2. 农业农村部种养结合重点实验室，南京 210014;
3. 江苏省农业科学院宿迁农科所，宿迁 223800;
4. 中国农业科学院深圳农业基因组研究所，深圳 518124
, WANG Huili1,2, CAO Shaoxian1,2, GUO Rihong1,2, WANG Zeping1,3, CHEN Zhe1,2, XU Kui4, FU Yanfeng1,2, LI Bixia1,2, REN Shouwen1,2, CHENG Jinhua1,2
2. Key Laboratory for Crop and Animal Integrated Farming of Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Nanjing 210014, China;
3. Suqian Institute of Agricultural Sciences, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Suqian 223800, China;
4. Agricultural Genomics Institute at Shenzhen, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Shenzhen 518124, China
CRISPR/Cas9系统是细菌为抵御病毒入侵所进化的一种适应性免疫系统[1-3]。该系统利用gRNA识别并引导核酸酶Cas9对靶DNA进行切割，诱发DNA的非同源重组(NHEJ)或同源重组(HDR)损伤修复机制，从而实现对靶基因序列的编辑[4-6]。CRISPR/Cas9系统自开发以来已被广泛用于疾病治疗、基因功能研究与新品种培育[7-11]。
CRISPR/Cas9系统诱导DNA双链断裂后，细胞内倾向于利用非同源重组方式修复[12]，这种修复方式随机性强，插入或删除的碱基数难以控制, 有时无法对目的基因产生敲除效果，从而导致筛选有效的突变体耗时耗力。单碱基编辑技术(base editor) 是基于CRISPR系统的新型靶基因定点修饰技术，在不产生DNA双链断裂的情况下，利用胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶对靶位点进行精准的单碱基编辑，实现C-T或A-G的替换，从而开发了CBE和ABE系统[12-13]，自2016年报道以来受到了广泛的关注。CRISPR/Cas9系统在制备动物疾病模型和治疗单碱基遗传疾病的潜力成为了研究热点。然而后续许多研究表明，胞嘧啶单碱基编辑器存在严重的DNA脱靶[14-15]，胞嘧啶单碱基编辑器和腺嘌呤单碱基编辑器还存在着大量的RNA脱靶效应[16-17]，使单碱基编辑工具的安全性受到了质疑，限制了单碱基编辑系统在动植物中的精准和多样化突变的应用。Zuo等[18]通过突变APOBEC1上的ssDNA结构域相应氨基酸，得到了显著降低DNA脱靶的CBE突变体YE1-BE3-FNLS工具。优化后的YE1-BE3-FNLS在保证高保真的情况下，显著提高了基因编辑效率，从而成为既安全又高效的新单碱基基因编辑工具。Doman等[19]也报道了YE1-CBE系统在保持较高编辑效率的同时降低了DNA和RNA上的脱靶。
猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)俗称蓝耳病，是一种世界性传染病，也是严重危害我国生猪产业的高度烈性传染病，给养猪业造成巨大的经济损失[20]。研究表明，CD163基因是蓝耳病毒侵入细胞的重要受体[21-24]，通过敲除CD163基因或功能域能有效的抵御蓝耳病毒的感染[25-29]。
本研究通过YE1-BE3-FNLS系统对猪CD163基因进行单碱基编辑，通过C>T，在其第七外显子将其中一个密码子CAA改变为终止密码子TAA，可实现该基因翻译的提前终止，为后续制备安全有效的CD163基因敲除猪提供了技术支撑。
1 材料与方法 1.1 细胞、菌株与质粒PX330载体由农业农村部种养结合重点实验室保存；YE1-BE3-FNLS载体由中国农业科学院深圳农业基因组研究所左二伟研究员赠予。
1.2 主要试剂MEGAshortscriptTM T7 Transcription Kit、mMESSAGE mMACHINETM T7 ULTRA Transcription Kit、MEGAclearTM Transcription Clean-Up Kit、TCM-199和EGF购于Thermo fisher公司；REPLI-g single cell kit购于Qiagen公司；化学试剂购于Sigma公司。DNA marker、DNA聚合酶PrimerSTAR Max Premix、购于TaKaRa公司；DNA纯化回收试剂盒购于Zymo Research公司；引物合成与测序验证由北京擎科公司完成。
1.3 CD163基因的sgRNA设计使用在线软件(http://chopchop.cbu.uib.no/)设计CD163基因(XM_021091120.1)的sgRNA靶标位点[30]。首先考虑Efficiency>50% 的sgRNA，然后是Off-targets指标，选取的sgRNA序列位点尽量没有Off-targets所述的0、1、2、3错配类型；综合Self-complementarity和GC含量筛选CD163基因的候选sgRNA序列。在候选sgRNA的基础上，进一步采取以下规则：由于YE1-BE3-FNLS载体的单碱基编辑窗口较短(C5-C6)，因此设计的sgRNA的第5或第6位碱基为C，并且C5或C6后续的两个碱基为GA、AG或AA，而且CGA、CAG、CAA与起始密码子ATG之间的碱基数为3的整数倍。
1.4 CD163基因的sgRNA与YE1-BE3-FNLS载体的扩增与体外转录以PX330载体为模板，在设计的CD163-sgRNA的正向引物引入T7 promoter引物(加粗碱基)和sgRNA序列(下划线碱基)，正向引物序列F: TAATACGACTCACTATAGGGAGTACA ACATGG-AGACACGTGTTTTAGA GCTAGAAATAG，反向引物R: AAAAGCACCGACTCGGTGCC。以YE1-BE3-FNLS载体为模板，扩增APOBEC-Cas9n-UGI，正向引物F: TAATACGACTCACTATAGGGGATCC; 反向引物R: TCGAGGCTGATCAGCGGGTTTTTA。PCR扩增体系：mix 10 μL，F引物0.5 μL，R引物0.5 μL，DNA 1 μL，ddH2O补至20 μL；扩增条件：94 ℃预变性1 min；98 ℃变性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸25 s，33个循环；72 ℃延伸1 min。
对CD163-sgRNA和APOBEC-Cas9n-UGI片段进行回收纯化，进行体外转录。CD163-sgRNA利用MEGAshortscriptTM T7 Transcription Kit进行体外转录，方法参考试剂盒说明书。APOBEC-Cas9n-UGI片段利用mMESSAGE mMACHINETM T7 ULTRA Transcription Kit进行体外转录，方法参考试剂盒说明书。转录后的RNA纯化参考MEGAclearTM Transcription Clean-Up Kit。对体外转录纯化后的CD163-sgRNA和APOBEC-Cas9(D10A)-UGI mRNA进行混合，使两者终浓度分别为50和100 ng·μL-1。
1.5 卵母细胞体外成熟培养屠宰场收集猪卵巢后3 h内运回实验室，生理盐水充分洗涤后，注射器抽取3~6 mm卵泡，体视镜下挑选卵丘致密、胞质均匀的卵丘细胞-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes，COCs)。将挑选的COCs置于卵母细胞体外成熟液中(TCM-199培养基含10% porcine follicular fluid, 0.1% PVA, 3.05 mmol·L-1 D-glucose, 0.91 mmol·L-1 sodium pyruvate, 0.5 IU·mL-1 FSH, 0.5 IU·mL-1 LH, 10 ng·mL-1 EGF和0.57 mmol·L-1 cysteine)，在38.5 ℃，5% CO2，饱和湿度的培养箱中培养44~48 h，培养结束后将COCs转移到0.1%透明质酸酶中脱去卵丘细胞，挑选排出第一极体、质膜完整的MII期卵母细胞备用。
1.6 卵母细胞孤雌激活与体外注射将上述MII期卵母细胞用激活液(0.3 mol·L-1 mannitol, 0.05 mmol·L-1 CaCl2, 0.1 mmol·L-1 MgSO4, 0.1% BSA)充分洗涤后，置于注满激活液的电融合槽内，利用ECM2001融合仪施加1.2 kv·cm-1，40 us的直流电脉冲进行孤雌激活，经PZM3胚胎培养液充分洗涤后，放入含5 μg·mL-1 CB的PZM3培养液中继续培养3 h，再经充分洗涤并转入石蜡油覆盖的PZM3中于38.5 ℃, 5% CO2，饱和湿度的培养箱中培养10~12 h后，利用Nikon NT88-V3显微注射系统进行显微注射。
1.7 单碱基编辑验证与off-target分析利用REPLI-g single cell kit提取扩增单个胚胎的基因组DNA。在酒精灯上拉细毛细管后吸取单个胚胎置于0.2 mL离心管，加入PBS和D2 buffer，65 ℃裂解10 min，加入stop buffer，最后加入预混的master mix，30 ℃ 8 h，65 ℃3 min。结束后用TE buffer稀释10倍。对单碱基编辑区域进行PCR扩增，引物为F: TCTGGTGTGCCTTTGACTCC; R: CCAGTGAGAGTTGCAGAGGG, 预期扩增产物大小为865 bp。PCR扩增体系：mix 10 μL，F引物0.5 μL，R引物0.5 μL，DNA 1 μL，ddH2O补至20 μL；扩增条件：94 ℃预变性1 min；98 ℃变性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，33个循环；72 ℃延伸1 min。PCR产物扩增后进行回收纯化，送北京擎科公司进行sanger测序。off-target分析所用引物见表 1。
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表 1 Off-target分析所用引物 Table 1 Primers used in off-target analysis |
CD163基因位于5号染色体的正义链，有17个外显子。网站结果显示共有423个sgRNA针对CD163基因的外显子。在综合分析Efficiency(>50%)、Off-targets指标(MM0、MM1、MM2值为0)、Self-complementarity(0)和GC含量(40%~60%)后发现，候选CD163-sgRNA共有49个。由于YE1-BE3-FNLS载体的单碱基编辑窗口较短(C5-C6)，因此对候选sgRNA的第5或第6位碱基要求为C，并且C5或C6后续的两个碱基为GA、AG或AA，而且CGA、CAG、CAA与起始密码子ATG之间的碱基数为3的整数倍。考虑到尽量在基因的前中部进行单碱基编辑，综合这些因素最终筛选的CD163-sgRNA序列为：AGTACAACATGGAGACACGT，PAM为GGG。此sgRNA的第5位碱基为C，其后续两个碱基为AA，位于CD163基因的第7外显子(num1479，图 1)。并且在CD163的mRNA序列中，CD163-sgRNA序列中的CAA与起始密码子ATG之间碱基数为1 479，为3的整数倍。当发生C>T突变时，密码子发生了CAA>TAA突变，形成终止密码子，可使CD163基因在第7外显子处提前终止翻译。CD163-sgRNA的特征如表 2所示，符合预期要求。
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图 1 CD163-sgRNA序列的位置示意图 Fig. 1 Schematic diagram of the sgRNA location in the CD163 gene |
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表 2 CD163-sgRNA序列特征 Table 2 Sequence characteristics of CD163-sgRNA |
如图 2显示，分别以PX330和YE1-BE3-NLS载体为模板，PCR扩增的CD163-sgRNA和APOBEC-Cas9(D10A)-UGI片段大小与预期相符合。
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A: M. DNA相对分子质量标准；1. CD163-sgRNA扩增产物；B: M. DNA相对分子质量标准；1. APOBEC-Cas9n-UGI扩增产物 A: M. DNA marker; 1. Amplification product of CD163-sgRNA; B: M. DNA marker; 1. Amplification product of APOBEC-Cas9n-UGI 图 2 CD163-sgRNA和APOBEC-Cas9n-UGI的PCR扩增 Fig. 2 CD163-sgRNA and APOBEC-Cas9n-UGI amplification by PCR |
利用显微操作仪对激活的猪孤雌胚胎进行CD163-sgRNA和APOBEC-Cas9n-UGI mRNA的显微注射，每个胚胎注射10~20 pL后继续培养。图 3为注射后2~4细胞期的猪孤雌胚胎。
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图 3 猪孤雌胚胎注射RNA混合物的2~4细胞期 Fig. 3 2-4 cell stage of porcine parthenogenetic embryos injected with RNA mixture |
挑选单个发育至桑椹胚或囊胚的胚胎，利用单细胞全基因组扩增试剂盒REPLI-g single cell kit对胚胎进行基因组DNA的提取与扩增。经过8 h扩增后，单个胚胎的DNA浓度为1.7~1.8 μg·μL-1，满足后续PCR扩增要求。分别对对照组和注射组的胚胎DNA进行编辑区域的PCR扩增，产物测序的序列分析发现对照组的预期位点为C(图 4A)，注射组的20个胚胎中有8个胚胎的DNA在预期位点(num 1479)出现C>T突变(图 4B)。而进一步分析发现有额外4个胚胎的DNA在预期位点中虽然序列显示为C，但峰图结果显示该位点出现C与T碱基的杂峰，表明该位点被成功编辑(图 4C-D)。综合分析在挑选的20个胚胎中有12个的DNA在预期位点出现C>T突变，单碱基编辑效率约60%。
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A.对照组预期位点为C的峰图；B.试验组预期位点为T的峰图; C.试验组预期位点为C的一种峰图; D.试验组预期位点为C的另一种峰图 A. Peak map of the expected site C of the control group; B. Peak map of the expected site T of the experimental group; C. Peak map of the expected site C of the experimental group; D. Another peak map of the expected site C of the experimental group 图 4 CD163基因第7外显子预期位点的单碱基编辑 Fig. 4 Base editing of the expected site in exon 7 of CD163 gene |
由于选取的CD163-sgRNA在错配3个碱基的情况下能匹配到猪基因组的5个位置，利用Cas-OFFinder对这5个错配的位置进行序列分析。表 3显示了这5个off-target的基因组位置，4个位于1号染色体，1个位于4号染色体，这5个off-target在基因组中相应的错配位点分别用小写字母表示，如表 3的第3列。Off-target1在C9、C11、C15三个位点有错配；Off-target2在C13、C14、C18三个位点有错配；Off-target3在C4、C14、C19三个位点有错配；Off-target4在C3、C11、C18三个位点有错配；Off-target5在C2、C13、C14三个位点有错配。这5个off-target区域在C5位点都是C，因此对这5个off-target区域进行PCR扩增，测序结果的峰图显示选取的CD163-sgRNA在这5个off-target位置上的C5位点并没有发生C>T单碱基编辑(图 5)。
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表 3 CD163-sgRNA的off-target位点 Table 3 The off-target position of CD163-sgRNA |
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图 5 对照组(A)与注射组(B)CD163-sgRNA的off-target位点测序分析 Fig. 5 The sequencing analysis of off-target position of CD163-sgRNA between control group(A)and injection group(B) |
猪是最重要的家畜动物之一，在农业生产和生物医药中具有重要的应用价值。单核苷酸多态性(SNPs)是猪品种和个体间遗传变异的一种主要类型，对性状的形成起着重要作用[31]，对重要的功能性SNP位点进行预期突变可加速猪的育种进程，然而CRISPR/Cas9系统诱发的同源重组的损伤修复存在效率低以及细胞内倾向于非同源重组修复[12]，因此很难实现高效稳定的单碱基突变。单碱基编辑器作为新一代基因编辑工具，可为猪的精准遗传改良提供一种可行的解决方案。
YE1-BE3-FNLS作为新一代的高精度、高活性的单碱基编辑工具，可显著降低脱靶效应和提高编辑效率[18]，具有广阔的应用前景。但是该工具的编辑窗口较短C5-C6，而且胞嘧啶脱氨酶rAPOBEC1对GC motif中胞嘧啶的编辑效率不高[32]，因此在设计sgRNA的时候需要进行大量的筛选，如果是利用sgRNA创造终止密码子，很有可能筛选不到好的sgRNA。本研究中针对CD163初筛了49个参数较好的候选sgRNA，但是最终确定的CD163-sgRNA只有1个，因此与传统的CRISPR/Cas9系统相比，单碱基编辑工具sgRNA的筛选与鉴定要显得更为繁琐。
由于sgRNA本身较短，长度在20 bp左右，因此在基因组上容易匹配到多个位置，从而造成脱靶效应[33]。本研究选取的sgRNA序列位点的off-targets所述的0、1、2、3错配类型为(0, 0, 0, 5)，而0、1、2、3分别代表在基因组上错配0~3个碱基数量的sgRNA个数，本研究中的CD163-sgRNA在错配0、1和2个碱基情况下没有off-target，而在错配3个碱基下的5个off-target位点都没有发生碱基突变，因此表明该CD163-sgRNA在基因组上高度特异。
研究表明，CD163基因不仅可作为PRRSV的受体，还参与清除血浆中的血红蛋白等生物过程[34]。因此，CD163基因功能的丧失可能存在未知的风险。然而有研究表明与野生型相比，CD163基因敲除猪在经济性状(例如产肉与繁殖性状以及免疫性状例如巨噬细胞作为血红蛋白-结合珠蛋白清除剂)的表型都没有发生显著变化[27, 35]，因而CD163敲除猪的安全性还需要进一步持续研究。
目前，已有多个团队利用CRISPR/Cas9技术制备了CD163敲除猪，其方式是通过CRISPR/Cas9介导的同源重组(HDR)或DNA片段删除[25-26]，这两种方式的效率较低，而且对于DNA片段删除需要借助2条sgRNA，额外增加了可能的脱靶性。而且DNA片段删除的方式也容易额外插入碱基序列，不易获得纯合的CD163敲除猪[26]。
姚旭东等[36]利用单碱基编辑系统对羊MSTN基因进行了精准编辑，表明单碱基编辑系统具有较好的特异性。本研究中的单碱基编辑效率较高，达到了60%，而且造成的碱基突变类型单一，容易得到纯合突变，为后续精准制备CD163基因敲除猪提供了技术支撑。
4 结论本研究利用YE1-BE3-FNLS工具在胚胎水平上对猪的CD163基因进行了单碱基编辑，成功使得该基因第7外显子预期位点(num1479)C突变为T，从而使得密码子CAA突变为TAA，可提前终止CD163基因的翻译。
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(编辑 郭云雁)