畜牧兽医学报  2022, Vol. 53 Issue (2): 654-657. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2022.02.032    PDF    
引用本文
王璐瑶, 郝雪飘, 雷白时, 赵款, 张武超, 袁万哲. 新型鹅细小病毒感染鸭的肝、胸腺、回肠转录组差异表达分析[J]. 畜牧兽医学报, 2022, 53(2): 654-657.  
WANG Luyao, HAO Xuepiao, LEI Baishi, ZHAO Kuan, ZHANG Wuchao, YUAN Wanzhe. Differential Expression of Transcriptome in Liver, Thymus and Ileum of Ducks Infected with Novel Goose Parvovirus[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2022, 53(2): 654-657.  
新型鹅细小病毒感染鸭的肝、胸腺、回肠转录组差异表达分析
王璐瑶1, 郝雪飘1, 雷白时1,2, 赵款1,2, 张武超1,2, 袁万哲1,2     
1. 河北农业大学动物医学院, 保定 071001;
2. 河北省兽医生物技术创新中心, 保定 071001
收稿日期：2021-04-27
基金项目：河北省重点研发计划（18227517D）；河北农业大学引进人才科研专项（YJ202020）
作者简介：王璐瑶(1997-), 女, 新疆博乐人, 硕士生, 主要从事预防兽医学研究, E-mail: 1097478135@qq.com; 郝雪飘(1997-), 女, 河北邢台人, 硕士生, 主要从事预防兽医学研究, E-mail: m18632905076@163.com.
王璐瑶和郝雪飘为同等贡献作者
通信作者：袁万哲, 主要从事预防兽医学教学与科研工作, E-mail: yuanwanzhe@126.com.
摘要：旨在探究新型鹅细小病毒（novel goose parvovirus，NGPV）与宿主细胞相互作用的分子致病机制。本研究采用转录组测序技术对感染NGPV SD株14 d雏鸭的肝、胸腺和回肠进行分析。结果显示：感染组回肠上调基因有78个，下调基因有31个；感染组胸腺上调基因有111个，下调基因有78个；感染组肝中上调基因有128个，下调基因有313个；NGPV感染雏鸭后，胸腺、回肠和肝中的差异表达基因参与免疫效应过程、淋巴细胞介导的免疫等多个免疫相关生物学过程，并在Toll样受体信号通路、JAK-STAT信号通路、NF-κB信号通路、PI3K-Akt信号等多条信号通路富集。综上表明：NGPV感染激活了机体免疫反应和宿主细胞的相关抗病毒信号通路。此研究为NGPV的致病机制研究提供了新的线索。
关键词：新型鹅细小病毒    短喙侏儒综合征    转录组测序    免疫反应    
Differential Expression of Transcriptome in Liver, Thymus and Ileum of Ducks Infected with Novel Goose Parvovirus
WANG Luyao1, HAO Xuepiao1, LEI Baishi1,2, ZHAO Kuan1,2, ZHANG Wuchao1,2, YUAN Wanzhe1,2     
1. College of Animal Medicine, Hebei Agricultural University, Baoding 071001, China;
2. Hebei Veterinary Biotechnology Innovation Center, Hebei Agricultural University, Baoding 071001, China
Corresponding author: YUAN Wanzhe, E-mail: yuanwanzhe@126.com.
Abstract: This experiment was conducted to explore the molecular pathogenic mechanism of the interaction between novel goose parvovirus (NGPV) and host cells. In this study, transcriptome sequencing was performed on the liver, thymus and ileum of ducklings 14 days after infection with NGPV SD strain. The results showed that there were 78 up-regulated genes and 31 down-regulated genes in the ileum of the infected group; 111 up-regulated genes and 78 down-regulated genes in the thymus of the infected group; 128 up-regulated genes and 313 down-regulated genes in the liver of the infected group. The differentially expressed genes in thymus, ileum and liver of ducklings infected with NGPV are involved in many immune related biological processes, such as immune response process and lymphocyte mediated immunity. The differential genes are enriched in multiple signaling pathways such as Toll-like receptor signaling pathway, JAK-STAT signaling pathway, NF-κB signaling pathway, PI3K-Akt signaling. It is suggested that NGPV infection activates the body's immune response and the relevant antiviral signal pathways of host cells. This study provides new clues for the study of the pathogenic mechanism of NGPV.
Key words: novel goose parvovirus    short beak and dwarfism syndrome    transcriptome sequencing    immune response    

2014年下半年以来，在我国樱桃谷鸭群中报道了一种宿主范围改变的鹅细小病毒(goose parvovirus，GPV)变异毒株，被命名为NGPV[1-2]。其临床症状主要为雏鸭个头矮小、发育迟缓、喙萎缩、舌头外伸、跛行瘫痪、腹泻、胫骨变短、易骨折，被称为鸭短喙与侏儒综合征(short beak and dwarfism syndrome，SBDS)[3]。主要感染小日龄雏鸭群，发病率随年龄增长而降低[4]，患病鸭淘汰率高，给养鸭业造成巨大的经济损失。

目前，对于NGPV的研究更多集中于病原分离与鉴定、病毒的基因序列分析及PCR方法建立等方面，关于该病毒与宿主细胞相互作用的分子致病机制尚不清楚。基于此，本研究通过建立NGPV感染雏鸭的动物模型，采用转录组测序技术，分析感染后雏鸭肝、胸腺、回肠的基因转录表达谱差异, 寻找参与感染发生的相关基因及其信号通路，为探究NGPV致病机制奠定基础。

1 材料与方法 1.1 病毒及动物

新型鹅细小病毒SD株(EID50：10－4.3·0.2 mL－1；GenBank登录号：KY511124)，3日龄樱桃谷鸭。

1.2 仪器/耗材

Nanodrop紫外定量设备购自Thermo Scientific；2100生物分析仪、RNA 6000 nano kit均购自Agilent公司；电泳仪购自北京六一公司；凝胶成像系统购自北京百晶公司；Agarose购自Invitrogen公司；Marker购自TaKaRa公司；

1.3 样本的采集

将6只雏鸭随机分为对照组和感染组。对照组肌肉注射生理盐水0.2 mL·只－1，感染组肌内注射NGPV SD株0.2 mL·只－1。在处理后14 d, 采集两组雏鸭肝、胸腺和回肠，－80 ℃保存。

1.4 转录组测序

提取雏鸭肝、胸腺和回肠的总RNA，RNA质量检测，纯化mRNA，将mRNA片段化并反转录为cDNA，文库构建，Illumina平台上机测序(由上海派森诺公司完成)。

2 结果 2.1 表达差异分析

结果显示(图 1)：感染组回肠中上调基因有78个，下调基因有31个；感染组胸腺中上调基因有111个，下调基因有78个；感染组肝中上调基因有128个，下调基因有313个。

图 1 差异表达基因统计结果 Fig. 1 Statistical graph of the results of differentially expressed genes
2.2 GO富集分析

GO富集分析涵盖3个方面，分别描述基因的分子功能(molecular function，MF)、细胞的组分(cellular component，CC)、参与的生物学过程(biological process，BF)。

回肠差异基因在免疫反应调节、核苷结合、抗原结合、细胞因子活性、碳水化合物衍生物等BF和MF中显著富集(P＜0.05)。

胸腺差异基因在免疫效应过程、淋巴细胞介导的免疫、补体激活、白细胞介导的免疫、免疫应答的调节、免疫应答的激活、细胞黏附等BF显著富集(P＜0.05)。

肝差异基因在异源生物跨膜转运蛋白活性、生物黏附、细胞表面受体信号通路、己糖激酶活性、葡萄糖结合、神经酰胺代谢过程等BF和MF中显著富集(P＜0.05)。

2.3 KEGG富集分析

回肠中差异基因在Toll样受体信号通路、ECM-受体相互作用、JAK-STAT信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、Th1和Th2细胞分化、炎症介质对色氨酸通道的调节等过程显著富集(P＜0.05)。

胸腺中差异基因在NF-κB信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、FcεRI信号通路、FcγR介导的吞噬作用、PI3K-Akt信号通路、抗原处理和提呈、Apelin信号通路等过程有显著富集(P＜0.05)。

肝差异基因在Rap1信号通路、Ras信号通路、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、HIF-1信号通路、淀粉和蔗糖代谢、抗原处理和提呈等过程显著富集(P＜0.05)。

3 讨论

本研究中，建立了NGPV感染雏鸭动物模型，通过PCR检测感染组组织均为阳性，对照组组织均为阴性。

NGPV具有组织泛嗜性，有人推测禽类细小病毒感染后最早在肠壁发生复制，再通过血液达到次级靶器官[5]。但对于NGPV感染后病毒载量分布情况目前没有统一的研究结论，研究显示，NGPV感染后在肠道、肝、胸腺的病毒载量相对较高[6-8]。所以，本研究对感染NGPV雏鸭的胸腺、回肠和肝进行转录组测序，探究NGPV的感染对雏鸭组织的基因转录水平的影响。

NGPV感染后，回肠差异表达基因参与多个免疫相关生物学过程；差异表达基因涉及Toll样受体信号通路、JAK-STAT信号通路、Th1和Th2细胞分化。其中，Toll样受体信号通路和JAK-STAT信号通路都是重要的抗病毒信号通路，Toll样受体信号通路可通过多种途径激活多种免疫细胞，启动天然免疫应答[9]；NGPV感染可以激活TLR3受体触发有效的抗病毒天然免疫应答[10]。差异表达基因OASL上调7.82倍，OASL表达可通过JAK-STAT信号通路途径发挥抗病毒活性[11]，在抗病毒过程起重要作用。

NGPV感染后，胸腺差异表达基因也参与多个免疫相关生物学过程，差异表达基因涉及NF-κB信号通路、B细胞受体信号通路、FcεRI信号通路等多个通路。其中，上调基因CCL19参与NF-κB信号通路、细胞因子相互作用、趋化因子信号通路等，在炎症形成过程中起重要作用[12]。

肝感染NGPV后差异表达基因在MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、HIF-1信号通路多条信号转导通路富集。研究表明，PI3K-Akt、HIF-1信号通路与某些病毒复制有关[13-15]。差异上调基因中EPSPI1、OASL、IFITM2均在抗病毒免疫中起重要作用[11, 16]。

4 结论

NGPV感染雏鸭后，肝、胸腺、回肠差异表达基因参与多个免疫相关生物学过程，并在PI3K-Akt信号通路、NF-κB信号通路、Toll样受体信号通路、JAK-STAT信号通路等多个经典信号通路富集，提示NGPV感染宿主后激活了宿主免疫反应及相关抗病毒信号通路，从而对抗病毒感染。

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(编辑   白永平)