2. 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州 225009
, ZHENG Hao1, WANG Yaling1, ZOU Hui1, GU Jianhong1, YUAN Yan1, LIU Xuezhong1, LIU Zongping1,2, BIAN Jianchun1,2
2. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China
玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEA)是禾谷镰刀菌属霉菌通过聚酮途径生物合成的非甾体雌激素类真菌毒素，是谷物和谷类产品中最常见的污染物之一，对食品安全构成严重威胁[1]。研究表明，ZEA及其代谢物具有生殖毒性、遗传毒性、免疫毒性以及致癌性等。近年来，关于ZEA的生殖毒性研究较为广泛，因其化学结构与雌激素相似，因而具有与雌激素受体结合的能力和生物蓄积能力，从而可能导致多种生殖系统疾病[2]。ZEA对神经系统也存在毒性作用，但相关研究尤其是对其作用机制的研究却相当有限。有研究表明，ZEA对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞和斑马鱼胚胎神经发育具有毒性作用[3]，相关毒性机制与氧化应激有关[4]。氧化应激中产生的ROS是自噬的重要调节因子，它能诱导自噬发生[5]。细胞自噬是真核细胞内一种高度保守的溶酶体依赖的分解代谢过程。本课题组前期研究证明，ZEA可诱导原代大鼠间质细胞自噬的发生[6]。且在一定浓度范围内，ZEA可以通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导大鼠睾丸支持细胞自噬的发生[7]。而在猪的子宫内膜细胞中，ZEA可激活自噬，并阻断自噬流，导致大量自噬体的积聚[8]。但目前尚未有研究表明ZEA所致的神经毒性作用是否与自噬相关。PC12细胞来源于一种可移植的鼠嗜铬细胞瘤的细胞株，具有神经内分泌细胞的一般特征，广泛用于神经系统疾病体外研究。本研究采用PC12细胞为研究对象，以不同浓度的ZEA处理细胞，探究ZEA暴露对神经系统的影响及其毒性作用机制。
1 材料与方法 1.1 试验细胞株大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系(PC12细胞)购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库。
1.2 主要试剂与仪器玉米赤霉烯酮标准品、RPMI 1640培养基(美国Sigma公司)，胎牛血清(Gibco公司)，RIPA强裂解液、蛋白酶抑制剂(北京普利莱基因技术有限公司)，LC3(3868)、p62(5114)、Atg5(9980)、Beclin-1(3495)、Cathepsin D (69854)、Cathepsin B(31718)兔单克隆抗体(美国CST公司)，LAMP-1(20011)鼠单克隆抗体(Santa公司)，SNAP29(12704-1-AP)、STX-17(17815-1-AP)、TFEB(13372-1-AP)兔多克隆抗体(武汉Proteintech公司)，其余试剂均为国产分析纯级。
IM-AGEQUAMT 400型凝胶成像仪、电泳仪、电泳槽、转膜仪(美国BIORAD公司)，FACS Aria型流式细胞仪(美国Becton-Dick-inson公司)，5810 R型冷冻离心机(德国Eppendorf公司)，二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)，Milli-Q Biocel型超纯水系统(美国Millipore公司)，WYJ-875 B型医用净化工作台(苏州金燕净化设备厂)，超声波细胞破碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)。
1.3 细胞培养与处理PC12细胞接种于RPMI 1640培养基，在37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养，将对数生长期的细胞分别设置为Con组(二甲基亚砜处理组)、15及30 μmol·L-1(由二甲基亚砜配制)ZEA组，染毒时间为24 h。
1.4 CCK-8法检测PC12细胞存活率用0.25%胰酶消化细胞，收集细胞悬液以5×103个·100 μL-1的细胞密度将PC12细胞接种于96孔培养板中，每孔100 μL，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h。分为Con组、ZEA处理组(15、30 μmol·L-1)，每组设6个重复。空白对照组加入等量PBS，Con组加等量细胞培养基。染毒24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续培养2 h后，将96孔板置于全自动酶标仪中，于450 nm波长下测定各孔光吸收值(OD450 nm)，细胞的存活率=(试验组OD450 nm-空白对照组OD450 nm)/(阴性对照组OD450 nm-空白对照组OD450 nm)×100%。
1.5 Western blot检测蛋白表达将对数生长期的PC12细胞分为Con组、ZEA处理组(15、30 μmol·L-1)，弃去培养基上清液，用预冷的PBS清洗1~2次，吸净余液，加入裂解液(RIPA裂解液∶蛋白酶抑制剂＝100∶1)100 μL，刮取细胞至1.5 mL EP管中，标记组别，于4 ℃裂解30 min，超声破碎细胞20 s，4 ℃ 12 000 r·min-1离心10 min后吸取上清液。使用BCA试剂盒测定各组别蛋白浓度，并用裂解液将各组蛋白质浓度调至一致，加入5×SDS蛋白上样缓冲液，沸水浴使之变性10 min，置于-80 ℃保存。进行Western blot试验时，将蛋白样品室温溶解，按照每孔10 μL上样量进行SDS电泳。电泳分离后，将蛋白转印至PVDF膜上，用5%的脱脂乳作为封闭液，室温封闭1.5~2.0 h，封闭结束后TBST清洗，根据试验设计将PVDF膜加入相应蛋白的一抗稀释液中，4 ℃孵育过夜。TBST缓冲液洗涤5次，每次5 min。根据一抗选择对应的二抗孵育2 h，TBST洗涤5次，用显影仪进行显影。
1.6 mRFP-GFP-LC3检测自噬流待细胞密度长到50%左右的时候，根据mRFP-GFP-LC3的MOI(感染复数)值，配制所需工作液。加入培养皿体积1/2的工作液后，将细胞移至37 ℃培养箱进行培养，所有操作均需避光。培养6 h后，补充培养基至培养皿的正常体系。
1.7 AO染色观察ZEA对PC12细胞酸性环境的影响取对数生长期的PC12细胞接种于含有爬片的6孔板中，置于37 ℃，5% CO2培养箱培养，24 h后更换培养液，试验设置Con组、不同浓度ZEA(15、30 μmol·L-1)处理组，以1 μg·mL-1吖啶橙避光染色15 min，荧光显微镜下观察并拍照。
1.8 免疫荧光检测LC3、TFEB定位情况将细胞接种于24孔板中，以不同浓度ZEA(15、30 μmol·L-1)作用PC12细胞24 h。弃去培养液，使用PBS洗涤2次，4%多聚甲醛在4 ℃条件下固定30 min，PBS洗涤2次，0.5% TritonX-100室温条件下固定20 min，PBS洗涤2次，以50 g·L-1 BSA室温封闭30 min后，加入一抗，在4 ℃条件下孵育12 h；PBS洗涤3次后，加入二抗作用1 h，PBS洗涤3次，加入DAPI作用15 min，再次使用PBS洗涤3次后, 加入防荧光淬灭剂，封片处理，使用激光共聚焦显微镜进行观察，选择有代表性的细胞并拍照。
1.9 数据的处理与统计分析应用SPSS 22.0统计软件对数据进行显著性t检验和单因素方差(ANOVA)分析。P < 0.05表示差异显著。
2 结果 2.1 ZEA对PC12细胞存活率的影响将处于对数期的细胞分别设置为Con组、ZEA处理组，本课题组前期研究中，关于ZEA处理使生殖细胞发生自噬的作用浓度多为20 μmol·L-1，而ZEA对神经系统的毒性作用弱于生殖系统，为探究ZEA使PC12细胞发生自噬的最佳浓度范围，使用CCK-8对不同浓度的ZEA(7.5、15.0、30.0、45.0 μmol·L-1)进行筛选，每组设6个重复，染毒处理24 h后，使用CCK-8检测细胞活力。结果如图 1所示，与对照组相比，15 μmol·L-1及以上浓度ZEA染毒组细胞活力显著下降(P < 0.05)，而45 μmol·L-1的ZEA组细胞存活率低于50%，细胞死亡率过高将会影响试验结果，因此将采用15、30 μmol·L-1进行后续试验。
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*.P < 0.05，下同 *.P < 0.05, the same as below 图 1 CCK-8检测ZEA对细胞活力影响 Fig. 1 CCK-8 was used to detect the effect of ZEA on cell viability |
取对数期PC12细胞，用不同浓度ZEA(15、30 μmol·L-1)处理24 h后，Western blot检测自噬相关蛋白ATG5、Beclin1、LC3 Ⅱ、p62表达水平。结果如图 2所示，与对照组相比，15、30 μmol·L-1的ZEA处理组ATG5、LC3 Ⅱ、p62表达水平均显著上升(P < 0.05)，30 μmol·L-1的ZEA组Beclin1表达水平显著上升(P < 0.05)，结果表明，ZEA可引起PC12细胞自噬体增加及自噬水平升高。
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A. 蛋白印迹检测ATG5、Beclin1、LC3 Ⅱ、p62蛋白表达水平；B. 灰度分析ATG5、Beclin1、LC3 Ⅱ、p62相对蛋白水平 A. Western blotting detection of protein expression levels of ATG5, Beclin1, LC3 Ⅱ and p62; B. The relative protein levels of ATG5, Beclin1, LC3 Ⅱ and p62 by gray analysis 图 2 ZEA对PC12细胞自噬相关蛋白表达水平的影响 Fig. 2 Effect of ZEA on the expression level of autophagy related proteins in PC12 cells |
自噬体的形成是自噬过程必不可少的阶段。通过免疫荧光检测定位于自噬体的LC3，结果如图 3所示，与对照组相比，ZEA不同浓度处理组都呈现LC3荧光聚点增加的情况，表明PC12细胞自噬体生成增加，提示ZEA可引起PC12细胞自噬水平升高。
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免疫荧光检测LC3标记的自噬体定位情况 Immunofluorescence was used to detect the localization of autophagy labeled by LC3 图 3 ZEA对PC12细胞自噬体生成的影响 Fig. 3 Effect of ZEA on autophagosome formation in PC12 cells |
mRFP-GFP-LC3双标腺病毒转染PC12细胞后，不同剂量ZEA(15、30 μmol·L-1)处理PC12细胞，mRFP用于标记及追踪LC3，GFP的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，由于GFP荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体溶酶体融合后，GFP荧光发生淬灭，只能检测到红色荧光，即红绿荧光融合后出现的红色斑点指示自噬溶酶体，黄色斑点为自噬体，通过共聚焦显微镜可对此进行观察，结果如图 4所示，Con组呈现出弥散的黄色荧光，随着染毒浓度的增加，观察到黄色荧光聚点明显增多，红色荧光聚点几乎不可见，15 μmol·L-1 ZEA组最为明显，提示LC3定位于自噬体内，表明ZEA处理使PC12细胞发生自噬流阻滞。
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mRFP-GFP-LC3双标腺病毒转染PC12细胞检测自噬流 mRFP-GFP-LC3 adenovirus was transfected into PC12 cells to detect autophagy 图 4 ZEA对PC12细胞自噬流的影响 Fig. 4 Effects of ZEA on autophagy flow in PC12 cells |
吖啶橙是一种亲溶酶体剂，也是一种荧光素，可透过正常细胞膜蓄积在细胞内的酸性结构中，常用来检测溶酶体的功能状态。AO在具有酸性环境的溶酶体中处于高浓度状态，而在细胞质和核中处于低浓度状态，溶酶体中的AO呈红色荧光，细胞质和细胞核中的AO呈绿色荧光。结果如图 5所示，对照组即正常培养条件下PC12细胞内可见明显的红色荧光斑点，体现PC12细胞内基础水平的溶酶体，随着ZEA染毒浓度的增加，红色荧光减少, 绿色荧光稍有增强，30 μmol·L-1 ZEA组红色荧光几乎不可见，表明溶酶体受到损害，膜通透化且数量减少，提示ZEA可能通过损伤溶酶体来阻碍自噬流。
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图 5 AO染色观察细胞内溶酶体状态 Fig. 5 AO staining was used to observe the intracellular lysosomal state |
细胞自噬是真核细胞内一种高度保守的溶酶体依赖的分解代谢过程。溶酶体的正常运作是维持自噬通量的重要保障。前期试验证明，ZEA可能通过损伤溶酶体来阻碍自噬通量，下步试验将验证ZEA是否会对PC12细胞溶酶体产生损伤。
LAMP1是溶酶体的标志蛋白，通常通过检测LAMP1来识别溶酶体。溶酶体内含多种水解酶，组织蛋白酶是其中之一，其具有多种生物活性, 是哺乳动物体内蛋白水解的主要参与者。而本试验检测的是细胞质中CTSB和CTSD的表达水平。在本研究中，对照组及ZEA组(15、30 μmol·L-1)处理24 h后，Western blot检测LAMP1、CTSB、CTSD蛋白表达水平。结果如图 6所示，与对照组相比，随着ZEA染毒浓度增高，CTSD表达水平显著升高(P < 0.05)，CTSB表达水平在ZEA为30 μmol·L-1时显著升高(P < 0.05)，LAMP1表达水平在ZEA为30 μmol·L-1时显著下降(P < 0.05)。有研究报道，LAMP1蛋白在维持溶酶体膜结构稳定性方面起着重要作用[9]，其表达水平降低时将影响细胞自噬功能。表明ZEA可能通过降低LAMP1蛋白水平来对溶酶体造成损伤，同时原本位于溶酶体内的CTSB和CTSD在细胞质中表达升高意味着溶酶体受到损害导致CTSB和CTSD流入细胞质中，进一步证实ZEA可对溶酶体造成损伤。
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A. 蛋白印迹检测LAMP1、CTSB、CTSD蛋白表达水平；B. 灰度分析LAMP1、CTSB、CTSD相对蛋白水平 A. Western blot detection of protein expression levels of LAMP1, CTSB and CTSD; B. The relative protein levels of LAMP1, CTSB and CTSD by gray analysis 图 6 ZEA对PC12细胞溶酶体相关膜蛋白及组织蛋白酶表达水平的影响 Fig. 6 Effects of ZEA on the expression levels of lysosomal-related membrane proteins and cathepsin in PC12 cells |
TFEB是自噬-溶酶体途径(ALP)的主要转录调节因子，它积极调节自噬和溶酶体生物发生相关基因的表达，从而促进自噬体的形成、自噬体-溶酶体的融合和自噬底物的降解[10]。ERK(细胞外调节蛋白激酶)，是将信号从表面受体传导至细胞核的关键，磷酸化激活的ERK由细胞质转移到核内，调节转录因子活性。不同浓度ZEA(15、30 μmol·L-1)处理PC12细胞24 h后，Western blot检测ERK、p-ERK、胞质及核内TFEB蛋白表达水平，结果如图 7所示，与对照组相比，随着ZEA浓度增高，p-ERK蛋白表达水平显著下降(P < 0.05)，30 μmol·L-1 ZEA组核内TFEB蛋白表达水平显著下降(P < 0.05)，而细胞质内TFEB表达水平未见显著性变化。ERK通过磷酸化激活进而由胞质转移到核内来调节TFEB的活性，与此一致，p-ERK表达水平的显著下降伴随着核内TFEB表达水平得显著下降，表明ZEA可能通过阻碍ERK的激活来影响TFEB的转录活性，也表明ZEA对PC12细胞TFEB蛋白的入核起抑制作用，进而影响溶酶体功能和自噬通量。同时使用免疫荧光检测TFEB的入核表达情况，结果如图 7所示, 对照组细胞TFEB入核明显，细胞核内绿色荧光与蓝色荧光聚集，呈现比细胞核稍浅的淡蓝色荧光，随着ZEA染毒浓度的增高，TFEB在细胞核内定位减少，所以细胞核内蓝色荧光强度明显比对照组加深，表明TFEB入核受到抑制，与Western blot结果一致。
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A. 蛋白印迹检测ERK、p-ERK、TFEB在细胞质及核内蛋白表达水平；B. 灰度分析p-ERK、TFEB在细胞质及核内相对蛋白水平；C. 免疫荧光检测TFEB入核情况 A. Western blotting detection of protein expression levels of ERK, p-ERK and TFEB in cytoplasm and nucleus; B. The relative protein levels of ERK, p-ERK and TFEB in cytoplasm and nucleus by gray analysis; C. Immunofluorescence was used to detect the entry of TFEB into the nucleus 图 7 ZEA对PC12细胞中TFEB蛋白表达水平及TFEB入核的影响 Fig. 7 Effect of ZEA on TFEB protein expression and TFEB nucleation in PC12 cells |
自噬的最后一步是自噬体与溶酶体的融合，这是由SNARE蛋白介导的，SNARE蛋白中涉及自噬体定位的Q-SNARE，如STX17和SNAP29对自噬体与溶酶体的融合起重要作用[11]。本研究用不同剂量ZEA(15、30 μmol·L-1)处理PC12细胞后，Western blot检测自噬体与溶酶体融合关键蛋白SNAP29、STX17蛋白表达水平。结果如图 8所示，与对照组相比，随着ZEA染毒浓度增加，SNAP29、STX17蛋白表达水平均显著下降(P < 0.05)，表明ZEA可通过影响自噬体与溶酶体的融合来阻碍自噬流。
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A. 蛋白印迹检测SNAP29、STX17蛋白表达水平；B. 灰度分析SNAP29、STX17相对蛋白水平 A. Western blotting detection of protein expression levels of SNAP29, STX17; B. The relative protein levels of SNAP29, STX17 by gray analysis 图 8 ZEA对PC12细胞自噬体溶酶体融合相关蛋白表达水平的影响 Fig. 8 Effects of ZEA on expression levels of autophagosomal lysosomal fusion related proteins in PC12 cells |
细胞自噬是进化上高度保守的，针对胞内成分再循环的溶酶体降解过程。细胞自噬帮助清除受损的细胞器、蛋白聚集体和生物大分子，实现细胞物质的循环与再利用，以维持细胞稳态[12]。在自噬过程中，细胞质物质被自噬体(一种双膜结构)隔离，并被运送到溶酶体进行消化[13]。自噬体的形成受到一组自噬相关蛋白的严格调控。其中，LC3是自噬体形成所必需的[14]，也是公认的自噬标志物。自噬被诱导及自噬流被阻断均可引起LC3升高，同时p62升高是自噬流阻断的一个很好的指示标志[15]。本试验对自噬相关蛋白表达水平分析显示，LC3 Ⅱ、p62、ATG5及Beclin1表达均增加，提示ZEA诱导PC12细胞发生自噬，而细胞内LC3 Ⅱ增加可能与其阻断自噬流有关，免疫荧光试验中LC3荧光聚点增多也提示自噬体增多。为进一步验证，作者使用mRFP-GFP-LC3检测自噬流，由于GFP对酸性敏感，GFP的减弱可指示自噬流活化，当LC3定位于酸性环境的自噬溶酶体时只表现红色荧光，定位于自噬体时呈黄色荧光，观察发现红色荧光的量明显少于黄色荧光的量，即自噬流阻滞。试验结果表明，ZEA诱导PC12细胞自噬涉及自噬流阻滞。
为探究ZEA致PC12细胞自噬流阻滞的机制，本试验采用AO染色观察了具有酸性环境的溶酶体生成情况。AO染色中胞核和胞质呈绿色荧光，其聚集在酸性隔室时呈红色荧光，当红光减弱，绿光增强时，提示环境中pH升高且溶酶体膜通透化，结果证明ZEA处理使溶酶体数量降低伴随膜通透化。随后，本试验检测了自噬体与溶酶体融合阶段所必需的蛋白LAMP1[16]及细胞质起蛋白水解作用的CTSB、CTSD [17]蛋白表达水平，发现细胞质中CTSB和CTSD表达呈不同程度的增高，即溶酶体受到损伤，蛋白水解酶由溶酶体进入细胞质，进而影响了溶酶体的降解能力。Song等[18]研究发现，铅可通过影响CTSB和CTSD的成熟来抑制溶酶体的降解能力，这与本试验结果一致。
TFEB是自噬-溶酶体途径的主要转录调节因子，可通过调节自噬相关基因的表达，从而调节自噬体的生成和自噬溶酶体的融合等过程[19]。此外TFEB还参与溶酶体的生物发生和胞吐，通过促进溶酶体基因的表达来调节自噬溶酶体的产生和外排功能[10]。本研究通过检测p-ERK及TFEB在核内外的表达水平，发现p-ERK及核内TFEB蛋白表达下降，而胞质内TFEB未见显著变化。p-ERK从细胞质转移到核内调节TFEB的活性，ZEA影响TFEB的转录活性可能通过阻碍ERK的激活来实现，也表明ZEA对TFEB的入核起抑制作用。免疫荧光试验结果也证实ZEA暴露后TFEB入核减少，提示ZEA可能通过抑制TFEB的入核来阻滞自噬流。
在自噬过程中，自噬体和溶酶体的融合是完全降解必不可少的，自噬体的早期生物发生和溶酶体的晚期降解都需要膜融合活性[20]。自噬体通过与溶酶体融合，将细胞内部待消化的物质完全包裹后送入溶酶体中才得以降解并实现循环利用。自噬小体定位的STX17、SNAP29和溶酶体定位的VAMP8或VAMP7被认为是参与融合过程的关键因素[11]。自噬启动过程中，STX17转位到自噬体，与SNAP29形成二元复合物，然后STX17-SNAP29与溶酶体Vamp8相互作用形成膜复合物，促进自噬体-溶酶体融合[21]。本研究中STX17及SNAP29的蛋白表达量均降低，ZEA可能通过抑制STX17及SNAP29的表达及结合过程来阻碍自噬溶酶体的膜融合，进而阻滞自噬流。
4 结论ZEA暴露对溶酶体造成了损伤，影响了其数量及降解功能，抑制了TFEB入核过程，降低了自噬溶酶体融合蛋白表达水平，引起自噬流阻滞，而自噬体无法正常降解会堆积在细胞内，造成自噬体数量增多的现象，最终导致细胞内代谢紊乱，提示自噬流阻滞参与了ZEA对PC12细胞的神经毒性作用。本研究为进一步揭示ZEA对神经系统毒性作用机制提供了重要科学依据。
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(编辑 白永平)