小板活化、血液凝固等过程；图 3B和表 2所示，100 μg·mL-1益母草水煎液组与空白组差异蛋白主要富集到生物学功能和细胞组成，参与调节细胞外泌体、血管生成等过程；图 3C和表 3所示，50和100 μg·mL-1益母草水煎液组差异表达蛋白主要富集到生物学过程、细胞组成、分子功能，参与调节细胞外泌体、血管生成、血小板α颗粒、血小板脱颗粒、肝素结合、血小板活化等过程。在上述多个过程中共同影响的蛋白主要为HRG(富含组氨酸的糖蛋白)。
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A.50 μg·mL-1益母草水煎液组与空白组差异表达蛋白GO富集分析；B. 100 μg·mL-1益母草水煎液组与空白组差异表达蛋白GO富集分析；C. 50和100 μg·mL-1益母草水煎液组差异表达蛋白GO富集分析 A. The GO analysis of differentially expressed proteins between Leonurus artemisia decoction group and control group. B. The GO analysis of differentially expressed proteins between Leonurus artemisia decoction group and control group. C. The GO analysis of differentially expressed proteins in 50 and 100 μg·mL-1 Leonurus artemisia decoction groups 图 3 差异表达蛋白GO富集分析结果 Fig. 3 GO analysis results of differentially expressed proteins |
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表 1 50 μg·mL-1益母草水煎液组与空白组的GO富集分析 Table 1 GO analysis between 50 μg·mL-1 Leonurus artemisia decoction group and control group |
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表 2 100 μg·mL-1益母草水煎液组与空白组的GO富集分析 Table 2 GO analysis between 100 μg·mL-1 Leonurus artemisia decoction group and control group |
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表 3 50和100 μg·mL-1益母草水煎液组的GO富集分析 Table 3 GO analysis between 50 and 100 μg·mL-1 Leonurus artemisia decoction groups |
如图 4所示，与空白组相比，50 μg·mL-1益母草水煎液组差异表达蛋白影响的通路主要有补体和凝血级联(P < 0.01)、肌动蛋白和细胞骨架的调节(P < 0.01)、非洲锥虫病(P < 0.05)、疟疾(P < 0.05)、胆固醇代谢(P < 0.05)、癌症(P < 0.05)、金黄色葡萄球菌感染(P < 0.05)、黑色素瘤(P < 0.05)、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药(P < 0.05)等(图 4A)；100 μg·mL-1益母草水煎液组差异表达蛋白影响的通路主要有心肌收缩(P < 0.01)、肥厚型心肌病(P < 0.01)、心肌细胞的肾上腺素信号传导(P < 0.01)、扩张型心肌病(P < 0.01)、IL-17信号通路(P < 0.05)、牛磺酸和牛磺酸的代谢(P < 0.05)、雌激素信号通路(P < 0.05)、金黄色葡萄球菌感染(P < 0.05)、类固醇生物合成(P < 0.05)、补体和凝血级联(P>0.05)等(图 4B)。与50 μg·mL-1益母草水煎液组相比，100 μg·mL-1益母草水煎液组差异表达蛋白影响的通路主要为癌症(P < 0.01)、金黄色葡萄球菌感染(P < 0.01)、肌动蛋白和细胞骨架的调节(P < 0.01)、雌激素信号通路(P < 0.01)、补体和凝血级联通路(P < 0.01)等(图 4C)。各组两两对比差异蛋白影响的共同通路为金黄色葡萄球菌感染、补体和凝血级联通路。基于以上结果，猜测益母草水煎液可以通过补体和凝血级联通路同时调节机体的凝血与抗凝血功能，且其调节作用与益母草水煎液的浓度相关。
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A. 50 μg·mL-1益母草水煎液组与空白组差异表达蛋白KEGG富集分析；B. 100 μg·mL-1益母草水煎液组与空白组差异表达蛋白KEGG富集分析；C. 50和100 μg·mL-1益母草水煎液组差异表达蛋白KEGG富集分析 A. KEGG analysis of differentially expressed proteins between the 50 μg·mL-1 Leonurus artemisia decoction group and control group. B. KEGG analysis of differentially expressed proteins between the 100 μg·mL-1 Leonurus artemisia decoction group and control group. C. KEGG analysis of differentially expressed proteins in 50 and 100 μg·mL-1 Leonurus artemisia decoction groups 图 4 差异表达蛋白KEGG富集分析结果 Fig. 4 KEGG analysis results of differentially expressed proteins |
对补体和凝血级联通路筛选到的5种可信差异表达蛋白分析，结果如图 5所示，与空白组相比，50 μg·mL-1益母草水煎液组F2、AT-Ⅲ、t-PA和KNG的表达量均极显著降低(P < 0.01)，F5的表达量显著降低(P < 0.05)；100 μg·mL-1益母草水煎液组AT-Ⅲ和t-PA极显著降低(P < 0.01)，F2和KNG显著降低(P < 0.05)，F5没有明显变化。与50 μg·mL-1益母草水煎液组相比，100 μg·mL-1益母草水煎液组F2、AT-Ⅲ、t-PA、KNG的表达量极显著升高(P < 0.01)，F5的表达量显著升高(P < 0.05)。
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A. F2水平；B. AT-Ⅲ水平；C. t-PA水平；D. KNG水平；E. F5水平 A. The level of F2. B. The level of AT-Ⅲ. C. The level of t-PA. D. The level of KNG. E. The level of F5 图 5 益母草水煎液对可信差异表达因子的影响 Fig. 5 The effect of Leonurus artemisia decoction on credible differentially expressed factors |
根据蛋白组学结果，选择拮抗性因子F2、AT-Ⅲ在基因和蛋白水平进行结果验证。RT-PCR和ELISA结果表明：与空白组相比，50 μg·mL-1益母草水煎液组F2和AT-Ⅲ的基因表达水平极显著降低(P < 0.01)、蛋白表达水平显著降低(P < 0.05)(图 6 A、B、C、D)；100 μg·mL-1益母草水煎液组F2基因表达水平差异不显著(P>0.05)、蛋白表达水平显著降低(P < 0.01)(图 6 A、C)，AT-Ⅲ基因表达水平显著降低(P < 0.01)、蛋白表达水平差异不显著(P>0.05)(图 6 B、D)。与50 μg·mL-1益母草水煎液组相比，100 μg·mL-1益母草水煎液组F2基因表达水平显著升高(P < 0.05)，蛋白表达水平差异不显著(P>0.05)(图 6 A、C)，AT-Ⅲ基因表达水平差异不显著(P>0.05)、AT-Ⅲ蛋白表达水平显著升高(P < 0.05)(图 6 B、D)。验证结果与蛋白组学结果趋势一致。
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A. F2基因水平；B. AT-Ⅲ基因水平；C. F2蛋白水平；D. AT-Ⅲ蛋白水平 A. The level of F2 genes; B. The level of AT-Ⅲ genes; C. The level of F2 proteins; D. The level of AT-Ⅲ proteins. 图 6 F2和AT-Ⅲ的基因和蛋白表达水平 Fig. 6 Genes and proteins expression level of F2 and AT-Ⅲ |
本试验采用iTRAQ技术对益母草水煎液干预前后的HDMECs进行蛋白组学分析，GO富集分析结果显示，各组差异蛋白主要被富集到生物学过程、细胞组成和分子功能，参与调节血液凝固、血管生成、细胞外泌体、血小板α颗粒、血小板脱颗粒、肝素结合、血小板活化等过程。血液凝固和纤溶能够影响血管生成，并且当机体凝血功能受损时，血管生成被激活，加速凝血[12-13]。Bhakuni等[14]发现抗凝剂如肝素和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖可以有效抑制血管生成，从而发挥抗凝血的作用。细胞外泌体是细胞释放的一类细胞外囊泡，伴有脂质双层膜，包含核酸、脂质和细胞特异的蛋白质，可以通过介导特定性细胞之间的通信方式，将与其相互作用或融合的信号通路激活[15]，现有研究也表明，细胞外泌体能够通过促进血管生成，进而加速凝血[16]。本试验中益母草水煎液能够调节血液凝固、细胞外泌体、血管生成中的蛋白，表明益母草水煎液可能通过调节血液凝固和细胞外泌体过程影响血管生成，进而调节机体的凝血与抗凝血功能。血小板α颗粒、脱颗粒、活化均与血小板发挥凝血功能相关，当血小板受致病因素诱发时，会造成其异常黏附，形成血栓[17]。肝素是机体主要的抗凝血物质，能够加速凝血酶失活进一步抑制血栓[18]。有研究表明，HRG(富含氨基酸的糖蛋白)能够结合肝素、纤溶酶、纤维蛋白原和活化的血小板等蛋白，并且当其水平过高时会出现血栓性疾病[19]。差异表达蛋白结果显示，50 μg·mL-1益母草水煎液组的差异表达蛋白主要与血小板α颗粒、血小板脱颗粒、肝素结合和血小板活化等过程相关，并且在这些过程中共同影响的蛋白主要是HRG，表明益母草水煎液可能通过调控HRG调节血小板α颗粒、血小板脱颗粒、肝素结合和血小板活化等过程进而调节机体凝血和抗凝血功能。
KEGG通路分析表明，益母草水煎液各组对多个通路均具有调控作用，各组两两对比差异表达蛋白影响的共同通路为金黄色葡萄球菌感染、补体和凝血级联通路。本试验最终筛选出与补体和凝血级联通路有关的5种可信差异表达蛋白，主要有F2、AT-Ⅲ、t-PA、F5和KNG。凝血级联具有共同的途径，该途径连接内在和外在凝血途径，活化因子X和辅助因子F5能与钙、组织、血小板磷脂结合，将F2转化为凝血酶，从而激活因子XIII并将纤维蛋白原分解为纤维蛋白，使纤维蛋白交联形成稳定的血凝块[20]。AT-Ⅲ是肝内合成的一种单链α2球蛋白，是丝氨酸蛋白抑制家族，AT-Ⅲ作为抑制血栓形成的主要生理物质，在正常生理状态下可以和肝素结合发挥抑制凝血酶等多种凝血因子活性的作用，其活性的降低促使凝血功能亢进，有利于形成血栓[21]。t-PA是一种能将纤溶酶原转化成纤溶酶，发挥溶解纤维蛋白原作用的丝氨酸蛋白酶，在预防血栓形成中起着重要作用[22]。KNG能够抑制血小板的黏附聚集，延缓血栓的形成[23]。本试验蛋白组学结果表明，与空白组相比，益母草水煎液各组F2、AT-Ⅲ、t-PA和KNG的含量均显著下调，F2含量降低表明益母草水煎液抑制了凝血酶的生成途径，发挥了其抗凝血的作用，而益母草水煎液同时抑制AT-Ⅲ和t-PA表明其一定程度上有促进凝血作用。研究表明，凝血途径的过度激活会降低AT-Ⅲ的水平，还会导致其他凝血因子的过度消耗[24]，所以并不能排除益母草水煎液只是激活了凝血途径。Fernandes等[25]研究发现，在钩端螺旋体病患者血清样本中F2和AT-Ⅲ水平同时降低，推测可能与该疾病期间的出血表现有关，提示机体正处于过度活化凝血状态，此结果与本试验结果一致。与50 μg·mL-1益母草水煎液组相比，100 μg·mL-1益母草水煎液组F2、AT-Ⅲ、t-PA、F5和KNG的含量升高提示当机体处于过度凝血状态时，一定浓度的益母草水煎液又能改善这种过度凝血状态，发挥抗凝作用。因此，凝血与抗凝过程均是由上述因子介导的，两种因子的平衡偏移决定了机体启动凝血或抗凝过程。本研究以HDMECs为研究对象探究了益母草水煎液对参与凝血和抗凝血过程相关因子的体外调节作用，虽不能完全模拟体内过程，但根据蛋白组学研究和对具有拮抗性作用的因子的验证可推测益母草水煎液可能通过补体和凝血级联通路对机体凝血和抗凝血过程发挥潜在的调节作用，这种调节作用和其浓度相关。
4 结论本试验通过iTRAQ技术研究发现益母草水煎液可显著改变HDMECs的蛋白表达谱，双向调节机体的凝血与抗凝血功能，且这种双向调节作用和浓度相关。调节补体和凝血级联通路相关因子F2、AT-Ⅲ、t-PA、F5、KNG蛋白的表达可能是其发挥双向调控作用的机制之一。
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(编辑 范子娟)