丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)，是黄病毒科(Flaviviridae)、丙型肝炎病毒属(Hepacivirus)的成员，是人患肝炎、肝硬化和肝癌的主要原因之一[1]。HCV慢性感染是一个全球性的健康问题。据估计，全球超过1.84亿人感染HCV[2]，每年有300万~400万新感染病例。丙型肝炎病毒不仅存在于人类，也存在各种动物中，包括马[3-4]、啮齿动物[5]、蝙蝠[6]和非人类灵长类动物[7]。2015年，Baechlein等[8]首次发现HCV可以感染牛，并证实了该病毒为丙型肝炎病毒属的一个新种——丙型肝炎病毒N(Hepacivirus N，HNV)。因为牛是其特异性宿主，故HNV又被称为牛丙型肝炎病毒(BovHepV)[2]。截至2020年，BovHepV共分为7个亚型(A~G型)，我国主要流行E和G型[9]。HNV具有强嗜肝性，主要造成牛无症状持续性感染，感染时间可长达13个月[10]。
HNV在(我国)牛群中普遍存在，但HNV的检测方法尚未见报道。在之前的研究中发现，当使用血清学检测方法时，黄病毒科的病毒间普遍存在交叉反应现象，因此血清学检测方法可能不适用于HNV的临床快速诊断。PCR技术已成为多种病毒早期临床检测的金标准，而巢式PCR是PCR的优化方法，具有敏感性高、特异性强，重复性好的特点。因此，建立HNV病毒的巢式PCR检测方法，可有助于HNV病毒在临床上的快速诊断。
本实验室前期对采集自牛体表的蜱进行了宏转录组高通量测序，经试验获取到1株病毒全基因组，基于保守基因NS3、NS5B构建系统发育树，发现其为HNV新亚型，命名为BovHepV-GDZJ(GenBank登录号MZ221927)。为了更好地鉴别、监测、防控以及深入研究该新亚型病毒的流行情况，本研究结合蜱样品中的BovHepV的高通量测序结果，探索并建立了针对该病毒株的巢式PCR检测方法。经试验证明，该方法敏感性高、重复性好、特异性强，具有较好的临床检测应用价值。
1 材料与方法 1.1 材料1.1.1 样品 2020年6—10月，在广东省湛江市牛养殖场采集蜱115只；在揭阳市牛养殖场采集蜱59只；在广东省佛山市犬身上，采集蜱126只。经形态学和分子生物学鉴定，蜱均为扇头蜱属，其中，微小扇头蜱59只、镰形扇头蜱241只。
1.1.2 病毒毒株或病毒核酸 BovHepV-GDZJ、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus，LCMV)、阿龙山病毒(Alongshan virus，ALSV)、广平病毒(Quang Binh virus)、Lihan蜱病毒(Lihan tick virus，LTV)、发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus，SFTSV)等病毒毒株或病毒核酸均由本实验室提供。
1.1.3 主要试剂与仪器 MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0、Premix Taq、pMDTM18-T Vector Cloning Kit试剂盒、PrimeScript One Step RT-PCR kit Ver 2(宝日医生物技术北京有限公司)；TRIzol LS试剂(赛默飞世尔科技中国有限公司)；TIANprep Mini Plasmid Kit质粒小提试剂盒；组织研磨机(QIAGEN，德国)；超低温冰箱(海尔DW-40L508)；涡旋混匀器(WIGGENS，德国)；三槽基因扩增仪(Biometra TRIO 48)；经典电泳仪电源(WIX-EP600C)；恒温金属浴(上海一恒科技有限公司)；Axygen琼脂糖凝胶回收试剂盒。
1.2 方法1.2.1 蜱样品RNA的提取 根据MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂盒说明书，提取蜱样品RNA。本研究所使用的RNA终浓度约200 ng·μL－1或使用量为1 ng·50 μL－1体系。
1.2.2 BovHepV序列丰度分析 使用软件Geneious、PUTTY和FileZilla，结合宏转录组高通量测序原始数据，对实验室获得的BovHepV全基因组进行简易可视化定量分析。
1.2.3 HNV巢式PCR引物的设计 根据广东湛江地区的蜱样品宏转录组测序结果，比较BovHepV基因组信息及mRNA表达量；利用生物学软件Primer Primeier 6、Oligo 7，在病毒mRNA表达量相对高的区域设计巢式PCR引物。引物经NCBI在线功能Primer-BLAST验证，对蜱传或蜱携带的多种病原体，如无形体、立克次体均无非特异性扩增。引物序列见表 1，由广州天一辉远生物科技有限公司合成，引物使用浓度均为10 μmol·L－1。
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表 1 巢式PCR引物 Table 1 Primers for nested PCR |
1.2.4 BovHepV巢式PCR检测方法的建立及优化 以阳性样品为模板，进行巢式PCR扩增并优化退火温度。一轮RT-PCR反应体系(10 μL)：灭菌去离子水2.8 μL，2×1 Step Buffer 5 μL，上游及下游引物各0.4 μL，PrimeScript Enzyme酶0.4 μL，模板1.0 μL。一轮RT-PCR反应条件：50 ℃ 30 min；94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，56、57、58、59、60、61 ℃(6个不同温度) 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，30个循环；72 ℃ 5 min; 4 ℃保温。巢式PCR反应体系(50 μL)：灭菌去离子水18.5 μL、Premix Taq 25.0 μL、上游引物及下游引物各2 μL、模板2.5 μL。二轮PCR反应条件：98 ℃ 1 min；98 ℃ 30 s，55、56、57、58、59、60、61 ℃(7个不同温度)30 s，72 ℃ 90 s，30个循环；72 ℃ 5 min；4 ℃保温。PCR产物进行1.5% 琼脂糖凝胶电泳。
1.2.5 BovHepV-GDZJ株标准品的制备 以阳性样品的cDNA为模板，上游引物BovHepV-F：5′-AACCACTGCTGCTCGTCTG-3′，下游引物BovHepV-R：5′-ACGCAGTCGCCTTCAGTT-3′进行扩增，扩增终产物大小为2 094 bp。反应体系共50 μL：灭菌去离子水18.5 μL、Premix Taq 25.0 μL、上游引物及下游引物各2 μL、模板2.5 μL。反应条件：98 ℃ 1 min; 98 ℃ 30 s; 59 ℃ 30 s; 72 ℃ 90 s，30个循环；72 ℃ 5 min; 4 ℃保存。PCR产物通过核酸凝胶电泳、胶回收后连接到pMD18-T载体，转化到DH5α感受态细胞，于含氨苄青霉素的培养板37 ℃培养12 h，挑单个菌落扩大培养，经菌液PCR鉴定后，阳性克隆送公司测序。提取质粒，采用分光光度计测定浓度，计算质粒copies数。Copies数=质量浓度(mg·L－1)×6.023×1014/(碱基数×660)。
1.2.6 特异性试验 用巢式PCR方法检测蜱携带病毒的核酸，包含HNV、LCMV、ALSV、广平病毒、SFTSV，以灭菌去离子水作为阴性对照，扩增产物用1.5% 的琼脂糖凝胶电泳检测或鉴定。
1.2.7 敏感性试验 10倍梯度稀释(105~10-1 copies·μL－1)的质粒标准品作为模板，灭菌去离子水作为阴性对照，琼脂糖凝胶电泳验证检测一轮PCR产物和二轮PCR产物，统计检出质粒DNA的最小拷贝数。
1.2.8 重复性试验 以构建的阳性质粒为模板，进行组内试验和组间试验。组内试验，取3个不同浓度梯度(105~103 copies·μL－1)的BovHepV质粒标准品作为重复性试验的检测对象，每个梯度重复3次；组间试验，以质粒标准品为模板，每间隔1周做1次BovHepV的巢式PCR检测试验，连续3周。比较组内、组间试验的检测结果，评估该方法的可重复性。
1.2.9 蜱样品检测 采用PCR方法和巢式PCR方法，对2020年在广东地区采集的蜱样品进行检测，疑似阳性条带的PCR产物均经测序方法验证，比较并分析两种检测方法的检测效率。
2 结果 2.1 BovHepV-GDZJ序列丰度分析蜱样本宏转录组测序数据中，BovHepV-GDZJ株全基因组序列的可视化定量分布见图 1。以BovHepV-GDZJ的全基因组序列为内参序列，样品高通量测序结果共有224个reads定向到该内参序列上，获得了92.1%的基因组覆盖率(8 115 nt/8 808 nt，两两相似性为99.7%。病毒reads占非核糖体reads总数的百分比为0.003 8% (224 reads/5 883 446 reads)。其中，BovHepV-GDZJ株基因组序列上的1 743―2 665、3 833―4 205、7 877―8 622位区域序列丰度较高，在高丰度区域设计本研究巢式PCR引物。
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图 1 广东湛江BovHepV-GDZJ基因组高通量测序拼接图 Fig. 1 High throughput analysis of new BovHepV genome in Zhanjiang, Guangdong |
以阳性样品RNA为模板，通过调整不同的退火温度，筛选最适退火温度，结果如图 2所示。6个退火温度均能产生与预期大小相符的目的条带，其中58 ℃温度条带最清晰且无明显杂带或拖带。将二轮PCR退火温度设为55、56、57、58、59、60、61 ℃，结果显示7个退火温度均能产生目的条带，其中第二轮退火温度最适为56~57 ℃。
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M.DNA相对分子质量标准；1. 55 ℃；2~7. 56~61 ℃；8.阴性对照 M. DL2000 DNA marker; 1. 55℃; 2-7. 56~61℃; 8. Negative control 图 2 一轮PCR(A)和二轮巢式PCR(B)退火温度的优化 Fig. 2 Frist round sensitivity test of PCR (A) and Second round sensitivity test of nested PCR (B) |
将BovHepV目的基因克隆至pMD18-T载体。经PCR扩增验证，目的片段为2 094 bp，与预期大小一致。后将质粒送往测序，确定成功构建标准质粒。超微量分光光度计测得重组质粒浓度为276.70 ng·μL－1，根据公式计算得知，标准品的浓度为6.86×1010 copies·μL－1。
2.4 特异性、敏感性及重复性检验特异性试验结果显示，此方法仅能扩增BovHepV-GDZJ质粒标准品，对其他病原无反应，表明该巢式PCR方法的特异性较好。
敏感性试验结果显示，一轮PCR的检测下限为6.8×103 copies·μL－1(图 3A)。巢式PCR检测下限为6.8 copies·μL－1，结果表明，本方法具有较高的敏感性，巢式PCR比一轮PCR敏感性高1 000倍(图 3B)。
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M. DNA相对分子质量标准；1~7. 105~10－1；8.阴性对照 M. DL2000 DNA marker; 1-7. 105-10－1; 8. Negative control 图 3 一轮PCR敏感性试验(A)和巢式PCR敏感性试验(B) Fig. 3 Frist round sensitivity test of PCR (A) and Second round sensitivity test of nested PCR (B) |
组间及组内试验均能出现单一目的条带，表明本方法具有良好的重复性。
2.5 蜱样品检测采用PCR和巢式PCR方法分别检测300份蜱样中HNV的流行情况。检测结果经基因测序方法验证，揭阳市和佛山市的蜱样中均未检测到BovHepV-GDZJ，而湛江市蜱样中，PCR检测的阳性率为33.04%(38/115)，巢式PCR检测的阳性率为46.09%(53/115)。结果说明巢式PCR灵敏性明显优于PCR。
3 讨论HNV会造成牛无症状持续性感染[8]，对养牛业的健康发展构成了潜在威胁。同时，我国在商品化的胎牛血清中也检测出HNV核酸[9]，揭示HNV可能对细胞培养等科研试验及疫苗制备造成不利影响。HNV在全球广泛分布流行，但关于HNV的传播方式、传播途径、流行情况及早期快速检测方法均存在较大研究空间。
目前，HCV的检测方法有血清学方法和分子学方法[11]。血清学方法包括重组免疫印迹试验和酶联免疫吸附试验。分子学方法有直接测序、特异性引物PCR法、特异性探针杂交法等，一部分丙型肝炎病毒是通过高通量测序方法发现的。目前，国内外对HNV的发现及研究都是基于高通量测序技术和PCR方法，还未有系统的分子学或血清学检测方法，HNV的鉴定及检测采用何种方法，主要取决于实验室的现有条件及目的。对临床而言，能确定病毒基因型、评估牛丙型肝炎病毒在动物种群中受感染的比率及感染既往史，血清学调查可以提供比核酸检测更真实的结果；对于流行病学研究而言，准确定位到病毒亚型的检测试验也是必需的。
此外，本研究结果提示，蜱很可能是HNV机械性传播媒介而不是自然宿主。与澳大利亚一项关于蜱中发现啮齿动物肝炎病毒的研究类似[12]，BovHepV-GDZJ在蜱高通量数据集中表现出极低的丰度(0.003 8%)，加上HNV在黄病毒科系统发育中的位置，表明该病毒很可能来自蜱的脊椎动物宿主，并且主要存在于饱血蜱的血液中，而不是来自蜱本身，也可能不感染蜱或在蜱中进行复制。本研究的蜱存在BovHepV高阳性率是因为本次检测的蜱样品采集自同一个牛养殖场，不具有统计学意义。后续可重点关注饱血蜱及未吸血蜱携带HNV的流行情况、进行湛江市牛场甚至广东地区牛场BovHepV流行病情况的大规模调查。
4 结论基于宏转录组学高通量测序方法，首次在广东湛江市采集的蜱中发现BovHepV-GDZJ并建立敏感性高、特异性强、稳定性好的巢式PCR检测方法，揭示了蜱携带新型病毒的能力，建立的检测方法也可为后续该病毒株的诊断及防控提供技术支持，为HNV流行病学监测奠定基础。
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(编辑 白永平)