滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)是一种危害禽类和鸟类健康的重要病原,可引起滑液囊支原体病,又称传染性滑膜炎[1]。该病可通过直接接触水平传播或经卵垂直传播,不同发育阶段的鸡均可感染,导致采食量下降,饲料转化率下降,生长发育迟缓,胴体降级[2-3];成年鸡关节肿大,滑膜炎,出现呼吸症状,蛋鸡产蛋率下降,蛋壳顶端异常,种蛋孵化率降低[4]。单一的MS感染很少导致鸡死亡,但会降低鸡的免疫力,导致继发感染[5]。Olson等首次在美国发现该病,随后在法国、意大利、澳大利亚及葡萄牙等国家相继报道该病。近年来,国内外多个地区均存在MS感染,且该病有发展及蔓延趋势,给养禽业带来较大的经济损失。马爽等[6]对我国11个省份不同鸡场进行检测,均发现MS感染,鸡群感染率超过69%[7]。MS基因组较细菌小,为750~850 kb,G+C含量为28%左右。NCBI收录的MS全基因组有10条,包括巴西MS53株[8]、美国WVU-1853株[9]、澳大利亚86079/7 NS株[10]、中国河南HN01株[11],以及经86079/7 NS诱导获得的MS-H株[12]。MS-H株是MS弱毒疫苗生产用菌株,是全球通用的MS弱毒疫苗株,但研究表明,MS-H株疫苗仅对未感染MS的鸡群有效,对已感染MS的鸡群几乎无效,甚至可能会加重病情[13]。全基因组测序是了解基因序列信息的一种重要手段,中国目前只有1株分离自河南的HN01全基因组序列,因此,关于我国MS的遗传多样性资料不全面。本实验室于2018—2019年,从川西4个规模2 000只以上三黄鸡肉鸡场分离出7株MS[14],4个场均未免疫MS弱毒疫苗,发病鸡表现为跗关节肿大、胸部囊肿,剖检时可见跗关节腔、爪垫、胸部龙骨滑膜囊有淡黄色胶冻样分泌物,或黄色干酪样分泌物附着。本试验对7株MS进行全基因组测序,通过生物信息学分析,确定MS分离株的基因组成、基因岛等基因组特征;并与NCBI上其他MS株的基因组序列比较分析,明确川西地区MS菌株的遗传进化关系和差异基因,为进一步研究MS的致病机制、开发MS亚单位疫苗和建立特异性检测技术等奠定基础。
1 材料与方法 1.1 MS分离株7株MS四川分离株由西南民族大学动物医学实验室分离鉴定并保存,分别命名为MS251、MS254、MS221、MS231、MS12H、MS1G、MSK1,其中MS251、MS254、MS221、MS231分离自同一鸡场,MS12H、MS1G、MSK1分离自其他3个鸡场。改良Frey氏培养基购自北京中海生物科技有限公司。
1.2 MS分离株培养和DNA提取分别将7株MS株各200 μL菌液接种到1.8 mL改良Frey氏液体培养基中,于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养,待培养基颜色变黄时收集菌液即为MS分离株种子菌液。经半固体培养基培养及菌落形态观察确定是否符合MS的培养特征,并将经特异性PCR扩增鉴定的种子菌液扩大培养后提取MS基因组DNA。要求基因组DNA完整且没有降解,在23 kb以上,OD260 nm/OD280 nm值为1.8~2.0;DNA浓度>30 ng·μL-1。
1.3 全基因组测序、原始数据质量评估和质量控制7株MS全基因组测序由北京赛默百合生物科技有限公司完成,采用Illumina HiSeq平台测序,构建PE测序文库,得到的原始图像数据经过Base Calling处理后,FASTQ格式文件存储读长(read)的碱基及其质量信息。对原始测序数据使用FastQC(版本0.11.5)进行碱基质量统计,并使用R统计软件对结果进行可视化。使用Trimmomatic(版本0.36)对序列进行修剪和去除接头序列。
1.4 7株MS的基因从头组装、基因预测和注释利用Edena软件,通过设置默认参数将所有过滤后的reads进行组装,得到最终的组装结果并统计长度信息。使用经典的OLC(overlap-layout-consensus)算法架构的组装工具,将经过算法处理后的reads进行组装。组装后,得到多条Contig。使用Prodigal对CDS进行预测,使用SignalP对信号肽进行预测,使用infernal+Rnammer对tRNA、rRNA进行预测。将所有的CDS序列利用blast比对到KEGG、Swissport、Nr、Nt、eggNOG数据库,并进行注释,e value阈值统一为1×10-35。
1.5 MS全基因组比较分析在进行全基因组比较时,引用了NCBI上收录的8株MS的全基因组序列,分别为86079-7 NS(NZ_CP012624.1)、86079/7 NS (NZ_CP029258.1)、HN01(NZ_CP034544.1)、MS53(NC_007294.1)、MS-H(NZ_KP704286.1)、MS-H(NZ_CP021129.1)、NCTC10124(NZ_LS991953.1)、WVU1853T(NZ_CP011096.1)。使用Xshell软件对注释完成的7株MS四川分离株全基因组进行筛选统计,包括总基因长度、GC含量、编码基因。使用R语言中的genoPlotR包,将7株MS四川分离株的全基因组与NCBI上记录的8株MS全基因组比较,分析分离株与其他野毒株和疫苗株的差异。将差异区域进行线性分析。
2 结果 2.1 提取的MS分离株DNA质量MS分离株DNA提取结果表明MS基因组DNA完整且没有降解,在23 kb以上,测量的OD260 nm/OD280 nm比值为1.8~2.0;DNA浓度大于30 ng·μL-1,符合测序要求。
2.2 全基因组测序及预测使用Xshell软件中shell脚本语言对全基因组筛选统计,结果显示,7株MS全基因总长度在760~ 810 kb,GC含量28.2%~28.44%,编码基因数677~725个,CDS 636~685个,rRNAs 5个,tRNA数34个,tmRNA 1个。详见表 1。
2.3.1 COG文库注释 将所有预测到的蛋白质与EggNOG 4.0数据库进行比对后,取e value 1×10-35为阈值,取best hit one作为映射依据进行COG注释。COG基因功能注释后分类结果显示,7株MS四川分离株MS251、MS254、MS221、MS231、MS12H、MS1G、MSK1功能基因数分别为528、527、527、527、512、514、510个。按照功能分类又可分为三大类,第一类代谢基因,包括氨基酸的运输和代谢、碳水化合物的运输和代谢、辅酶的运输和代谢、无机离子的转运和代谢、脂质转运与代谢、核苷酸的运输和代谢、次生代谢产物生物合成运输和分解代谢、能源生产与转换;第二类信息储存和处理基因,包括转录、复制重组和修复、防御机制;第三类为细胞过程和信号转导基因,包括细胞周期控制、细胞分裂和染色体分割、细胞壁/膜/外壳起源、细胞内运输、细胞运动性,分泌和囊泡运输、翻译后修饰,蛋白质转换,伴侣、信号转导机制、翻译、核糖体结构和生物发生。还含有功能未知基因和预测基因,结果如表 2所示。结果显示,7株MS功能基因种类相同,来自同一鸡场的4个分离株MS251、MS254、MS221、MS231,其功能基因个数几乎相同,而分别来自其他3个鸡场的MS12H、MS1G、MSK1间功能基因个数差异相对较小,但较来自同一鸡场的4株MS碳水化合物的运输和代谢基因数少8~9个,其他部分基因数差异在0~3个之间,如表 2所示。
2.3.2 GO文库注释 将所有基因序列比对到Swissport数据库,并使用blast2 GO进行GO Mapping。所有的GO根据GO的有向无环图向上回溯,直到第3层,而后统计第3层GO的分析结果。结果显示,功能基因包括分子功能、生物过程、细胞成分3大部分。分子功能基因包括催化活性、结构分子活性、转运蛋白活性、翻译调节活性、分子功能调节因子、结合因子;生物过程基因包括细胞过程、生物调节、对刺激的反应、代谢过程、生物间相互作用、定位、复制;细胞成分基因包括细胞解剖实体、含蛋白质的复合物。分析结果表明,7株MS四川分离株功能基因种类相同,同场内分离的MS251、MS254、MS221、MS231,功能基因数几乎相同,分别来自3个鸡场的MS分离株MS12H、MS1G、MSK1间在部分功能基因数上差异相对较小,但较同场内分离的4株MS的催化活性基因数少7~8个、细胞过程基因数少4~6个,其他部分基因数差异在0~3个之间,如表 3所示。
2.3.3 KEGG文库注释 将所得的序列比对到KEGG数据库并进一步映射到KO(KEGG orthology),并通过KO映射到Pathway,对KEGG每一个功能模块的Pathway映射到的基因数进行统计的结果如下,细胞过程:细胞群落-原核生物、细胞生长和死亡、细胞运动性、运输和分解代谢;环境信息处理:膜运输、信号传导;遗传信息处理:翻译、复制和修复、折叠、分类和降解、转录;新陈代谢:碳水化合物代谢、核苷酸代谢、能量代谢、辅助因子和维生素的代谢、氨基酸代谢、类脂物代谢作用、其他氨基酸的代谢、生物降解和代谢、萜类和多酮的代谢、其他次生代谢产物的生物合成、糖的生物合成和代谢。结果显示,7株MS四川分离株功能基因种类相同,MS251、MS254、MS221、MS231各种功能基因数目几乎相同,MS12H、MS1G、MSK1间部分功能基因数差异相对较小,较4株同场分离MS的膜运输基因少6~9个、碳水化合物代谢基因少12~13个,氨基酸代谢基因少3~6个,能量代谢基因数少2~5个,其他部分基因数相差异在0~3个之间。详见表 4。
2.3.4 Nr和Nt文库注释结果 将所有的基因序列比对到Nr和Nt数据库, 结果显示,7株MS分离株测序基因99.69%以上来源于MS基因,但有少部分基因可能来源于鸡毒支原体。证明7株分离株为MS。
2.4 专业数据库分析2.4.1 PHI-base数据库分析 PHI-base数据库(pathogen host interactions database)从文献中收集了大量致病基因和效应基因的序列。根据数据库中病原基因表型对照分析7株MS分离株的基因表型结果显示,导致病原菌致病能力丧失的基因为3个;导致病原菌致病能力减弱的基因MS251、MS221、MS231为44个,其余菌株45个;对病原菌致病性没有影响的基因均为10个;导致病原致病能力增强的基因MS1G 8个,其余菌株有9个;致病效应基因7株MS均为2个,致死因子基因MS251、MS254、MS221、MS231为3个,MS12H、MS1G、MSK1为2个,抗药和感药基因在各分离株均1个。详见表 5。
2.4.2 VFDB数据库分析 使用blastp将所有预测出的蛋白质序列比对到VFDB数据库中,以1×10-35作为阈值进行筛选。VFDB记录了大量毒力因子序列信息,结果显示分离的7株MS含有25种毒力因子,msbA、sugC、oppF基因拷贝数均为2,tnp其拷贝数MS251、MS254、MS221、MS231、MS12H、MS1G、MSK1分别为6、5、5、5、3、3、2,VlhA基因高拷贝存在各菌株中,其拷贝数分别为17、16、17、13、14、25、13个,表明VlhA是MS主要的毒力因子,对MS的致病性具有重大作用,剩余毒力基因7株MS拷贝数均为1。详见表 6。
2.5.1 全基因组进化图 用MEGAX软件将7株MS分离株与NCBI上收录的8株MS全基因组比较,发现7株MS四川分离株与NCBI上收录的HN01基因组最接近,而与NCBI上其余7株MS遗传距离较远,7株MS分离株间基因组存在差异,MS251、MS221和MSK1聚为一小支,MS231、MS12H和MS254、MS1G与HN01聚为另一小支。详见图 1。
2.5.2 全基因组比较圈图 用MEGAX软件将7株MS分离株与NCBI上收录的8株MS全基因组进行圈图比较(图 2),发现7株MS四川分离株与巴西分离株MS53、美国分离株WVU-1853、澳大利亚分离株86079/7 NS以及疫苗株MS-H差异较大,而与中国河南分离株HN01最相近,但在37~50、190~220、490~500、530~560、680~780、790~820 kb 6处片段区域与HN01存在差异(图 2)。
2.5.3 与HN01差异区域线性分析 使用R语言中的genoPlotR作图,将分离株与HN01株6处差异片段区域进行线性比较。比较37~50 kb片段区域, 发现HN01上存在的3个基因lepB、NA和fusA在7株MS四川分离株上分布不一致。lepB基因在MS251、MS254、MS221、MS12H呈长片段对应,但是片段倒位,与HN01方向相反,且位置也发生改变,而在MS231、MS1G和MSK1上呈小片段对应。NA和fusA对应片段都是散射性地分布在7株MS四川分离株间,且片段较短(图 3)。
比较190~220 kb序列,发现HN01上的rumC在MS251、MS254、MS221、MS12H上都有对应长片段分布,片段倒位,与HN01方向相反,存在移位。NA在MS251、MS254、MS221上有对应长片段,倒位,有移位。secDF、obgE、trpS则在7株MS四川分离株上呈散在分布的小片段,既有同向的,也有反向的。在7株MS分离株上此基因片段间都有OPPF和sugC 2个毒力因子片段(图 4)。
490~500 kb间,HN01上的5个基因与7株MS分离株分布不一致。efp在MS231上有长片段对应,在MS251、MS254、MS221、MS12H上有部分片段对应,长度相同,位置对应,基因片段倒位,与HN01株方向相反,有移位。dcm在MS231和MS1G分离株上有长片段对应,倒位,在其余5株上对应片段散在分布,片段较短,方向与HN01上既有相同的也有相反的。NA、aspS和hisS基因在7株MS四川分离株上对应片段散在分布,片段较短(图 5)。
530~560 kb间差异片段基因比较结果表明:HN01只有1个基因NA在MS231和MS1G上有长片段对应,倒位,且有位移。在MS251、MS254、MS221、MS12H上有NA基因对应小片段,且位置相同(图 6)。
在680~780 kb间,HN01上有1个基因pyk在MS251、MS221、MS12H上有该基因长片段对应,但都倒位,MS251和MS221位置相同,而MS12H位置不同,其他4株MS只有小片段对应,且方向不同(图 7)。
790~820 kb之间,HN01上有3个基因,其中rnc在MS251和MS12H上有大片段对应,倒位,且基因位置不同。NA在MS251、MS254、MS221、MS12H上有基因片段对应,位置相似,但倒位,如图 8所示。
以上结果表明6段基因线性比较,MS251、MS254、MS221、MS12H结构相似,MS231和MS1G相似,MSK1较短,与其他6株MS差异较大。7株MS分离株中除了HN01的基因外,在6个区域中,还含有其他的基因,包括一些酶、生长因子、毒力因子。其中图 4中,7株MS上都有毒力基因OPPF和sugC。这6个区域的差异对于四川分离株生物学特性及理化性质可能具有影响。
3 讨论近年来,四川地区鸡群MS感染较为严重。本试验前期从四川地区4个暴发MS的鸡场分离出7株MS,并对其致病性和耐药性等生物学特性进行了研究。MS感染对鸡和火鸡的养殖影响严重[15]。MS-H株是世界上唯一的MS弱毒疫苗株[16]。研究发现MS-H对国内鸡群MS的预防有的有效,有的效果差,甚至无效[17]。因此MS流行毒株全基因组测序分析对MS疫苗株的筛选、亚单位疫苗的开发和特异性检测技术的建立是一项基础性的工作。
本研究对7株MS四川分离株进行全基因组测序,eggNOG根据序列的相似性寻找直系同源基因,基因编码蛋白序列功能的注释有COG、GO、KEGG等多数据库形式,多数据库比对保证了基因注释的全面性,各数据库比对结果相似,确定7株分离菌株均为MS,其中来自同一鸡场的4株MS在基因数量及种类上差异较小,而与分离自另外3个鸡场的3株MS差异较大,表明MS四川分离株存在丰富的遗传多样性。
PHI数据库是研究病原与机体相互作用的专业数据库,用于研究致病菌与宿主间的相互作用[18]。PHI数据库分析7株MS导致病原菌致病能力降低的基因,除了共有基因,MS251、MS254、MS221、MS231还含有MoDeam基因,MS254特有glcA基因,MS12H、MS1G、MSK1含有FgTRR (FGSG_00871)和CaNAG1基因。致死因子中,MS251、MS254、MS221、MS231只含有GzOB009、GzOB006,而MS12H、MS1G、MSK1还含有TRR1基因。这些基因的差异可能与各MS分离株的致病性有关,推测MS251、MS254、MS221可能比MS12H、MS1G、MSK1有更强的致病性。TRR1基因表达硫氧还蛋白还原酶,Trr1可以降低Trx2-5,从而控制细胞内的氧化还原状态,深刻影响球孢白僵菌对节肢动物的杀灭潜力。这些基因对MS致病性的影响还需要进一步的试验验证。药敏试验中发现7株分离株对土霉素、大观霉素、泰乐菌素、替米考星等敏感,对红霉素的MIC值较高,但基因库分析7株MS只有1个抗药基因GyrA具有抗氟喹诺酮类药物的能力。
VFDB数据库是记录大量毒力因子序列信息的数据库[19],毒力因子是微生物代谢产生的具有侵袭力和毒力的分子,帮助微生物逃避或抑制宿主免疫反应。本研究将MS四川分离株序列信息导入VFDB数据库分析,发现MS含有25种毒力因子,大多数毒力因子为单拷贝数,但msbA、sugC、oppF、VlhA、tnp为多拷贝数。MS中主要的毒力因子基因大多数与黏附和侵袭力有关。如VlhA在7株MS四川分离株中以多拷贝形式存在,拷贝数最小13,最大25,该基因编码蛋白包含变脂蛋白(MSPB)和可变血凝素蛋白(MSPA),介导MS黏附、侵袭和免疫逃避,是重要的毒力因子[20-21]。除VlhA外,pdhb、eno、CT396、MG-301等毒力基因,都已证明与支原体的黏附有关。前期初步研究显示7株MS分离株对红细胞具有吸附能力,以及对鸡胚和雏鸡有感染能力,但未对菌株间致病力强弱进行比较,因此需要在后续试验中,验证菌株毒力基因差异对致病力的影响。
用MEGAX软件,将7株MS四川分离株与NCBI上收录的8株MS全基因组比较,发现7株MS与中国河南HN01株基因组最近,且与世界各国流行株差异较大,说明中国MS流行株有其独特性[11]。进一步通过全基因组圈图比较,发现7株MS四川分离株和HN01株在全基因组上共有6个差异区域,在6个差异区域内,既包含HN01上的同源基因,还含有其他的差异基因,且同源基因长度相似,但有的出现倒位,这可能对MS的生物学特性产生影响。支原体DNA复制和修复功能的部分缺失可以阻止大的基因组倒位的形成[22],已有研究发现MS-H基因组中存在55 kb的倒位,而MS-H亲本株86079/7 NS的全基因组中也存在相同的倒位,证实基因组倒置不是由化学诱变引起的,而是自然发生的[10, 23]。因此7株MS基因组中基因的倒位也可能是自然发生的。
在与HN01差异区域190~220 kb,7株MS四川分离株都存在毒力基因OppF和sugC,OppF为细胞质ATP酶,为肽的转运提供能量[24-25],对MS在气管黏膜上皮细胞的定殖必不可少[26]。在MS-H疫苗株中oppF的移码突变,导致其编码蛋白的改变,最终导致该蛋白正常功能的丧失[23],而在测序结果中显示OPPF提前终止,没有表达出完整的蛋白。sugC在结核分枝杆菌中编码一种ABC转运蛋白,参与海藻糖的输入,ABC转运蛋白的一个功能是作为ATPase的结构域[27]。除了毒力因子基因片段外,差异区域也包括一些编码酶和其他各种因子的基因,这些差异可能影响MS的生物学特性。比较7株MS四川分离株之间6个差异区域发现,总体上,MS251、MS254、MS221基因结构相似;MS1G和MS231相近;MSK1单独一支,且每个差异区域片段均较短。表明四川分离株在同场和不同场间,都存在遗传多样性。
4 结论目前,中国各个地区均存在MS感染。四川地区MS分离株全基因组比较分析发现,分离株与我国河南分离株HN01相近,与世界上主要MS流行株不同,可称为中国流行株。四川地区MS分离株与HN01株基因组的6个差异基因区域编码基因片段长度和方向倒位等变化,说明四川分离株发生了变异。而7株MS四川分离株间6个差异基因区域的不同,表明四川分离株不仅在不同场间,而且在同场间也存在遗传多样性。
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(编辑 白永平)