2. 新疆生猪种业工程技术研究中心，昌吉 831100
, XIE Su1, GAO Ruonan1, SUN Yishan1, SUN Xiaomei1, HE Junfei1,2, LU Huiwen1,2, LU Shihao1, CHEN Xin1, LI Qingchun1, HUANG Tao1,2
2. Xinjiang Engineering Research Center for Swine Breeding Industry, Changji 831100, China
在胚胎附植和早期妊娠的相关研究中，由于其涉及的基因、通路和生理过程极其复杂，导致对胚胎附植机制进行解析十分困难。蛋白质是基因表达翻译的最终产物，直接反映了生物体生命的复杂性和多样性。蛋白质组学可以对某一时期存在于某一细胞、组织或器官中的所有蛋白质进行组学鉴定和研究。Choe等[1]对患有子宫内膜炎牛的子宫内膜与正常牛的子宫内膜进行蛋白质组学分析，发现desmin和α-actin-2可能在子宫内膜炎的产生中发挥重要作用。Mullen等[2]对胚胎附植前高产奶牛的子宫内环境进行蛋白组研究，总共发现34种差异表达的蛋白质，推测其可能参与了为胚胎附植做准备的子宫环境重构、胚胎生长发育和保护、保持子宫健康、以及母体免疫调节。Koch等[3]鉴定了未妊娠和早期妊娠绵羊子宫液中的蛋白质，发现有15种与胚胎发育相关的差异表达蛋白(最高有65倍)，数据提供了子宫与孕体水平上与妊娠早期相关联的动态生理过程。通过对蛋白质进行鉴定来研究基因的表达或将成为猪胚胎附植机理研究的一个新思路。
在动物妊娠早期胚胎发育过程中存在的极为复杂的信号传导网络[4]中有一些信号分子可以作为妊娠早期分子标志物。1974年在孕鼠血清中发现了早孕因子[5]。早孕因子是最早确认妊娠的生物化学标志物之一，反映胚胎成活能力[6]。HCG是一种糖蛋白激素，受精卵的滋养层细胞在受精后第6天形成, 之后就开始分泌微量的HCG，受精后第10天可从母体血清中检测到，HCG可作为确认妊娠的生物化学标志物[7]，并在人的早期妊娠诊断中得到广泛应用。薄小辉[8]在奶牛胎儿胎盘中分离鉴定出8种PAGs天然蛋白，并用表达的PAG4重组多肽免疫兔获得多克隆抗体，可用于区分妊娠奶牛和未妊娠奶牛血清。研究表明，相对于第0天，奶牛人工授精21 d后RSAD2基因的表达量显著升高[9]。蛋白质在表达调控方面发挥十分重要的作用，它们在动物生长发育不同的生理阶段都具有重要的调控作用。iTRAQ技术作为新兴的蛋白质组学定量手段，具有重复性好、通量高等优势，可为蛋白质定量以及寻找相关生物标志物等方面提供可靠依据[10-12]，多被应用于肿瘤生物标志物的筛选[13-14]。通过筛选差异蛋白质来寻找生物标志物的方法已经成为一个主流[15]，但妊娠早期母猪外周血中蛋白标志物的相关研究尚未见报道。
本研究筛选在妊娠早期差异表达的蛋白，验证了其表达情况，旨在揭示母猪配种后第15天(即胚胎附植期)外周血中蛋白的表达差异，为寻找潜在的母猪早期妊娠生物标志物提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 试验动物1.1.1 测试组 选取8头健康、生产表现正常且体况相近的长大二元经产母猪作为iTRAQ分析样本，随机分为2组，即试验组和对照组，每组4头。按照常规生产流程查情配种，试验组母猪输入正常的精液，对照组母猪输入死精(正常精液高温煮沸，并在显微镜下观察确认精子死亡)。在配种后第15天采集试验组、对照组母猪血液，分离血浆，立即置于干冰中冷冻保存，并尽快运回实验室置于超低温冰箱保存备用。
1.1.2 验证组 另于大群中随机采集配种后第15天母猪血液样本30例作为ROC曲线分析样本，分离血浆，立即置于干冰中冷冻保存，并尽快运回实验室并置于超低温冰箱保存。
1.2 主要试验仪器主要仪器包括超低温冰箱(－80 ℃)、恒温水浴锅、高压灭菌锅、单道移液器、多道可调移液器、梯度PCR仪、超净工作台、NanoDrop 2000(Thermo Scientific，美国)、LightCycler 480实时荧光定量PCR仪、八连排离心机、高速冷冻离心机、电热恒温培养箱、水平电泳槽电泳仪、GelDoc X R型凝胶成像系统及酶标仪(Thermo)等。
1.3 主要试验试剂主要试剂包括反转录试剂盒Primer ScriptTM RT regagent Kit(TaKaRa)、血浆总RNA提取试剂盒(RP4001，百泰克)、Light Cycler 480 SYBR GreenⅠ(Roche)、八连管(Roche); RNA线性酶(RNR-07250, Epicentre); DNA MarkerⅠ(天根)、Agarose琼脂糖(Invitrogen)、ProteoPrep® Blue白蛋白及IgG去除试剂盒(Sigma-Aldrich)、Bradford蛋白质检测试剂盒(碧云天)、端粒重复结合因子2(TERF2)、结合珠蛋白(HP)、脂联素(ADIPOQ)和细丝蛋白C(FLNC)的ELISA试剂盒(上海恒远生物科技有限公司)等。
1.4 蛋白样品制备及质检从超低温冰箱(－80 ℃)取出血浆样品，分别加入4倍体积的裂解缓冲液，进行超声裂解。然后4 ℃，12 000 g离心10 min，去除细胞碎片，将上清液转移至新的离心管，利用Bradford蛋白质检测试剂盒进行蛋白浓度测定。使用ProteoPrep® Blue白蛋白及IgG去除试剂盒(Sigma-Aldrich)去除高峰度蛋白。SDS-PAGE电泳检测蛋白样品质量，以用于后续试验。
1.5 iTRAQ定量分析1.5.1 胰蛋白酶酶切、标记、分馏及LC-MS/MS分析 样品各取100 μg蛋白加入10 mmol·L-1 DTT在37 ℃还原60 min，25 mmol·L-1碘乙酰胺(IAM)暗处室温反应30 min。使用胰蛋白酶进行二步法酶切，胰酶酶解完成后进行strata x spe柱子脱盐，真空干燥。肽段使用8-plex iTRAQ试剂标记。HPLC溶液A溶解干燥的标记后肽段，进行HPLC分馏，收集馏分48管，合成15管。将分馏样品溶解在溶液A中，按表 1洗脱梯度进行串联质谱分析。全扫描分辨率为70 000。离子强度前15位的母离子进行碎裂能为32%的HCD碎裂，动态排除时间为10 s。
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表 1 洗脱梯度参数 Table 1 Elution gradient parameters |
1.5.2 iTRAQ数据分析 通过Uniprot数据库下载猪蛋白质组数据库(物种编号：9823，包含40706蛋白质序列，蛋白质组编号：UP000008227)，使用软件Proteome Discoverer(版本1.3，Thermo Scientific)进行搜库。设置胰蛋白酶为消化酶，允许2个漏切位点。半胱氨酸碘乙酰化，iTRAQ(肽段N-末端，赖氨酸，酪氨酸)为固定修饰，甲硫氨酸氧化和氨基端乙酰化为可变修饰。搜索设置肽段容差20 ppm，产生的子离子容为0.05 Da，容错率(FDR)为1%。
1.6 生物信息学分析利用t检验分析两组样本间蛋白表达的差异，筛选条件为显著性检验值P < 0.05和两组样本定量比值FC>1.20或FC < 0.83。通过对获得的差异蛋白GO分析，进行差异表达蛋白的分类注释。使用KEGG的在线工具KEGG mapper绘制注释蛋白的代谢通路。利用P值进行蛋白质功能富集，使用R语言中的pheatmap包进行差异表达蛋白的聚类分析。差异蛋白互作网络分析使用STRING(https://string-db.org/cgi/input.pl)在线软件进行。
1.7 ELISA酶联免疫吸附测定验证参照ELISA试剂盒说明书，检测FLNC、ADIPOQ、HP和TERF2蛋白的表达量。使用SPSS 21.0软件分析妊娠与非妊娠组中差异表达蛋白表达量。数据表示为“平均值±标准误”，使用t检验测试样品之间的差异。P < 0.05表示差异显著，P < 0.01表示差异极显著。
1.8 受试者工作特征曲线(ROC)分析作为ROC曲线分析的配种后15 d母猪外周血液样本采集后，分别在配种后第25和第35天对所有配种母猪进行B超检验，以确定是否妊娠。参照ELISA试剂盒说明书，检测配种后15 d母猪外周血液中FLNC、ADIPOQ、HP和TERF2蛋白的表达量，并进行受试者工作特征曲线(ROC)分析。
2 结果 2.1 去高丰度蛋白及SDS-PAGE电泳经SDS-PAGE凝胶电泳分析，凝胶图结果显示(图 1)，从血浆中获得了含量相对丰富的蛋白质，条带清晰，无拖尾现象，相对于血浆原液，蛋白样品已去除大量高峰度蛋白且无降解，满足后续蛋白质组学检测要求。总蛋白用Bradford蛋白浓度测定试剂盒分析检测发现浓度均超过7.0 μg·μL-1，能够满足后续上机的iTRAQ试验要求。
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A01、A03、A06、A12为妊娠第15天血液蛋白样本; A02、A04、A09、A10为非妊娠第15天血液蛋白样本 A01, A03, A06 and A12 are blood protein samples of pregnant on 15th day, A02, A04, A09 and A10 are blood protein samples of non-pregnant on 15th day 图 1 总蛋白SDS-PAGE凝胶电泳图 Fig. 1 SDS-PAGE electrophoretogram of total protein |
利用t检验分析两组样本间蛋白表达的差异，筛选条件为显著性检验值P < 0.05和两组样本定量比值FC>1.20或FC < 0.83。共检测到917个蛋白，差异表达蛋白24个，图 2为差异蛋白聚类图。妊娠与非妊娠相比，上调蛋白19个，下调蛋白5个(图 3)。与非妊娠组相比，妊娠组中有许多蛋白表达上调，包括雌激素受体2(ESR2)、肌动蛋白(MSC)、端粒重复结合因子2(TERF2)、结合珠蛋白(HP)、纤溶酶原(PLG)、脂联素(ADIPOQ)，以及下调的丝氨酸/苏氨酸激酶31(STK31)。表 2列出了全部24个差异表达蛋白。
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列代表不同样品，行代表不同的蛋白质ID，以表达量的log2值进行聚类，红色表示高表达蛋白质，绿色表示低表达蛋白质 The columns represent different samples, and the rows represent different proteins. The log2 value of the expression amount is used for clustering. The red represents the high expression proteins, and the green represents the low expression proteins 图 2 差异蛋白聚类热图 Fig. 2 Differential protein cluster thermogram |
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试验组(妊娠)与对照组(非妊娠)相比，上调蛋白19个，下调蛋白5个 Compared with the control group (non-pregnant), 19 proteins were up-regulated and 5 proteins were down-regulated in the experimental group (pregnant) 图 3 差异蛋白火山图 Fig. 3 Volcano plot of differential proteins |
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表 2 妊娠与非妊娠组中24个差异表达蛋白 Table 2 The 24 differentially expressed proteins in pregnancy and non pregnancy groups |
参考猪蛋白质数据库和Gene Ontology(GO)数据库注解的蛋白质功能，进行差异蛋白的功能分类(表 3)。GO注释显示，差异蛋白主要涉及了线粒体DNA代谢、端粒维持、细胞通讯、细胞生长、补体激活及天然免疫应答、细胞骨架和雌激素激活等生物学功能，这些功能与早期胚胎发育及胚胎附植存在紧密联系。
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表 3 与动物繁殖及胚胎发育相关的GO功能类别 Table 3 Functional categories of GO related to animal reproduction and embryo development |
差异蛋白KEGG富集分析结果显示，共富集到43条KEGG通路，从中筛选了16条可能与动物繁殖及胚胎发育相关的通路列于表 4，对差异表达蛋白KEGG注释结果进行分类。KEGG分析显示，差异蛋白所涉及的通路主要包括PI3K-Akt、p53、MAPK、Estrogen和mTOR等多条信号通路，这些细胞信号通路在胚胎附植期中具有关键作用。结果还显示了差异蛋白参与了造血细胞谱系和同种异体移植排斥两条信号通路。
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表 4 与动物繁殖及胚胎发育相关的信号通路 Table 4 Signaling pathways related to animal reproduction and embryo development |
为进一步验证iTRAQ检测的蛋白表达结果，本研究使用ELISA技术对以上4个蛋白的表达情况进行验证。结果表明4个蛋白在两组中的表达情况与iTRAQ检测结果一致，该结果验证了iTRAQ结果的可信度(图 4)。
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肩标小写字母不同表示差异显著(P < 0.05);肩标大写字母不同表示差异极显著(P < 0.01) The different small letter superscripts mean significant difference(P < 0.05); The different capital letter superscripts mean extremely significant difference(P < 0.01) 图 4 差异表达蛋白的ELISA验证 Fig. 4 ELISA verification of differentially expressed proteins |
蛋白质之间的相互作用构成了细胞生化反应网络的主要组成部分，蛋白互作网络对细胞及其信号的调控有重要意义。利用NCBI数据库查找差异蛋白中与早期胚胎发育、胚胎附植等生物学现象或信号通路有关的蛋白，最终选出了FLNC、ADIPOQ、HP及TERF2等4个蛋白利用STRING数据库绘制蛋白互作网络图(图 5)。
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图 5 胚胎附植相关的蛋白互作网络图 Fig. 5 Interaction network of proteins related to embryo implantation |
在PPI网络中，节点表示单个蛋白，线表示它们之间的关系。结果表明，同一个蛋白可能参与了许多不同生理过程，如MAPK通路、PI3K-Akt通路、雌激素激活等。除了APOE、F2、APOA1等节点外，PPI网络中HP、FLNC等蛋白也为主要枢纽蛋白。提示我们鉴定到的差异蛋白可能与早期胚胎附植存在紧密的联系并可能通过参与这些信号通路来影响猪早期胚胎植入，进而影响猪的繁殖。
2.7 受试者工作特征曲线(ROC)分析验证组样本经去除猪场自淘母猪及不合格样品且经2次B超复检诊断妊娠后，最终可以使用的样品数量为配种后15 d母猪21头，其中妊娠17头，未妊娠4头，剔除9头。采用以上全部合格样品猪的血液进行后续试验。根据ELISA试验结果，分别进行ROC曲线分析，并计算其AUC面积及置信度(图 6)，将差异蛋白作为生物标志物将预测结果分析(表 5)。结果显示，FLNC、ADIPOQ、HP、TERF2、FLNC-ADIPOQ及ADIPOQ-HP的AUC面积分别为0.882、0.985、0.941、1.000、1.000、1.000，且均有较高的显著性; 在真阳性率方面(妊娠母猪诊断为妊娠状态)也均有较高的准确性，分别为88.2%、94.1%、82.4%、100%、100%和100%。
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A. FLNC的ROC分析曲线; B. ADIPOQ的ROC分析曲线; C. HP的ROC分析曲线; D. TERF2的ROC分析曲线; E. FLNC-ADIPOQ的ROC分析曲线; F. ADIPOQ-HP的ROC分析曲线 A. ROC of FLNC; B. ROC of ADIPOQ; C. ROC of HP; D. ROC of TERF2;E. ROC of FLNC-ADIPOQ; F.ROC of ADIPOQ-HP 图 6 差异蛋白在配种后15 d血液中表达情况的ROC曲线分析 Fig. 6 ROC curve analysis of differential proteins expression in blood 15 days after mating |
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表 5 差异蛋白作为生物标志物预测结果分析 Table 5 Analysis of differential proteins as biomarkers for predicting results |
在生物体内，某些特定蛋白的丰度变化往往预示着该生物体相关结构和功能的转变。在蛋白质组学研究中，系统识别和蛋白质的定量显得尤为重要[16]。iTRAQ技术是新兴的蛋白质组学定量技术，在蛋白质的种类、数量和结果的可靠性及可重复性上具有优势。它特别适用于筛查血清或血浆中的生化标记[17-18]。本研究对配种后第15天妊娠与非妊娠组母猪外周血液中蛋白质的差异表达情况展开了研究，共鉴定到蛋白917个，其中24个差异表达蛋白，上调蛋白19个，下调蛋白5个。通过GO注释和KEGG分析，进一步筛选了4个与胚胎附植相关的差异蛋白——FLNC、ADIPOQ、HP和TERF2，经ELISA验证和ROC曲线分析，其可作为母猪早期妊娠诊断的潜在生物标志物。
在人类子宫内膜基质[19]和蜕膜[20]中发现了HP的表达和定位，表明其可能在着床期起作用，这可能与灵长类动物胚胎的深层间质植入有关。HP在母猪发情周期不同阶段的输卵管和子宫中存在，猪输卵管和子宫中HP蛋白的mRNA的表达在发情周期黄体晚期最为丰富，表明它在生殖过程中起重要作用。研究发现，在体外胚胎生产过程中加入结合珠蛋白可提高囊胚率[21]。妊娠第12天子宫内膜蛋白丰度研究中，HP表达量增加了10倍。这种妊娠引起的HP增加可能是由于其免疫调节和血管生成的特性[22]。此外，在包括人类、牛和狗在内的一些物种中，HP在维持、配子结合、受精和妊娠期间母体-胎儿免疫耐受的生殖过程中起着基础作用[20, 23-24]。在植入期子宫内膜中，HP蛋白mRNA特异性表达，而在发情期或假孕第4天子宫内膜中则无表达[24-25]。
女性在月经周期的分泌中期观察到较高的AdipoR1和AdipoR2基因表达，这表明胚胎植入准备过程中子宫内膜的变化可能有脂联素的参与。体外试验证明，ADIPOQ可以提高猪胚胎发育到囊胚的成功率[26]。AdipoR1和AdipoR2在人[27]和猪[28]子宫内膜中的存在及其在月经周期分泌中期的表达水平升高，首次证明ADIPOQ可能在胚胎植入中起关键作用。
还有研究指出，反复胚胎种植失败小鼠内膜脂联素受体表达显著下调，推测脂联素异常调节对胚胎着床产生影响[29]。ADIPOQ能促进子宫蜕膜组织中FOXO3蛋白表达，进而推测其影响子宫蜕膜化过程，维持妊娠早期免疫耐受[30-31]。Salker等[32]研究发现，通过抑制PI3K/Akt可以诱导子宫内膜细胞中SGK1活性增强，破坏胚胎间距和早期的胎盘-蜕膜相互作用，阻止胚胎着床。同源性磷酸酶张力蛋白(PTEN)是目前发现的PI3K/Akt中最主要的负性调节因子，PI3K/Akt的激活受体内PTEN的影响，其异常升高会抑制PI3K/Akt活性并使下游的MMP-9表达下调，使子宫内膜受滋养层细胞的侵袭力不够，影响早期胚胎发育及着床[33-34]。
本研究在妊娠母猪早期血液中检测到的相关差异蛋白表达量的变化趋势，与前人在其他物种妊娠早期子宫内膜等组织中的研究存在相似性，这也证实了本研究的可靠性。
目前，猪妊娠早期生物标志物的研究较少。Shen等[35]发现，妊娠母猪血液中差异表达mRNA(LPAR3、RXFP4、GALP、CBR1、CBR2、GPX6、USP18、LHB和NR5A1)参与母猪早期妊娠调控，并可能作为母猪早期妊娠诊断的分子标记物。本研究中的ROC曲线分析结果表明，FLNC、ADIPOQ、HP、TERF2、FLNC-ADIPOQ及ADIPOQ-HP的真阳性率(妊娠母猪诊断为妊娠状态)均有较高的准确性，分别为88.2%、94.1%、82.4%、100%、100%和100%;ADIPOQ、HP及TERF2的假阳性率(未妊娠母猪诊断为妊娠状态)为0，FLNC为25%。真阴性率(未妊娠母猪诊断为未妊娠状态)ADIPOQ、HP及TERF2均达到100%，FLNC为75%。而假阴性率(妊娠母猪诊断为未妊娠状态)TERF2为0，ADIPOQ为5.9%，FLNC为11.8%，HP为17.6%。FLNC、ADIPOQ、HP、TERF2、FLNC-ADIPOQ及ADIPOQ-HP在诊断母猪妊娠状态的准确率分别为85.71%、95.24%、85.71%、100%、100%和100%。这表明，配种后15 d妊娠与未妊娠母猪外周血液中差异蛋白FLNC、ADIPOQ、HP及TERF2适合作为猪早期妊娠诊断的潜在生物标志物。
4 结论本研究利用iTRAQ技术筛选配种后15 d妊娠与非妊娠母猪外周血液中的蛋白，发现24个蛋白存在差异表达(P < 0.05)，其中存在4个与胚胎附植相关的差异表达蛋白(FLNC、ADIPOQ、HP和TERF2)。ROC曲线分析结果也进一步表明，配种后15 d母猪外周血液中的差异表达蛋白FLNC、ADIPOQ、HP和TERF2可作为母猪早期妊娠的潜在生物标志物，为母猪胚胎附植机制研究提供了新的思路。
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(编辑 郭云雁)