精液在冷冻的过程中，环境温度的迅速降低导致精子产生应激，膜脂质被氧化，导致精子膜结构受损，这种氧化应激最终造成精子功能的改变[1]。且冻融的精子比新鲜的精子更容易被过氧化，冷冻解冻后精子活率、活力、功能膜完整性和线粒体活性以及抗氧化酶活性降低[2-3]。此外，在种公畜新鲜精液生产过程中，饲养种公畜环境温度过高、活动空间小等都会造成动物氧化应激，影响雄性动物的精子质量，危害畜体健康[4-5]。研究表明，在精液稀释液中添加抗氧化剂可以减少精子在冷冻过程中的氧化损伤，提高精液冷冻保存效果，而在种公畜日粮中添加抗氧化剂可以减少机体应激，提高种公畜繁殖性能[6-8]。
番茄红素(lycopene，LYC)是主要的天然类胡萝卜素，是一种高度不饱和的直链碳氢化合物，分子式为C40H56，相对分子质量为536.88，熔点176 ℃，不溶于水，可溶于脂类和非极性溶剂，有13个碳-碳双键，包括11个是共轭双键和2个非共轭双键，这使它成为一种非常强大的抗氧化剂[9-10]。研究表明，在单线态氧的猝灭效率功效方面，番茄红素是β-胡萝卜素的两倍多，比α-生育酚快十倍，更是维生素E的一百倍，且具有抗肿瘤、延缓衰老、保护心血管和增强免疫力的生物学功能[11-13]。近年来，番茄红素在雄性生殖调控和保护方面的研究越来越多，番茄红素对雄性动物繁殖性能有较好促进作用[14]，如在被诊断为特发性或抗体介导性不育症的患者中，使用番茄红素可以显著改善精液品质参数[9, 15]；此外，在小鼠体内的研究表明，番茄红素可防止睾丸退行性改变，改善精子活力和形态，并稳定暴露于药物、有机污染物或真菌毒素的睾丸组织的抗氧化能力[16-17]；而在绵羊的日粮中添加番茄红素，能够显著提高血浆和睾丸组织中睾酮含量，使睾丸重量增加，促进绵羊睾丸组织的发育[18]。番茄红素在精液冷冻稀释液中也有应用，精液稀释液中添加适宜浓度的番茄红素可以显著提高人、猪和羊冷冻-解冻后精子运动性能和精子生理结构的完整性，保护精子DNA完整性，改善冷冻精液质量，从而提高精液冷冻保存效果[19-21]。
目前，虽然番茄红素在牛精液冷冻保存中已有研究[22]，但是由于牛的品种、饲养气候等因素，导致番茄红素对牛精液冷冻保存效果存在很大的差异，且番茄红素对牛新鲜精液品质的影响未见报道。因此，本研究基于番茄红素的抗氧化生物学性质和具有为雄性生殖细胞提供抗氧化保护的前景，旨在探索番茄红素在体外对秦川牛精液冷冻保存效果和体内对秦川牛精液品质及机体抗氧化性能的影响。为优化牛精液冷冻保存技术和提高动物机体抗氧化能力提供依据，有助于进一步开发成本较低效果较好的新型精液稀释液添加剂和种公畜日粮添加剂，促进秦川牛的肉牛改良与保种工作。
1 材料与方法 1.1 试验材料和试剂计算机辅助精液分析系统(SQA-Vb)，SQA-Vb精液采样管，精子程序冷冻仪均购于澳大利亚Cryologic；精子冷冻细管灌装机购于法国卡苏；移液枪，电子天平，水浴锅，倒置荧光显微镜均购于日本Olmpus公司；柠檬酸钠(罗恩)；果糖、葡萄糖、甘油、TRIS、庆大霉素和链霉素、番茄红素、罗丹明123均购自北京索莱宝科技有限公司；饲喂级番茄红素购自陕西昂煦生物科技有限公司；试剂盒均购自南京建成工程研究所有限公司。
1.2 精液稀释液配制100 mL基础精液稀释液中含有柠檬酸钠1.354 g、TRIS 2.4224 g、葡萄糖1.1 g、甘油5.33 mL、卵黄20 mL、双抗0.587 mL和双蒸水68.82 mL，搅拌混匀后放入4 ℃冰箱中备用，使用时，根据试验设计在基础稀释液中分别加入0、1、2、3、4 μmol·L-1的番茄红素于37 ℃水浴锅中预热待用。
1.3 动物饲喂选择体重600 kg左右且新鲜精液品质相近并稳定的秦川种公牛3头，在日粮中添加15 mg·kg-1 BW番茄红素进行饲喂，预饲期15 d，正饲期45 d，饲喂番茄红素前后种公牛基础日粮不变，自由饮水。
1.4 精液的采集与处理精液冷冻保存：选择3头秦川种公牛：年龄3~5岁，体况健壮且繁殖性能良好，在每周二、五早上09:00点利用假阴道法采精，选择颜色乳白色或乳黄色的正常鲜精用仪器分析，活力≥65%，密度≥6× 108个· mL-1，畸形率≤15%的精液采用一步法进行稀释，即将预热的牛精液稀释液缓慢倒入新鲜精液中(新鲜精液在稀释之前始终保持在37 ℃)，将稀释后的精液利用细管灌装封口一体机进行分装并在4 ℃平衡3 h后，放入4 ℃冷冻箱中用程序化自动冷冻仪缓慢降温至-145 ℃，迅速放入液氮中保存。7 d后用于检测，迅速将0.25 mL细管从液氮中取出放入37 ℃水浴锅中30 s解冻进行后续试验。
1.5 血液采集与处理秦川种公牛饲喂番茄红素前后进行颈静脉采血10 mL，血样立即运回实验室在离心机中以3 000 r ·min-1转速离心10 min，吸取上清液血清，置于-80 ℃冰箱进行保存用于后期检测。
1.6 精子质量的检测1.6.1 精子活力检测 新鲜精液精子运动性能的检测：预热1支空的精子采样管，将100 μL新鲜精液加入到预热的2.0 mL Qwik CheckTM稀释液(适用于动物新鲜精液)中，混匀样本，用SQA-Vb精子采样管吸取混合后的精液，将精子采样管插入SQA-Vb测量仓进行检测，每个新鲜精液检测3次，保存结果，各种精子运动相关参数如下：活动精子率(%)、前向运动精子率(%)、前向运动精子平均速率(μm·s-1)、畸形率(%)。
冷冻-解冻后精子运动性能的检测：在37 ℃水浴锅中提前预热500 μL Qwik CheckTM稀释液(适用于冷冻动物精液)，将解冻后的200 μL精液加入其中混匀，用SQA-Vb精子采样管吸取混合后的精液，将精子采样管插入SQA-Vb测量仓进行检测，每个处理组检测3次，保存结果，各种精子运动相关参数如下：活动精子率(%)、前向运动精子率(%)、前向运动精子平均速率(μm·s-1)。
1.6.2 精子质膜完整性检测 利用精子尾部低渗肿胀(hypo-osmotic swelling test，HOST)法检测精子质膜完整性。按比例配制好低渗溶液，将100 μL解冻后的精液加入到提前预热的等温1 mL低渗溶液中，混匀孵育30 min，吸取10 μL制成玻片，在400×镜下观察，精子尾部呈角度弯曲为质膜完整，根据“精子弯尾率(%)=弯尾精子数/计数总精子数×100”计数弯尾率，每次至少计数200个精子，重复3次以上。
1.6.3 精子顶体完整率检测 利用花生凝集素荧光标记(FITC-PNA)染色法检测精子顶体完整性。吸30 μL解冻后的精液，在干净的载玻片上涂抹均匀，自然风干后，用4%组织细胞固定液固定20 min，用10 μL FITC-PNA染液染色，37 ℃湿盒中避光孵育30 min，PBS冲洗3次，在荧光显微镜400×镜下拍照，头部呈绿色荧光的为顶体完整，即“精子顶体完整率(%)=头部绿色荧光的精子数/计数总精子数×100”，每次至少计数200个，重复3次以上。
1.6.4 精子线粒体活性检测 利用罗丹明(Rh123)荧光染料联合染色来区分精子线粒体是否具有活性，因为Rh123能够特异性地与功能良好的线粒体结合，使得精子尾部在荧光显微镜下发出绿光，因此，头部不发光但尾部有绿色荧光的是有线粒体活性的精子。将200 μL解冻后的精液加入到500 μL提前预热的等温稀释液中，将3 μL Rh123加入到预热的200 μL PBS缓冲液中37 ℃避光孵育10 min形成染色液，在染色液中加入100 μL稀释后的精液，37 ℃避光孵育30 min，吸取10 μL制成玻片，在荧光显微镜400×下观察，计算线粒体活性，“精子线粒体活性(%)=尾部绿色荧光但头部不发光精子数/计数总精子数×100”。每次至少计数200个精子，重复3次以上。
1.7 抗氧化性能检测MDA含量的变化和SOD、CAT及GSH-Px三种酶活性的变化表示抗氧化能力的强弱，这些抗氧化指标的检测按照相应检测试剂盒的说明书进行。
1.8 统计与分析本试验所有数据用SPSS软件25.0进行单因素方差分析，所有结果以“平均值±标准差(Mean±S.D.)”表示，P < 0.05表示差异显著，P>0.05表示差异不显著。
2 结果 2.1 番茄红素对冷冻-解冻后秦川牛精子运动性能的影响1 μmol·L-1番茄红素对秦川牛精子活率和前向运动精子率有提高的作用，与对照组相比，前向运动精子率显著提高(P < 0.05)，但精子活率没有显著差异(P>0.05，表 1)；当番茄红素的浓度为2 μmol·L-1时，与对照组相比，冷冻-解冻后秦川牛精子的活率、前向运动精子率显著提高(P < 0.05)，并都达到最高，其中精子活率为60.10%，前向运动精子率为47.20%，而前向运动精子的平均速率有提高的趋势，为39.33 μm·s-1，但没有显著差异(P>0.05，表 1)；后随着添加番茄红素浓度的升高，冷冻-解冻后牛精子的活率、活力和前向运动精子的平均速率逐渐降低，添加3和4 μmol·L-1的番茄红素对冷冻-解冻后秦川牛精子运动产生了抑制作用，与对照组相比，冷冻-解冻后精子的活率和前向运动精子率都显著降低(P < 0.05)，前向运动精子平均速率有降低的趋势，但没有显著差异(P>0.05，表 1)。
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表 1 番茄红素对冷冻-解冻后秦川牛精子运动性能的影响 Table 1 Sperm motility of frozen-thawed semen after using lycopene dilution in Qinchuan bull |
表 2结果显示，在精液冷冻稀释液中添加番茄红素浓度为1 μmol·L-1时，冷冻-解冻后秦川牛精子的质膜完整性与对照组相比没有显著差异(P>0.05)；在精液稀释液中添加2 μmol·L-1番茄红素的精子质膜完整性达到了55.92%，完整性显著高于对照组(P < 0.05)；精液稀释液添加番茄红素浓度为3和4 μmol·L-1时，对精子的质膜出现破坏作用，但3 μmol·L-1的精子质膜完整性与对照组相比没有显著差异(P>0.05)；与对照组相比，4 μmol·L-1的番茄红素显著抑制(P < 0.05)了精子质膜状态完整，图 1为精子质膜检测的示意图。
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表 2 番茄红素对冷冻-解冻后秦川牛精子质膜完整性的影响 Table 2 Sperm membrane integrity of frozen-thawed semen after using lycopene dilution in Qinchuan bull |
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“→”表示质膜完整的精子，“↓”表示质膜不完整的精子 "→" indicate the sperm with integral membrane, "↓" indicate the sperm with damaged membrane 图 1 精子质膜检测的示意图 Fig. 1 Images of sperm membrane |
表 3结果显示，番茄红素的浓度处于0~ 2 μmol·L-1范围内时，冷冻-解冻后精子顶体完整率与浓度呈正相关；但当浓度范围处于2~4 μmol·L-1时，精子顶体结构的完整性与浓度呈负相关。精液稀释液中添加2 μmol·L-1番茄红素的精子顶体完整率最高，为61.47%，显著高于对照组(P < 0.05，表 3)；精液稀释液中添加番茄红素浓度为3和4 μmol·L-1时，冷冻-解冻后精子顶体完整率与对照组相比均有显著性降低(P < 0.05，表 3)，结果表明适宜浓度的番茄红素对秦川牛精子顶体结构具有积极作用，图 2为精子顶体染色示意图。
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表 3 番茄红素对冷冻-解冻后秦川牛精子顶体完整率的影响 Table 3 Sperm acrosome integrity of frozen-thawed semen after using lycopene dilution in Qinchuan bull |
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“S1”表示顶体完整的精子，“S2”表示顶体损伤的精子 "S1" indicate the sperm with integral acrosome, "S2" indicate the sperm with damaged acrosome 图 2 精子顶体染色示意图 Fig. 2 Images of sperm acrosome staining |
表 4显示，番茄红素浓度为1 μmol·L-1时的冷冻-解冻后精子线粒体活性与对照组相比没有显著差异(P>0.05)；在精液稀释液中添加2 μmol·L-1番茄红素的精子线粒体活性最高，为49.30%，显著高于对照组(P < 0.05)；精液稀释液添加番茄红素浓度为3和4 μmol·L-1时，对精子的线粒体膜出现破坏作用，与对照组相比，显著降低(P < 0.05)了冷冻-解冻后线粒体活性，图 3为精子线粒体染色的示意图。
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表 4 番茄红素对冷冻-解冻后秦川牛精子线粒体活性的影响 Table 4 Sperm mitochondrial activity of frozen-thawed semen after using lycopene dilution in Qinchuan bull |
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“M1”表示具有线粒体活性的精子，“M2”表示不具有线粒体活性的精子 "M1" indicate the sperm with mitochondrial activity, "M2" indicate the sperm without mitochondrial activity 图 3 精子线粒体染色示意图 Fig. 3 Images of sperm mitochondrial staining |
表 5结果显示，当添加番茄红素浓度为1 μmol·L-1时，冷冻-解冻后精子细胞内CAT和GSH-Px的酶活性显著高于对照组(P < 0.05)，但精子细胞内MDA的含量与对照组相比没有显著差异(P>0.05)；而在稀释液中添加2 μmol·L-1番茄红素的抗氧化效果最好，与对照组相比，能够显著提高冷冻-解冻后精子细胞内CAT和GSH-Px的酶活性(P < 0.05)，并显著降低精子细胞中MDA的含量(P < 0.05)；后随着精液稀释液中番茄红素浓度的增加，冷冻-解冻后精子抗氧化性能逐渐降低，添加番茄红素的浓度为3和4 μmol·L-1时，与2 μmol·L-1相比，CAT和GSH-Px的酶活性显著降低(P < 0.05)，精子细胞中MDA含量显著增加(P < 0.05)。
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表 5 番茄红素对冷冻-解冻后秦川牛精子抗氧化能力的影响 Table 5 Sperm oxidation resistance of frozen-thawed semen after using lycopene dilution in Qinchuan bull |
种公牛日粮中添加番茄红素对秦川牛精液品质的影响见表 6，在种公牛日粮中添加番茄红素对秦川牛精液品质有着积极的影响，在饲喂番茄红素60 d后与饲喂之前相比，秦川种公牛活动精子率和前向运动精子率都有着显著提高(P < 0.05)，精子畸形率显著降低(P < 0.05)，其中，饲喂番茄红素后活动精子率提高了13.20%，前向运动精子率提高了13.74%，精子畸形率下降了9.01%，这说明日粮中添加番茄红素能够提高秦川种公牛的繁殖性能。
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表 6 番茄红素对秦川牛精液品质的影响 Table 6 Effects of lycopene on semen quality of Qinchuan bulls |
表 7显示，日粮中添加番茄红素对秦川种公牛血清中SOD、CAT和GSH-Px酶活性及MDA含量有显著影响(P < 0.05)。与日粮中添加番茄红素饲喂之前相比较，饲喂后种公牛血清中SOD、CAT和GSH-Px酶活性显著增强(P < 0.05)，血清中MDA含量显著降低(P < 0.05)；日粮中添加番茄红素能够提高种公牛的抗氧化性能，对机体起到很好的保护作用。
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表 7 番茄红素对秦川牛血清抗氧化性能的影响 Table 7 Effects of lycopene on serum antioxidant function of Qinchuan bulls |
精液冷冻过程会造成精子氧化应激，精子细胞中所有的成分，包括脂类、蛋白质、核酸和糖，都是氧化应激的潜在目标[23]。氧化应激引起改变的比例取决于活性氧(ROS)的性质和浓度、暴露于ROS的时间，但也取决于细胞外因素，如温度、氧气和环境组成(离子、蛋白质、ROS清除剂)[24]。在冷冻解冻的精液中，质膜和顶体外膜对低温最敏感，氧化应激通常会导致精子活力丧失、质膜肿胀和顶体膜起泡，并改变精子质膜的通透性。在冻融过程中，当ROS大量产生时，质膜的结构损伤增加了对脂质过氧化的敏感性。精浆中含有大量的抗坏血酸、α-生育酚、丙酮酸、谷胱甘肽、牛磺酸等非酶类抗氧化剂，这些都是精子细胞用来抵御ROS攻击的最重要的保护元素，但这些元素有限，不足以保护精子在冷冻过程中的损伤[25-26]。天然抗氧化剂在精液稀释和冷冻中作为介质，如α-生育酚和抗坏血酸，对冷冻保存的牛精子细胞的代谢活性和细胞活力具有保护作用[27-28]。
本研究的体外试验中，在精液冷冻保存之前，通过在牛精液冷冻稀释液中添加0、1、2、3、4 μmol·L-1浓度的番茄红素，探究其对冷冻-解冻后秦川种公牛精子的活力、线粒体活性、生理结构状态(质膜、顶体)及精子抗氧化能力的影响。结果发现，LYC能够显著提高冷冻-解冻后秦川种公牛精子的运动性能、生理结构的完整性和抗氧化能力，且LYC的最适添加浓度为2 μmol·L-1。这与戴小凡[29]在人的精液冷冻保存中发现的番茄红素能够改善冷冻-解冻后精液质量的结果是一致的；王艳华等[26]在山羊的精液冷冻保存中添加1 μmol·L-1的番茄红素对山羊精液具有显著的保护作用，可以提高山羊冻精品质；王捷[19]在猪的精液冷冻保存中添加2 μmol·L-1的番茄红素能够显著提高冷冻-解冻后猪精子的运动性能和生理结构的完整性，进而达到提高猪精液冷冻保存效果的目的，且通过在猪胚胎发育的体外培养液中添加番茄红素的研究发现，番茄红素能够影响猪胚胎发育能力和线粒体依赖性细胞凋亡途径，在整个体外授精期间补充番茄红素可通过调节氧化应激和线粒体依赖性细胞凋亡来增强猪的胚胎发育[30]。同时，本研究获得的番茄红素对冷冻-解冻后秦川牛精子活力、生理结构和精子抗氧化能力的提高作用的结果与之前报道的冷冻-解冻后其他品种和地区牛的结果相同[22, 31]，这表明牛的品种和饲养气候可能不影响番茄红素对精液冷冻保存的提高作用。但番茄红素浓度过高，会显著抑制冷冻-解冻后精子的运动性能和精子生理结构的完整性，并对冷冻-解冻后精子的抗氧化性能有影响，究其原因可能是高浓度的番茄红素具有一定的毒害作用，高浓度的番茄红素会导致其抗氧化活性作用转变为促氧化活性[32]。
同时，随着现代畜牧养殖业的发展，畜禽集约化程度不断提高，氧化应激对畜禽生产的危害越来越严重，造成动物机体免疫力、生理机能、生产性能和繁殖性能降低，引发群体病变，甚至死亡[33-34]。大量研究证实了抗氧化剂作为畜禽日粮添加剂在畜牧业养殖中的重要性，这些抗氧化物质可以有效调控动物机体由于氧化应激产生的危害，从而保障动物机体细胞内环境的稳态和生理机能的正常运行[35]。研究发现，在蛋鸡和肉仔鸡饲粮中外源添加抗氧化剂叔丁基对苯二酚、茶多酚、维生素E、吡咯喹啉醌、葡萄原花青素、硫辛酸、乙酰肉碱和肌肽可以改善和提高肉品质，并通过提高血浆中的抗氧化酶活性来提高动物机体的抗氧化能力[36-37]，且在肉鸡饮水中添加0.5 g·L-1番茄红素对精液质量、受精率和免疫力都有积极的作用[38]；而在大鼠静脉曲张引起不育症的研究中显示，精索静脉曲张组给予10 mg·kg-1的番茄红素可以通过增加抗氧化活性和减少活性氧来保护精子免受活性氧和精子DNA损伤，可防止氧化应激引起的大鼠睾丸组织结构和功能损害以及精子质量降低[39]；通过饲喂5.0% 的番茄渣可提高猪肉的氧化稳定性，靳天宇等[40-41]在绵羊的日粮中添加抗氧化剂亚硝酸钠后发现绵羊的精子活力、运动速度和线粒体活性都得到提升，提高了绵羊的精液品质。本研究发现，在秦川种公牛日粮中添加15 mg·kg-1 BW番茄红素后能够显著提高种公牛的精子活率和精子活力，降低精子畸形率，并对机体血清中的抗氧化性能有显著的提高作用。这些均说明了番茄红素可以作为日粮添加剂来改善精液品质，提高繁殖性能。
4 结论番茄红素对秦川种公牛精液冷冻保存和鲜精精液品质具有积极的作用。其中在秦川牛精液冷冻保存过程中添加适量的番茄红素可以显著提高冷冻-解冻后精子的活力、生理结构完整性(顶体、质膜和线粒体)以及抗氧化酶(CAT和GSH-Px)活性，显著降低精子中MDA含量，且最适添加浓度为2 μmol·L-1；饲喂15 mg·kg-1 BW番茄红素后，秦川种公牛的精子活力显著提高，精子畸形率显著降低，血清中MDA含量显著降低，3种抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)活性显著增加，表明番茄红素改善精液品质和提高种公畜的繁殖性能可能是通过提高机体的抗氧化能力来实现的。
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(编辑 郭云雁)