畜牧兽医学报  2022, Vol. 53 Issue (3): 978-982. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2022.03.031    PDF    
引用本文
于永乐, 姚延珠, 韩先杰, 张传美, 秦志华, 杨瑞梅, 张洪亮, 刘维全, 单虎. 犬源牛犬细小病毒和犬圆环病毒二联PCR检测方法的建立及应用[J]. 畜牧兽医学报, 2022, 53(3): 978-982.  
YU Yongle, YAO Yanzhu, HAN Xianjie, ZHANG Chuanmei, QIN Zhihua, YANG Ruimei, ZHANG Hongliang, LIU Weiquan, SHAN Hu. Establishment of Duplex PCR Detective Techniques for Canine Bocavirus and Canine Circovirus[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2022, 53(3): 978-982.  
犬源牛犬细小病毒和犬圆环病毒二联PCR检测方法的建立及应用
于永乐1, 姚延珠2, 韩先杰1, 张传美1, 秦志华1, 杨瑞梅1, 张洪亮1, 刘维全3, 单虎1     
1. 青岛农业大学动物医学院 山东省预防兽医学重点实验室，青岛 266109;
2. 青岛农业大学植物医学学院，青岛 266109;
3. 中国农业大学生物学院 农业生物技术国家重点实验室，北京 100193
收稿日期：2021-05-25
基金项目：在青高校服务青岛重点学科(兽医学)(025/1119002)；“十三五”国家重点研发计划资助项目(2016YFD0501001；2016YFD0501004)；青岛农业大学高层次人才科研基金(1120015/663)
作者简介：于永乐(1988-)，男，博士，主要从事动物病毒学研究，E-mail: 1511832711@qq.com; 姚延珠(1987-)，女，博士，主要从事细胞生物学研究，E-mail: yzyao2011@163.com.
于永乐和姚延珠为同等贡献作者
通信作者：刘维全，主要从事动物病毒学研究，E-mail: weiquan8@126.com; 单虎，主要从事动物传染病学研究，E-mail: shanhu67@163.com.
摘要：本研究旨在建立可同时检测犬源牛犬细小病毒(CBoV)和犬圆环病毒(CCV)的二联PCR检测方法，并对两种病毒病当前的流行情况进行监测和调查。分别将已发表的CBoV和CCV基因组序列进行同源性比对，选择高同源区段，应用Primer Primier 5计算机软件设计并合成了2对特异性扩增引物，目的片段大小分别为170 bp (CBoV)和239 bp (CCV)。分别提取CBoV和CCV重组质粒作为模板，进行二联PCR扩增试验。结果表明，本研究成功建立了可同时检测CBoV和CCV的二联PCR检测方法。并对其重复性、特异性和灵敏度进行验证，二联PCR最低检测限度为3.0 pg总DNA，而对犬细小病毒2型、犬瘟热病毒和犬副流感病毒的PCR检测结果均为阴性。对送检的30份病料进行检测，其中，4份为CBoV阳性，3份为CCV阳性，未检测到混合感染。综上所述，本研究所建立的CBoV和CCV二联PCR诊断方法特异性高，敏感性好，可用于临床犬腹泻病的流行病学调查。
关键词：犬源牛犬细小病毒    犬圆环病毒    二联PCR    
Establishment of Duplex PCR Detective Techniques for Canine Bocavirus and Canine Circovirus
YU Yongle1, YAO Yanzhu2, HAN Xianjie1, ZHANG Chuanmei1, QIN Zhihua1, YANG Ruimei1, ZHANG Hongliang1, LIU Weiquan3, SHAN Hu1     
1. College of Veterinary Medicine, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China;
2. College of Plant Health and Medicine, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China;
3. State Key Laboratory of Agrobiotechnology, Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Biological Sciences, China Agricultural University, Beijing 100193, China
Corresponding author: LIU Weiquan, E-mail: weiquan8@126.com; SHAN Hu, E-mail: shanhu67@163.com.
Abstract: This study was conducted to develop the duplex PCR assay for detection simultaneously and discrimination of canine bocavirus (CBoV) and canine circovirus (CCV). The published gene sequences of CBoV and CCV in GenBank were analyzed and compared with each other, respectively. Two pairs of specific primers were designed with the Primer Primier 5 software for PCR amplification. The results showed that two specific fragments of the two viruses were simultaneously amplified and the length of amplified fragments were as follows: 170 bp for CBoV and 239 bp for CCV. The sensitivity and specificity tests showed that the assay could detect at least 3.0 pg of target DNA, and there was no cross-reaction with those clinically relevant pathogens, ie. canine parvovirus type 2, canine distemper virus and canine parainfluenza virus. The detection results for 30 clinical samples with the duplex PCR showed that 4 samples were positive for CBoV and 3 for CCV. These results indicated that the method could provide technical support for the detection of CBoV and CCV, and epidemiological investigation of canine viral diarrhea.
Key words: canine bocavirus    canine circovirus    duplex PCR    

犬源牛犬细小病毒(canine bocavirus, CBoV)属于细小病毒科(Parvoviridae)、细小病毒亚科(Parvovirinae)、牛犬细小病毒属(Bocaparvovirus)的成员，为单链线状DNA病毒，CBoV的基因组大小约为5.4 kb，在结构蛋白和非结构蛋白编码区之外存在第三个开放阅读框，编码NP蛋白[1-3]。目前，已经发现3种不同亚型的犬源牛犬细小病毒，即CBoV-1、CBoV-2和CBoV-3[4-7]。

犬圆环病毒(canine circovirus, CCV)属于圆环病毒科(Circoviridae)、圆环病毒属(Circovirus)的成员，基因组为环状单链DNA，包含两个大的开放阅读框，其中，一个编码Rep蛋白，另一个编码Cap蛋白[8]。CCV往往导致肠炎、肺炎、坏死性血管炎等相关疾病，但是在健康犬的粪便中也发现了该病毒的存在，因此，迄今为止，对于CCV的致病机制尚不清楚[9]。

CBoV和CCV均可以导致犬腹泻相关疾病，在我国已有多篇报道，但能同时检测上述两种病原的多重PCR检测方法尚未见报道。本研究成功建立了可同时检测CBoV和CCV的二联PCR诊断方法，并对山东地区送检的病料进行了实际验证，证实了该方法的可靠性，可用于临床样品的快速筛查。

1 材料与方法 1.1 标准毒株及质粒

犬细小病毒2a亚型(canine parvovirus type 2a, CPV2a)CPV-QN5株、犬瘟热病毒(canine distemper virus, CDV)CDV-QN1株及犬副流感病毒(canine parainfluenza virus, CPIV) CPIV-QN1株均由本实验室分离、保存。

质粒：pMD-CBoV-NS1和pMD-CCV-Rep均由本实验室构建、保存，将质粒浓度调整为30 ng·μL－1。

1.2 临床病料

送检的病料来自山东某地养殖场发病犬肛拭子，共计30份。按照1∶9的比例加入灭菌PBS缓冲液充分振荡溶解，5 000 r·min－1离心5 min，取上清液保存备用。

1.3 主要试剂

D1000 plus DNA Ladder、2×primeSTAR Max Premix购自北京宝生物(TaKaRa)工程有限公司；QIAEX Ⅱ胶回收试剂盒购自上海玉博生物科技公司；质粒小量快速提取试剂盒购自艾德莱生物科技有限公司。

1.4 二联PCR引物设计与合成

根据GenBank中CBoV NS1基因和CCV Rep基因序列，利用Primer Primier 5软件，设计两对二联PCR引物，引物由青岛志远生物工程有限公司合成，引物序列：CBoV-P1(5′-GTGATGGGCGGTGACGGCTTGA-3′)，CBoV-P2：(5′-CTGGTAGA-CGCAGCCGATGAGA-3′)；CCV-P3(5′-GAAAA-TGGTGGGACGGTTACGAT-3′)，CCV-P4(5′-CAAAGTGAGACGCCGATAGAGGG-3′)；上述引物预期扩增目的片段大小分别为170 (CBoV)和239 bp(CCV)。

1.5 病料DNA模板制备

分别将CBoV和CCV的临床病料300 μL置于离心管中，沸水浴10 min后，迅速冰浴2 min，然后用微量离心机于室温以8 500 r·min－1离心6 min，吸取上清液用于后续PCR反应。

1.6 二联PCR扩增方法的建立及优化

所有PCR反应总体积为25 μL, 其中，2×primeSTAR Max Premix 12.5 μL，不同引物终浓度(0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 μmol·L－1)，质粒模板1 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR条件为98 ℃预变性5 min；98 ℃变性10 s，不同退火温度(52、54、56、58、60 ℃)退火10 s，72 ℃延伸10 s，30个循环；72 ℃延伸1 min。取6 μL PCR扩增产物在2.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳，观察并照相，确定其最适引物浓度和退火温度，并对所有扩增产物进行胶回收，目的片段送公司测序验证。

1.7 二联PCR扩增试验

在二联PCR反应体系中，各病毒引物终浓度：CBoV 0.10 μmol·L－1、CCV 0.20 μmol·L－1。二联PCR反应退火温度确定为58 ℃，其他条件与“1.6”一致，分别对上述质粒模板进行检测。

1.8 二联PCR重复性、特异性和敏感性试验

按照“1.7”的方法，进行二联PCR重复性和特异性检测。将CBoV与CCV质粒的10－1、10－2、10－3、10－4、10－5和10－6倍稀释度的DNA模板组合，进行二联PCR灵敏度检测。

1.9 二联PCR对送检病料的检测

以已建立的二联PCR对送检的30份病料进行检测，并与单项PCR检测结果进行比较分析。

2 结果 2.1 二联PCR扩增试验

由图 1可知，应用优化后的最佳反应体系和条件，二联PCR一次性成功扩增出170 bp (CBoV)和239 bp (CCV)的2条目的条带(图 1)，经测序证实，所有扩增的片段与CBoV和CCV相应基因序列高度一致。

图 1 二联PCR扩增结果 Fig. 1 Duplex-PCR results of CBoV and CCV
2.2 二联PCR重复性、特异性和灵敏度

由图 2A可知，二联PCR重复3次均可以获得一致的扩增结果，而且与犬相关的3种病毒——CPV-2、CDV和CPIV检测结果均为阴性，证明该方法具有很高的特异性(图 2B)；灵敏度试验结果显示，二联PCR至少可检出约3.0 pg DNA(图 2C)。

A~C.重复性、特异性和灵敏度试验结果；M. DNA相对分子质量标准；ddH2O. 阴性对照；10－1~10－6. 稀释度 A-C. Repeatability test, specificity test and sensitivity test, respectively; M. DNA marker; ddH2O. Negative control; 10－1-10－6. Dilution 图 2 二联PCR重复性、特异性和灵敏度检测结果 Fig. 2 Repeatability, specificity and sensitivity test of duplex-PCR
2.3 二联PCR对临床病料的检测

在30份送检样品中，应用二联PCR方法进行检测，结果如图 3所示，其中，CBoV阳性4份，CCV阳性3份。与单项PCR检测结果完全一致(图 3)。

M. DNA相对分子质量标准；1~30.样品；ddH2O. 阴性对照；P. 阳性对照 M. DNA marker; 1-30. Samples; ddH2O. Negative control; P. Positive control 图 3 二联PCR对病料的检测结果 Fig. 3 Duplex-PCR results of CBoV-CCV in samples
3 讨论

CBoV和CCV是导致犬腹泻病的两种重要病原体，在我国已有多篇报道，但目前对于两种病毒的致病机制及流行情况尚不清楚，因此建立快速诊断方法，加强对两种新发病原的检测十分必要。陈意伟等[10]于2016年首先建立了CBoV的PCR检测方法，曹亮等[11]于2017年建立了可同时检测犬圆环病毒和犬细小病毒的双重PCR检测方法，以上研究对两种病毒的流行情况均进行了详细的描述。Niu(牛江婷)等[12]报道在1只猫粪便中检测到CBoV的核酸，经比对分析发现猫源CBoV与犬源CBoV具有相同的基因结构，提示CBoV已经具有了跨物种传播的能力，因此，加强对CBoV的流行病学监测十分必要。而且近年来CCV感染的报道也逐渐增多，从重庆[13]到黑龙江[14]均有不同程度病例出现，可见CCV流行范围较广。此外，一种新发病原猪圆环病毒3型(porcine circovirus 3，PCV 3)在犬的腹泻及血清样本中检到[15]，提示在对犬临床样本检测过程中，也要增加对PCV 3等跨宿主感染和传播的病原进行检测，才能获得更加准确的研究结果。

随着CBoV与CCV感染的病例不断出现[7]，迫切需要更加快速、简便的检测方法用于临床实际，而且国内尚未有CBoV和CCV二联PCR检测方法的报道，限制了对两种新发犬腹泻病的流行情况的监测。本研究在前人研究的基础上，通过多重序列比对、反应体系及条件优化，经反复试验后建立了更加简便快捷的双重PCR方法，其操作简单，灵敏度更高，可完全满足临床检测要求。

4 结论

成功建立了可同时检测犬源牛犬细小病毒(CBoV)和犬圆环病毒(CCV)的二联PCR检测方法，方法的最低检测限度为3.0 pg总DNA，对犬细小病毒2型、犬瘟热病毒和犬副流感病毒的检测结果均为阴性。临床样品检测显示，可用于临床犬腹泻病的流行病学调查。

参考文献
[1]
BROWN K E. The expanding range of parvoviruses which infect humans[J]. Rev Med Virol, 2010, 20(4): 231-244. DOI:10.1002/rmv.648
[2]
COTMORE S F, AGBANDJE-MCKENNA M, CHIORINI J A, et al. The family Parvoviridae[J]. Arch Virol, 2014, 159(5): 1239-1247. DOI:10.1007/s00705-013-1914-1
[3]
MOCHIZUKI M, HASHIMOTO M, HAJIMA T, et al. Virologic and serologic identification of minute virus of canines (canine parvovirus type 1) from dogs in Japan[J]. J Clin Microbiol, 2002, 40(11): 3993-3998. DOI:10.1128/JCM.40.11.3993-3998.2002
[4]
BINN L N, LAZAR E C, EDDY G A, et al. Recovery and characterization of a minute virus of canines[J]. Infect Immun, 1970, 1(5): 503-508. DOI:10.1128/iai.1.5.503-508.1970
[5]
SCHWARTZ D, GREEN B, CARMICHAEL L E, et al. The canine minute virus (minute virus of canines) is a distinct parvovirus that is most similar to bovine parvovirus[J]. Virology, 2002, 302(2): 219-223. DOI:10.1006/viro.2002.1674
[6]
KAPOOR A, MEHTA N, DUBOVI E J, et al. Characterization of novel canine bocaviruses and their association with respiratory disease[J]. J Gen Virol, 2012, 93(2): 341-346. DOI:10.1099/vir.0.036624-0
[7]
LI L L, PESAVENTO P A, LEUTENEGGER C M, et al. A novel bocavirus in canine liver[J]. Virol J, 2013, 10(1): 54. DOI:10.1186/1743-422X-10-54
[8]
BREITBART M, DELWART E, ROSARIO K, et al. ICTV virus taxonomy profile: Circoviridae[J]. J Gen Virol, 2017, 98(8): 1997-1998. DOI:10.1099/jgv.0.000871
[9]
LI L L, MCGRAW S, ZHU K, et al. Circovirus in tissues of dogs with vasculitis and hemorrhage[J]. Emerg Infect Dis, 2013, 19(4): 534-541. DOI:10.3201/eid1904.121390
[10]
陈意伟, 温肖会, 朱学良, 等. 犬博卡病毒PCR检测方法的建立及其应用[J]. 安徽农业科学, 2016, 44(10): 148-149, 285.
CHEN Y W, WEN X H, ZHU X L, et al. Establishment and application of a PCR detection method for canine bocavirus[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2016, 44(10): 148-149, 285. (in Chinese)
[11]
曹亮, 孙文超, 鲁会军, 等. 犬圆环病毒及犬细小病毒双重PCR检测方法的建立[J]. 中国兽医科学, 2017, 47(9): 1140-1144.
CAO L, SUN W C, LU H J, et al. Establishment of duplex PCR for the detection of canine circovirus and canine parvovirus[J]. Chinese Veterinary Science, 2017, 47(9): 1140-1144. (in Chinese)
[12]
NIU J T, YI S S, WANG H L, et al. Complete genome sequence analysis of canine bocavirus 1 identified for the first time in domestic cats[J]. Arch Virol, 2019, 164(2): 601-605. DOI:10.1007/s00705-018-4096-z
[13]
闫修魁, 韩知晓, 杜倩, 等. 重庆地区犬圆环病毒检测及序列分析[J]. 中国畜牧兽医, 2020, 47(10): 3069-3077.
YAN X K, HAN Z X, DU Q, et al. Detection and sequence analysis of canine circovirus in Chongqing[J]. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2020, 47(10): 3069-3077. (in Chinese)
[14]
NIU L D, WANG Z, ZHAO L L, et al. Detection and molecular characterization of canine circovirus circulating in northeastern China during 2014-2016[J]. Arch Virol, 2020, 165(1): 137-143. DOI:10.1007/s00705-019-04433-4
[15]
张丽丽, 张志, 刘爽, 等. 犬的病料中检测到猪圆环病毒3型[J]. 中国兽医学报, 2019, 39(4): 631-634, 654.
ZHANG L L, ZHANG Z, LIU S, et al. Molecular detection of novel virus of porcine circovirus 3 in canine samples[J]. Chinese Journal of Veterinary Science, 2019, 39(4): 631-634, 654. (in Chinese)

(编辑   白永平)