2. 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州 225009
, ZHANG Nan1,2, HU Qun1,2, QUAN Keji1,2, QIN Tao1,2, CHEN Sujuan1,2
, PENG Daxin1,2, LIU Xiufan1,2
2. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China
H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)于1966年首次在美国威斯康星州被发现。我国于1992年在广东首次报道发现H9N2亚型AIV，并随之在南方各省迅速传播。目前是中国流行最广泛的低致病性AIV，可和其他病原发生混合感染造成死亡率上升，引起严重的经济损失。此外，它可为新出现的重配病毒如H7N9亚型AIV等提供供体基因[1]，同时报道显示有部分家禽养殖从业者血清呈H9亚型AIV抗体阳性，因此病毒的传播也存在很大的公共卫生隐患[2]。
为防控我国H9N2亚型禽流感，以A/Chicken/Shanghai/F/1998(H9N2)为代表的全病毒灭活疫苗在家禽养殖中广泛使用[3]。目前，主要流行的毒株属于h9.4.2.5谱系，HA基因的遗传进化分析表明，当前流行株与疫苗株的核苷酸遗传距离较远[4-5]。基于交叉血凝抑制和交叉微量中和试验的抗原图谱分析研究中，流行株和疫苗株可形成不同的抗原分群，疫苗株的免疫血清难以有效中和抗原差异大的流行株，疫苗株与流行株不匹配，从而导致了免疫失败[6]。在疫苗的免疫压力下，AIV更易发生抗原漂移[7]。因此，探究H9N2亚型AIV抗原变异的分子基础是解析当前流行株抗原性改变的关键。
目前，虽已报道了H9N2 AIV抗原位点鉴定的相关研究，并将HA蛋白头部的抗原区域分为两个独立表位[8]。但前人鉴定的与抗原性相关的位点在自然流行株中很多都保守，不足以解释我国当前H9N2亚型AIV流行株抗原性改变的原因[9]。因此，本研究利用研制的单抗对抗原位点进行了鉴定，并对本实验室2017—2019年分离的H9N2亚型AIV进行了抗原谱分析，分析相关抗原位点的变异规律。
1 材料与方法 1.1 病毒和单抗H9N2亚型AIV A/chicken/Shanghai/F/1998(F98)毒株为本实验室保存。其相应单抗2E4[10]和2D6[11]为本实验室制备。
1.2 血凝抑制试验和中和试验血凝抑制试验(hemagglutinin inhibition，HI)按照世界动物卫生组织(World Organization for Animal Health，OIE)的标准进行操作。微中和试验按照文献[12]进行操作，利用Reed-Muench法计算病毒在CEF细胞上的TCID50，再将2 000 TCID50·mL-1的病毒工作液与等体积的两倍倍比稀释的抗体进行孵育，其中每种稀释度设置3个重复，37 ℃孵育1.5 h后，按照100 μL·孔-1接种于长有CEF细胞的96孔细胞板中，37 ℃吸附1 h后，再换液为含有2 μg·mL-1 TPCK胰酶的M199培养基培养，72 h后通过测定上清HA效价判定结果。HA效价为阴性的抗体最高稀释度为该抗体的中和效价。
1.3 单抗逃逸突变株的筛选和抗原位点的鉴定根据文献报道[13-14]并做适当改进开展逃逸突变株筛选，将0.1 mL的106TCID50的F98病毒与0.5 mL单克隆抗体进行混合，室温孵育1 h后，将抗原抗体混合物接种于9~11日龄的SPF鸡胚(n=3)，72 h后收取具有HA效价的尿囊液，所收获病毒尿囊液通过有限稀释法进行进一步筛选。将稀释至10-3的阳性尿囊液0.1 mL与单抗0.5 mL混合，室温孵育1 h后，将抗原抗体混合物再稀释至10-1、10-2、10-3、10-4稀释度，200 μL·胚-1接种鸡胚(n=3)，72 h后收取最高稀释度的有HA效价的尿囊液。再按上述有限稀释法重复筛选1次。
提取纯化后病毒的RNA，利用RT-PCR扩增HA基因片段，电泳切胶测序。使用MegAlign软件比对逃逸株和母本毒株F98的氨基酸序列差异。
1.4 抗原谱分析使用MEGAX软件中的MUSCLE将实验室2017—2019年度分离的H9N2亚型AIV HA基因进行序列比对，绘制Neighbor-joining遗传进化树，Bootstrap设置为1 000进行检验。使用iTOL对遗传进化树进行美化[15]。根据遗传进化树选择代表性H9N2亚型AIV毒株，通过HI效价确定单抗与病毒的反应性。
1.5 HA基因序列比对在全球流感数据共享平台(Global Initiative on Sharing Avian Influenza Data，GISAID，https://platform.gisaid.org/epi3/frontend#2a8325)中下载从1996—2021年度(截至6月5日)中国地区禽类中分离的H9N2 AIV HA基因序列，使用Phylosuite软件中的MATFF进行序列比对，统计145和153位点的氨基酸变异情况。
1.6 位点模拟分析以蛋白质三维结构数据库(PDB, https:/www.wwpdb.org/)中的H9N2亚型病毒HA1分子晶体结构(编号: 1 JSD.1.A)为模板，在网站SWISS-MODLE (https://www.swissmodel.expasy.org/interactive)将F98 HA1蛋白序列用Alignment Mode方法建模。生成的HA1分子用pymol软件进一步分析和修饰。
2 结果 2.1 单抗2E4和2D6的生物学特性2E4和2D6针对母本毒株F98的HI效价均为213; 微量中和试验结果显示，2E4和2D6针对F98的中和效价分别为1∶10 240和1∶2 560(表 1)。
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表 1 单抗的生物学特性 Table 1 Biological properties of mAbs |
在单抗2E4和2D6作用下收获的阳性尿囊液，再在鸡胚中经过两轮有限稀释法的纯化后获得了两株突变株(m2E4-1和m2D6-1)，对应筛选抗体的HI效价均≤22(表 2)。进一步对突变株m2E4-1和m2D6-1的HA基因与母本毒株F98的HA基因进行比对，发现m2E4-1在434位核苷酸位点发生G→A的突变，导致145位氨基酸位点产生了S→N的替换，由此形成了145—147位NGT模式的潜在糖基化位点。m2D6-1在459位发生A→T的突变，相应的出现了D153E的氨基酸替换(表 3)。
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表 2 逃逸株与单克隆抗体交叉血凝抑制结果 Table 2 Cross-reaction of escape mutants with mAbs by HI assay |
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表 3 抗原位点鉴定结果 Table 3 Identification of antigenic sites |
2017—2019年度分离的H9N2亚型AIV HA基因遗传进化树显示分离株均属于h9.4.2.5谱系(图 1)。
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●.参考株; △.抗原谱分析毒株 ●. Reference strains; △. Indicating selected strain for determination of antigenic profile 图 1 2017—2019年度分离的H9N2亚型AIV HA基因遗传进化分析 Fig. 1 Phylogenetic analysis of HA gene of H9N2 subtype AIV isolated in 2017-2019 |
在遗传进化树上，将毒株划分为两个大分支Group 1(32/109)和Group 2(77/109)，两个Group的组间平均遗传距离为7.22%(图 1)。
从Group 1挑选的5株代表株和Group 2挑选的16株代表株测定与单抗的反应性。Group 1的毒株与单抗2E4的HI效价均≥27，与单抗2D6的HI效价均≥210; Group 2中所有毒株与单抗2E4的HI效价均在20~22，A/chicken/Jiangyin/JY110712/2018和A/chicken/Jiangyin/JY010220/2019毒株与单抗2D6的HI效价分别为25和24以外，其余14株毒株HI效价均为20(表 4)。
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表 4 单抗2E4、2D6抗原谱分析结果和145位、153位氨基酸位点的突变情况 Table 4 Antigenic profile of mAbs 2E4 and 2D6 and amino acid substitutions at the 145 and 153 amino acid positions |
比对用于抗原谱分析毒株的HA基因的145位和153位氨基酸发现，Group 1毒株的HA蛋白在145位和153位均分别为S(5/5)和D(5/5)，Group 2毒株HA蛋白145位均突变为D(16/16)，153位突变为G(15/16)。但A/chicken/Jiangyin/JY110712/2018与单抗2D6的HI效价为25，但是其153位却为D(表 4)。
2.4 禽源H9N2亚型AIV相应位点自然突变率分析自GISAID中下载的禽源H9N2毒株AIV HA蛋白序列，对145位分析后发现，在1996—2009年和2010—2014年分离株中，含145S的分离株都占57%，在2015—2021年分离株中，含145D的分离株占68%。在1996—2009年和2010—2014年分离株中，含145N的分离株分别占6%和10%，2015—2021年无含145N的分离株。对153位分析后发现，含153D的分离株在1996—2009年和2010—2014年中分别占57%和53%，含153G的分离株在2015—2021年占66%。鸡源和鸭源毒株变化趋势一致(图 2)。
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图 2 禽源H9N2亚型AIV HA蛋白145和153位氨基酸位点的自然突变率 Fig. 2 Natural mutation rate at the 145 and 153 amino acid positions of HA protein of avian-origin H9N2 subtype AIV |
从HA1分子的模拟构象可以看出，145和153位均位于分子的头部的受体结合区域(receptor binding site，RBS)附近(图 3)。与145S相比，145 N和145D的残基侧链更长，突出HA1分子表面。与153D相比，153E和153G的残基侧链更长，突出HA1分子表面。
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A. F98 HA1(145S 153D)分子模拟构象; B. F98 HA1(145N 153D)分子模拟构象; C. F98 HA1(145S 153E)分子模拟构象; D. F98 HA1(145D 153G)分子模拟构象。黄色：Y109、S148、W161、T163、N191、P194、A198、L202、Q234和G236为RBS区域 A. F98 HA1 (145S 153D) molecular simulation conformation; B. F98 HA1 (145N 153D) molecular simulation conformation; C. F98 HA1 (145S 153E) molecular simulation conformation; D. F98 HA1 (145D 153G) molecular simulation conformation. Yellow: Y109, S148, W161, T163, N191, P194, A198, L202, Q234 and G236 are RBS areas 图 3 145和153位点在H9N2 HA1分子上的定位 Fig. 3 Location of 145 site and 153 site in H9 HA |
H9亚型AIV是我国感染最广泛的低致病性AIV，目前的H9亚型毒株在各种选择压力下已经发生了变异，导致抗原性出现了改变。从本实验室前期制备的H9N2亚型AIV HA蛋白单抗中选取了两株HI效价高的单抗，经过鉴定也有很高的微中和效价。将F98毒株与单抗孵育后在SPF鸡胚中传代，筛选到逃逸突变株m2E4-1和m2D6-1，其HA蛋白分别拥有S145 N和D153E的突变。Kaverin等[16]将鉴定的抗原位点划分成了Site Ⅰ、Site Ⅱ和Overlapping 3个区域，其中145位于Site Ⅰ和Site Ⅱ重叠的Overlapping区域，153位于Site Ⅱ区域。单抗2E4对m2D6-1的HI效价为29，单抗2D6对m2E4-1的HI效价为210，和母本毒株相比略有降低，证明这两个抗原位点相互影响较小，与Kaverin等[16]的结果相一致。
S145N的突变使得HA蛋白在145—147位产生了1个NGT氨基酸模式的潜在糖基化位点。研究表明，在毒株的HA分子对唾液酸受体处于高亲和力时，HA分子头部RBS附近的糖基化位点会影响病毒对细胞的入侵，从而产生对疫苗免疫的逃逸[17]。朱寅彪等[13]也利用一株HI中和效价很高(分别为214和104.3)的HA单抗筛选到S145N的单抗逃逸突变体，另外他发现HA基因为145T的毒株也可以发生逃逸，而我们的抗原谱分析中发现拥有145D突变的毒株也会引起单抗逃逸，因此糖基化不是该位点逃逸单抗的唯一机制。并且145和153两个位点均位于HA1分子的头部RBS附近，推测单抗的中和效果来源于识别了RBS附近的表位，从而屏蔽RBS与唾液酸受体的结合[18]。并且相对于F98毒株145S和153D的结构，突变后的氨基酸因为相比于原模式氨基酸侧链更长，更突出于HA1分子的表面，可能会直接影响到与抗体的结合能力[19]。
申松玮等[20]将2017—2018年度分离的H9N2亚型AIV HA基因划分为两个组，其组间遗传距离为6.71%。笔者划分的Group 1和Group 2的组间遗传距离为7.22%，与其基本一致。申松玮等[20]对两个组代表株的交叉HI结果进行R值评估后发现，两个组内抗原性相近，但两组间的抗原性不同，可分为两个抗原型。本研究HI抗原谱分析显示示，Group 1内毒株与单抗的反应性好，而Group 2内毒株与单抗的反应性差，单抗2E4反应谱与基因分型一致，表明单抗2E4可用于当前H9N2亚型AIV的抗原分型。在145位，Group 1代表株均为S，Group 2代表株均为D; 在153位，Group 1代表株均为D，Group 2代表株除1株外其余均为G。可见S145D的替换在两个Group中的符合性更高，145位更适合作为鉴定病毒抗原变异的分子靶标。
朱寅彪等[13]发现含145N的病毒在鸡源和鹌鹑源的自然分离率为10%左右(截至2015年)，这与作者分析的2014年之前145N占比相一致。但1996—2021年间禽源H9N2亚型AIV分析显示近年来含145D和153G的突变株占比分别为68%和66%，说明Group 2抗原型已成为流行的主要抗原型。因此利用单抗2E4对流行株进行抗原分型，加强对145位氨基酸位点的检测尤为重要。
4 结论单抗2E4与2D6分别识别H9N2亚型禽流感病毒HA头部的145位和153位抗原位点。我国流行株中存在两种抗原群，单抗2E4可以对两种抗原群进行区分，抗原位点145位是鉴别Group 1和Group 2抗原群差异的分子靶标之一，为H9N2亚型禽流感的防控提供了疫苗选择依据。
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(编辑 白永平)