畜牧兽医学报  2022, Vol. 53 Issue (6): 1914-1924. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2022.06.025    PDF    
引用本文
袁婧, 张欣欣, 周迪, 杨帅, 周家彦, 梁爱心, 杨利国. 以减毒沙门菌为载体的SS和CST双表达DNA疫苗经不同途径免疫犊牛的效果评价[J]. 畜牧兽医学报, 2022, 53(6): 1914-1924.  
YUAN Jing, ZHANG Xinxin, ZHOU Di, YANG Shuai, ZHOU Jiayan, LIANG Aixin, YANG Liguo. Evaluation of the Effect of SS and CST Dual-expression DNA Vaccines with Attenuated Salmonella as Carrier in Immunizing Calves through Different Routes[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2022, 53(6): 1914-1924.  
以减毒沙门菌为载体的SS和CST双表达DNA疫苗经不同途径免疫犊牛的效果评价
袁婧1, 张欣欣1, 周迪1, 杨帅1, 周家彦1, 梁爱心1,2, 杨利国1,2     
1. 华中农业大学动物科技学院，武汉 430070;
2. 水牛繁育与加工湖北省工程研究中心，武汉 430070
收稿日期：2021-06-07
基金项目：国家现代农业体系(奶牛)技术专项(CARS-36)；国家自然科学基金(31772602；31772604)
作者简介：袁婧(1993-)，女，山东菏泽人，硕士，主要从事基因免疫研究，E-mail: 17806243701@163.com.
通信作者：杨利国，主要从事动物繁殖学、动物生殖生理与繁殖技术、特种经济动物繁育研究，E-mail: yangliguo2006@qq.com.
摘要：旨在探讨SS和CST双表达DNA疫苗(以下简称双表达DNA疫苗)经不同途径免疫犊牛的效果。本研究选择27头2~6月龄的奶水牛犊牛，随机分成4组，前3组分别采用口服(O组)、喷鼻(N组)、口服+喷鼻(ON组)的方式接种双表达疫苗，剂量均为3×107 CFU·mL-1，对照组(C)使用PBS进行口服+喷鼻免疫，并于2周后加强免疫一次。结果表明，3种免疫方式均可诱导犊牛产生SS抗体和CST抗体；初免后2周，N和ON组阳性率最高，均为85.71%；6周时，各组阳性率均下降，O和N组的抗体水平也逐渐下降，但ON组的抗体水平升高；10周时，ON组阳性率下降到14.29%，O和N组均检测不到抗体。从增重来看，2周时，ON组的平均日增重显著高于O、N和C组(P＜0.05)，在整个试验周期(0~10周)，与C组相比，O、N和ON组的增重分别提高了5.26%、10.53%、15.79%；初免后10周，ON组的胸围、腿臀围均显著高于C组(P＜0.05)。血清中生长相关激素检测结果表明，各组GH、IGF-1、T3的含量，ON＞N＞O＞C组；其中，2周时，O、N和ON组IGF-1的浓度显著高于C组(P＜0.05)；6周时，ON组T3和T4的浓度均显著高于O和C组(P＜0.05)。细胞因子检测结果表明，3种免疫方式都能激发机体产生体液免疫和细胞免疫应答，6周时，ON组INF-γ的含量显著高于C组(P＜0.05)，其余各组之间差异不显著(P＞0.05)。血生化指标检测结果表明，各组之间，犊牛血清中总蛋白、葡萄糖、游离脂肪酸和尿素氮的含量差异不显著(P＞0.05)。综上所述，口服、喷鼻和口服+喷鼻3种方式免疫犊牛均可产生良好的效果，尤其以口服+喷鼻联合免疫效果最佳。
关键词：免疫途径    犊牛    生长抑素    皮质抑素    DNA疫苗    
Evaluation of the Effect of SS and CST Dual-expression DNA Vaccines with Attenuated Salmonella as Carrier in Immunizing Calves through Different Routes
YUAN Jing1, ZHANG Xinxin1, ZHOU Di1, YANG Shuai1, ZHOU Jiayan1, LIANG Aixin1,2, YANG Liguo1,2     
1. College of Animal Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China;
2. Engineering Research Center of Hubei Province for Buffalo Breeding and Processing, Wuhan 430070, China
Corresponding author: YANG Liguo, E-mail: yangliguo2006@qq.com.
Abstract: To investigate the effect of double-expression DNA vaccine of SS and CST (hereinafter referred to as double-expression DNA vaccine) immunized calves through different routes, 27 dairy buffalo calves aged 2-6 months were randomly divided into four groups. The first three groups were orally (group O), nasally (group N), and orally plus nasally (group ON) vaccinated with dual-expression DNA vaccine at a dose of 3×107 CFU·mL-1, respectively. The control group (C) was orally plus nasally immunized with PBS, and boosted immunization once after 2 weeks. The results showed that all three immunization methods could induce calves to produce antibody of SS and CST. After 2 weeks of primary immunization, the positive rates in N and ON groups were the highest, both at 85.71%. At the 6th week, the positive rates in each group decreased, the levels of antibody also decreased in O and N groups, but the levels of antibody increased in ON group. At the 10th week, the positive rates in ON group decreased to 14.29%, and no antibodies were detected in the O and N groups. With respect to weight gain, at the 2nd week, the average daily gain in the ON group was significantly higher (P < 0.05) than that in the O, N, and C groups. During the entire experimental period (0-10 weeks), compared with the C group, the O, N and ON groups were respectively increased by 5.26%, 10.53%, and 15.79%. After 10 weeks of primary immunization, the chest girth and leg-hip circumference in the ON group were significantly higher (P < 0.05) than those in the C group. Hormone measurement results showed that the concentration of GH, IGF-1, and T3 in each group were as ON>N>O>C group. The IGF-1 concentration of O, N and ON group was significantly higher (P < 0.05) than that of C group at the 2nd week. At the 6th week, the concentrations of T3 and T4 in the ON group were significantly higher (P < 0.05) than those in the O and C groups. The cytokine test results showed that the three immune methods could stimulate the body to produce humoral and cellular immunity. At the 6th week, the concentration of INF-γ in the ON group was significantly higher (P < 0.05) than that in the C group, and there was no significant difference (P>0.05) between the other groups. The detection of blood biochemical indexes showed that there was no significant difference (P>0.05) in the contents of total protein, glucose, non-esterified fatty and urea nitrogen in the serum of calves between the groups. In summary, oral, nasal and oral plus nasal could induce good immune effect in calves, especially oral + nasal spray combined immunization had the best effect.
Key words: immunization route    calf    somatostatin    cortistatin    DNA vaccine    

生长抑素(somatostatin，SS)能够抑制细胞的增殖和多种神经内分泌激素的分泌，包括生长激素(GH)、胰岛素(INS)、促甲状腺激素(TSH)、三碘甲状腺原氨酸(T3)和四碘甲状腺原氨酸(T4)等[1]，从而抑制动物的生长。皮质抑素(cortistatin，CST)是一种内源性神经肽，能与所有的SS受体结合，具有SS类似的功能[2]。利用SS的免疫中和作用可以促进畜禽的生长[3-4]。目前，国内外已经研制了多种生长抑素DNA疫苗，在小动物上取得了良好的免疫效果和增重效果，但在大动物上的效果却不容乐观[5-8]。为了进一步提高生长抑素DNA疫苗的免疫效果，本实验室构建了以减毒沙门菌为载体的SS和CST双表达DNA疫苗(pVGS/2SS-2A-S/CST-asd)，发现其能显著提高小鼠的平均日增重[9]，并探索了鼻饲接种双表达DNA疫苗对水牛免疫效果的影响，发现增重效果不明显[10]，这严重限制了双表达疫苗的推广应用。因此，急需探讨双表达DNA疫苗在大动物上的最佳免疫程序。

影响DNA疫苗免疫效果的因素有很多，其中, 免疫接种途径是影响DNA疫苗效力的一个重要方面。不同的免疫途径会影响抗原DNA的转染效率(吸收、表达) 和递呈效率，从而影响DNA疫苗的免疫效力和免疫应答的持久性[11]。DNA疫苗的接种方式主要包括肌肉注射、基因枪、口服、鼻饲、滴眼等多种途径。近年来，多种途径联合免疫已经成为提高DNA疫苗免疫原性的新型接种方式，且多种途径联合免疫的效果要优于单一途径免疫[12-14]。

SS和CST双表达DNA疫苗研究的最终目的是应用于生产实践，目前，该疫苗免疫多采用单一的免疫方式，而采用组合免疫方式来提高反刍动物生长性能的研究尚未见报道。本试验探讨了口服、喷鼻、口服+喷鼻3种不同免疫方式接种SS和CST双表达DNA疫苗对奶水牛犊牛免疫效果以及促生长效果的影响，为优化DNA疫苗的免疫程序、促进其推广应用奠定基础和提供参考。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 DNA疫苗 　　以减毒沙门菌(C500)为载体的SS和CST双表达非抗性筛选DNA疫苗(pVGS/2SS-2A-S/CST-asd)由祖卓鑫[9]构建(质粒图谱如图 1所示)，质粒、菌种由本实验室提供。

GMCSF. 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，467 bp；S/SS. 乙肝表面抗原/生长抑素，388 bp；S/CST. 乙肝表面抗原/皮质抑素，726 bp；2A. 2A肽，猪teschovirus-1病毒，66 bp GMCSF. Granulocyte-macrophage colony stimulating factor, 467 bp; S/SS. Hepatitis B surface antigen/Somatostatin, 388 bp; S/CST. Hepatitis B surface antigen/Cortistatin, 726 bp; 2A. P2A, porcine teschovirus-1 virus, 66 bp 图 1 pVGS/2SS-2A-S/CST-asd质粒图谱 Fig. 1 Plasmid map of pVGS/2SS-2A-S/CST-asd

1.1.2 试验动物 　　从湖北劲牛牧业有限公司选择27头2~6月龄、体重体况相近、健康无疾病的杂交奶水牛犊牛用于试验。

1.1.3 主要试剂 　　无内毒素质粒小提试剂盒、全血液DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；牛GH、IGF-1、IL-4、INF-γ、T3、T4 ELISA试剂盒均购自(泉州)睿信生物科技有限公司；2×Taq Master Mix、ELISA显色液、ELISA终止液购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；羊抗牛IgG/HRP购自SouthernBiotech公司；DNA Maker、限制性内切酶均购自Thermo Fisher Scientific公司；生长抑素标准抗原、皮质抑素标准抗原均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 质粒的鉴定与DNA疫苗的大量制备

将以减毒沙门菌(C500)为载体的重组DNA疫苗(pVGS/2SS-2A-S/CST-asd)从-80 ℃超低温冰箱取出，用接种环接种于LB固体培养基上，37 ℃过夜培养。挑取单克隆菌落于200 mL的LB液体培养基中，37 ℃振摇培养过夜，按照北京天根高纯度质粒小提试剂盒的说明书，提取质粒。将双表达质粒pVGS/2SS-2A-S/CST-asd分别经NheⅠ/Hind Ⅲ和XhoⅠ/Hind Ⅲ进行双酶切，37 ℃水浴2~3 h，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，并将鉴定正确的质粒送至武汉擎科生物技术有限公司测序。

将鉴定正确的重组菌按1∶100的体积比接种于LB液体培养基，37 ℃、220 r·min-1振摇培养16~18 h，采用平板计数法检测细菌浓度，用灭菌的PBS调整细菌浓度至3×107CFU·mL-1，4 ℃保存备用。

1.3 动物分组、免疫、饲养管理及样品采集

将27头2~6月龄的奶水牛犊牛随机分为4组，试验组每组均为7头，对照组为6头，试验组设计3种不同的免疫方式(口服、喷鼻、口服+喷鼻)，分别记为O组、N组、ON组。3个试验组疫苗的浓度均为3×107CFU·mL-1，剂量为15 mL·头-1，每天两次(早上9:00，下午15:00)，连续免疫3 d。对照组(C组)每天用等体积的PBS口服和喷鼻免疫。首次免疫后间隔2周，以相同程序加强免疫一次。试验期间，所有犊牛均进行人工哺乳(2 L·头-1，每天喂两次)，试验动物自由饮水、采食(青贮+稻草)。

分别于初免后2、6、10周颈静脉采血，每头牛在采血前称重、测体尺(体高、体长、体斜长、胸围、胸深、腿臀围)，采集的血液，3 000 r·min-1离心10 min，取上清用于后续试验。

1.4 SS和CST抗体检测

采用间接ELISA方法检测不同时期所有试验牛血清中抗生长抑素和皮质抑素抗体。测定参照刘青[15]方法。在同一稀释倍数下，样本血清的OD450 nm值＞阴性血清OD450 nm平均值+2倍标准差(s)时，则此稀释倍数即为样本血清的最终抗体滴度，判定为阳性，反之为阴性。

1.5 相关激素及细胞因子的检测

参照董方晓的方法[16]，用双抗体一步夹心ELISA法检测犊牛血清中GH、IGF-1、T3、T4、IL-4、INF-γ的含量，绘制标准曲线，根据标准曲线计算各样品中GH、IGF-1、T3、T4、IL-4、INF-γ的浓度(计算值乘以5为最终浓度值)。

1.6 血清生化指标检测

将血清样品送至生工生物工程武汉分公司，采用全自动生化分析仪BS-420进行血清生化指标检测，检测项目有总蛋白(TP)、葡萄糖(Glu)、游离脂肪酸(NEFA)、尿素氮(BUN)。

1.7 数据分析

测得的所有数据均采用SPSS 22.0软件分析，数值表示为“平均值±标准差(x±s)”，并进行差异显著性检测，多组样本采用一般线性模型(GLM)的单因素方差分析(One-way ANOVA)，使用Duncan法进行多重比较，当P＜0.05表示差异显著；P＜0.01表示差异极显著。

2 结果 2.1 重组质粒的酶切鉴定

双表达质粒pVGS/2SS-2A-S/CST-asd的双酶切结果如图 1，质粒经Nhe Ⅰ和Hind Ⅲ酶切后，DNA产物电泳后分别在5 000 bp附近以及1 500 bp附近出现条带(1和2)，与p-2A-S/CST-asd片段(4 535 bp)和GM/2SS片段(1 245 bp)大小一致；经Xho Ⅰ和Hind Ⅲ酶切后，DNA产物电泳后分别在5 000 bp附近以及750 bp附近出现条带(3和4)，与pVGS/2SS-asd片段(4 992 bp)和2A-S/CST片段(798 bp) 大小一致。重组质粒的测序结果与构建图谱序列进行BLAST对比，匹配率100%，无基因突变，进一步说明实验室所保存的工程菌具有良好的稳定性，满足后续试验需求。

2.2 不同免疫方式对犊牛血清SS和CST抗体及细胞因子的影响

3种免疫方式均可以诱导犊牛产生SS抗体(表 1)和CST抗体(表 2)，各个试验阶段抗体水平不显著(P＞0.05)。6周时，O组、N组的抗体水平以及阳性率下降，虽然ON组的阳性率下降，但抗体水平升高。在10周时，O组和N组均检测不到SS抗体和CST抗体，ON组能检测到SS抗体，阳性率只有14.29%。从阳性率和产生抗体的持久性方面综合评判，喷鼻+口服的免疫方式优于喷鼻免疫方式，喷鼻免疫方式优于口服免疫方式。

表 1 不同免疫方式各组犊牛血清中SS抗体水平(x±s) Table 1 The level of SS antibody of calves serum in each group of different immunization routes(x±s)
表 2 不同免疫方式各组犊牛血清中CST抗体水平(x±s) Table 2 The level of CST antibody of calves serum in each group of different immunization routes(x±s)

从表 3可知，随周龄的增加，3个试验组IL-4的含量均呈下降趋势，这与检测的抗体阳性率结果一致；2周时，3个试验组INF-γ、IL-4的含量均高于对照组，但各组之间差异不显著(P＞0.05)；6周时，ON组INF-γ的含量显著高于C组(P＜0.05)；10周时，ON组INF-γ的含量均显著高于O组、N组、C组(P＜0.05)。说明3种免疫方式均能较好地激发机体产生体液免疫和细胞免疫。

1、2. 双表达质粒经Nhe Ⅰ和Hind Ⅲ酶切的产物；M. DNA相对分子质量标准；3、4. 双表达质粒经Xho Ⅰ和Hind Ⅲ酶切的产物 1, 2. The enzyme digesting products of pVGS/2SS 2A-S/CST-asd plasmid by Nhe Ⅰ and Hind Ⅲ; M. DNA marker; 3, 4. The enzyme digesting products of pVGS/2SS 2A-S/CST-asd plasmid by Xho Ⅰ and Hind Ⅲ 图 2 pVGS/2SS-2A-S/CST-asd质粒双酶切产物电泳图 Fig. 2 Electrophoresis diagram of double digestion products for pVGS/2SS-2A-S/CST-asd plasmid
表 3 不同免疫方式各组犊牛血清中细胞因子水平(x±s) Table 3 The levels of cytokines of calves serum in each group of different immunization routes (x±s) 
2.3 不同免疫方式对犊牛生长性能的影响

从表 4可知，在各时期内，均以ON组的平均日增重最高，其次为N组、O组、C组，与抗体阳性率结果一致；在初免后2周，ON组日增重显著高于其他各组(P＜0.05)，而其他各时期内各组间日增重差异均不显著(P＞0.05)；在整个试验周期(0~10周)，与C组相比，O组、N组、ON组犊牛日增重分别提高了5.26%、10.53%、15.79%。由表 5可知，6、10周时，ON组的胸围显著高于C组(P＜0.05)；10周时，ON组的腿臀围显著高于C组、N组(P＜0.05)，其他体尺指标均为无显著差异(P＞0.05)。

表 4 不同免疫方式各组犊牛的日增重(x±s) Table 4 The average daily gain of calves in each group of different immunization routes (x±s)
表 5 不同免疫方式组间犊牛的体尺(x±s) Table 5 Body size of calves in each group of different immunization routes(x±s) 
2.4 不同免疫方式对犊牛血清中生长相关激素的影响

从表 6可知，不同阶段，各试验组的GH、IGF-1、T3的浓度均高于对照组，且ON＞N＞O组，与增重趋势一致；其中，2周时，3个试验组血清中的IGF-1的浓度显著高于C组(P＜0.05)；6周时，ON组T3和T4的浓度均显著高于O组、C组(P＜0.05)，各组之间GH、IGF-1的浓度差异不显著(P＞0.05)；10周时，ON组T3的浓度显著高于对照组(P＜0.05)，各组之间GH、IGF-1、T4的浓度差异不显著(P＞0.05)。

表 6 不同免疫方式组间犊牛血清中生长相关激素水平(x±s) Table 6 The levels of growth-related hormone of calves serum in each group of different immunization routes(x±s)
2.5 不同免疫方式对犊牛血清生化指标的影响

在初免后2及6周，3个免疫组血清的总蛋白(TP)、葡萄糖(Glu)、游离脂肪酸(NEFA)的含量略高于对照组，尿素氮(BUN)的含量低于对照组(表 7)，但各项指标在各组之间差异均不显著(P＞0.05)。

表 7 不同免疫方式组间犊牛血清生化指标(x±s) Table 7 The biochemical indexes of calves serum in each group of different immunization routes(x±s)
3 讨论

黏膜是机体最大的免疫器官，分布在呼吸道、消化道、泌尿生殖道以及某些外分泌腺(唾液腺、胰腺、泪管等)[17]。通过黏膜表面(如口腔、鼻、直肠或阴道等)接种疫苗不仅可以激发保护性黏膜免疫反应，还可诱导全身抗原特异性体液免疫和细胞免疫[18]。以减毒沙门菌为载体的DNA疫苗可以通过口腔或鼻腔进行免疫接种，有效地在动物体内表达外源抗原[19-21]。本研究采用口服、喷鼻、口服+喷鼻3种免疫方式免疫2~6月龄的奶水牛犊牛，均能诱导犊牛产生SS和CST抗体，且加强免疫后ON组的SS和CST抗体水平有所提高，在初免后10周，只有ON组检测到了阳性，说明口服+喷鼻的免疫方式可以诱导犊牛产生更持久的免疫应答。O组、N组均检测不到抗体，提示在6~10周，疫苗的免疫效果已逐渐消失，具体的消失时间还需要进一步探究。整个试验期间，从产生抗体的持久性和阳性率综合来看，口服+喷鼻的免疫方式要优于喷鼻免疫，喷鼻免疫优于口服免疫。这可能是由于口服免疫产生的免疫应答持续时间较短[22]。一方面，鼻腔提供了一个广泛的、高度血管化的和相对容易渗透的表面，提高了鼻黏膜摄取DNA疫苗的效率[23]，而且鼻腔黏膜不仅可以激发上呼吸道可产生较强的免疫应答，还可以诱导机体下呼吸道、胃肠道和泌尿生殖道产生明显的免疫应答[8]；另一方面，口腔免疫也可以通过口腔黏膜、消化道黏膜以及胃肠道黏膜递呈抗原，诱导动物机体产生有效的免疫应答[8]。因此多种方式联合免疫要优于单一的免疫方式。

与其他促生长的DNA疫苗相比，祖卓鑫[9]首次采用2A肽双顺反子原件，引入平衡致死系统构建了非抗性筛选SS和CST双表达DNA疫苗，有效提高了下游基因的表达量及其免疫效力。该双表达DNA疫苗可以诱导机体产生SS抗体和CST抗体，中和内源性生长抑素，从而提高生长激素的分泌，并最终提高生长速率。SS基因疫苗可以改善小鼠[24]、羊[25]、肉牛[19]、仔猪[21]、鸡[26]等动物的生产性能。在本研究中，不同阶段犊牛的平均日增重由高到低的顺序为口服+喷鼻组＞喷鼻组＞口服组＞对照组，进一步证明了多种途径联合免疫的效果要优于单一途径免疫；但各组平均日增重水平整体较低，这可能与牛场的饲养管理条件有关。另外，体尺指标也可以反映犊牛的生长发育状况，与犊牛的生产性能、繁殖性能有着密切联系[27]。本研究首次探究了该疫苗对犊牛体尺的影响，结果发现，生长抑素和皮质抑素双表达DNA疫苗通过口服+喷鼻的免疫方式对水牛犊牛腿臀围和胸围的影响最显著。

畜禽的生长发育受多种内源性激素共同调节，主要包括GH、IGF-1、T3、T4等。GH能促进机体组织的生长，下丘脑分泌的GH可直接作用于动物靶器官，分泌IGF-1；IGF-1可以促进机体细胞增殖，调节蛋白质合成，促进动物组织器官发育和骨骼生长[28]。甲状腺激素(包括T3和T4)是影响动物生长发育和新陈代谢的主要激素，对幼龄动物正常生长和骨骼发育的影响尤为突出，且T3和T4是GH发挥促生长作用的基础[29]。大量研究表明，生长抑素DNA疫苗可以提高机体内GH、IGF-1、T3、T4的浓度，从而促进动物的生长[30-32]。在本试验中，不同免疫时期犊牛体内GH、IGF-1、T3、T4的水平：口服+喷鼻组＞喷鼻组＞口服组＞对照组，与增重趋势一致，进一步说明了生长抑素和皮质抑素DNA疫苗可以通过提高机体内与生长相关的激素的水平，从而达到促生长效果，表明该疫苗通过口服+喷鼻联合免疫的方式产生的促生长效果更佳。

DNA疫苗的作用机理就是其通过不同的途径进入机体内，在动物体内产生微量的抗原蛋白，从而引发全面的体液免疫和细胞免疫应答反应[33]。Th1细胞主要参与细胞免疫应答，而Th2细胞在体液免疫应答中起核心作用，因此，Th1细胞因子(IFN-γ、IL-2等)和Th2细胞因子(IL-4、IL-10等)的检测可以在一定程度上反映细胞和体液免疫反应[34]。与韩丽[35]的研究结果一致，本研究结果表明，不同免疫方式组犊牛血清中IFN-γ和IL-4的含量均高于对照组，说明3种免疫方式接种此DNA疫苗都能有效地激发机体产生体液免疫和细胞免疫应答。其中，口服+喷鼻组INF-γ的含量显著提高，说明口服+喷鼻这种免疫方式接种此双表达DNA疫苗，可以显著提高机体的细胞免疫反应；因此，双表达DNA疫苗的口服+喷鼻的免疫效果要优于口服或喷鼻免疫效果。关于生长抑素DNA疫苗对动物血清生化指标的影响，研究结果也不尽相同[10, 31, 36]。本研究发现无论以哪种方式免疫接种双表达DNA疫苗，对犊牛血清总蛋白、葡萄糖、游离脂肪酸以及尿素氮的含量均无明显影响。可能是由于受试动物、免疫途径、免疫剂量不同以及饲养管理等多种因素造成的，而且免疫并非直接影响代谢，是通过影响GH、IGF-1等内分泌激素的分泌，从而影响机体的代谢，具体机制有待于进一步研究证实。

4 结论

3种不同免疫方式均可以使奶水牛犊牛产生较好的免疫效果，但是口服+喷鼻免疫产生的抗体水平持续时间更长，阳性率更高，且增重效果更好。结果表明，在给犊牛接种促生长DNA疫苗时，口服+喷鼻联合免疫效果要优于喷鼻免疫，喷鼻免疫优于口服免疫。

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(编辑   白永平)