2. 中国农业科学院兰州兽医研究所 兰州大学动物医学与生物安全学院 家畜疫病病原生物学国家重点实验室，兰州 730000;
3. 河北科技师范学院动物科技学院 河北省预防兽医学重点实验室，秦皇岛 066004;
4. 深圳真瑞生物科技有限公司，深圳 518000
, MA Xusheng2, DAI Junfei2, WANG Yang2, LI Qian2, BAI Heng1, MAO Tiantian1, LIU Yongsheng3, DING Long4, CHEN Haohan4, CHEN Siyan4, RAO Yufei4, JIA Ning1
, ZHANG Jie2,3, ZHENG Haixue2, LIU Xiangtao2
2. State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology, College of Veterinary Medicine, Lanzhou University, Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730000, China;
3. Hebei Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine, College of Animal Science and Technology, Hebei Normal University of Science & Technology, Qinhuangdao 066004, China;
4. Shenzhen Zhenrui Biological Science and Techonology Co. Ltd., Shenzhen 518000, China
非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASF virus, ASFV)感染引起家猪和野猪的一种急性、出血性的烈性传染病[1]。动物感染不同的ASFV毒株产生不同临床症状，从亚临床型到高度致死型[2]。2018年，我国首次爆发ASF疫情之后，该病在我国迅速蔓延，对我国养猪业的发展和国内动物食品安全造成了严重威胁[3]。ASFV的基因组庞大，且对其病毒基因的功能注释仍不完全清楚，是导致目前没有获得有效疫苗的重要原因之一。目前，该病仍在非洲、欧洲和亚洲持续传播，防控形势至今仍异常严峻[4]。因此，对于ASFV的基因进行功能注释显得尤为重要。
ASFV是一种大型、高度结构化的包膜DNA病毒，具有双链DNA基因组(180~190 kb)，编码至少160个开放阅读框(ORFs)，包括结构蛋白、免疫逃避蛋白、病毒复制相关蛋白、多基因家族蛋白和许多功能未知蛋白[5]。ASFV基因组中大约30%的基因具有多个拷贝，称为多基因家族(multigene families，MGF)，包括MGF100、MGF110、MGF300、MGF360和MGF505/530，由于MGF基因插入和删除，ASFV基因组长度在不同毒株间存在差异[6]。不同ASFV毒株的基因组含有数目不同的MGF，这些基因与ASFV的嗜性、天然免疫逃逸及病毒毒力相关[7]。有研究报道，在强毒力ASFV Georgia 2007/1(ASFV-G)中特异性地删除包括MGF360-13L在内的6个MGF基因后免疫家猪，能够有效提高免疫猪受强毒株ASFV-G感染的存活率[8]，这提示了MGF360-13L在ASFV致病过程中可能具有重要功能。目前，已有研究证明MGF360-13L能够通过cGAS-STING信号通路抑制宿主Ⅰ型干扰素的产生[9]，但该研究仅通过外源表达的方法研究了蛋白功能。在实际情况中，ASFV编码多种蛋白，其中许多蛋白间存在相互作用，因此，利用单基因缺失株研究MGF360-13L基因功能具有重要意义。
炎症反应是天然免疫的重要组成部分，与病毒感染后的发病进程和致病力有关[10]。在猪体内，ASFV主要在血液中的单核细胞和组织中的巨噬细胞中复制，不同ASFV感染巨噬细胞后，促炎性细胞因子的分泌活化能力也存在差异[11]。而目前关于ASFV调控机体炎症反应相关研究仍然不完全清楚，因此对于ASFV调控炎症反应的研究势在必行。
1 材料与方法 1.1 试验材料与主要试剂非洲猪瘟基因II型野生毒株ASFV CN/GS/2018由兰州兽医研究所P3实验室分离并保存；猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages, PAMs)和猪骨髓巨噬细胞(porcine bone marrow macrophages，BMDM)取自40日龄仔猪；pAVX1真核表达载体、大肠杆菌DH5α感受态细胞、293T人源上皮细胞和IL-1β、IL-6、TNF-α和GAPDH qPCR检测引物[12]由兰州兽医研究所口蹄疫与新发流行病学团队保存；DMEM培养基、1640培养基、胎牛血清购自Gibco公司；ELISA检测试剂盒购自欣博盛公司；质粒大提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒购自Promega生物科技有限公司；脂质体转染试剂lipofectamine2000购自Invitrogen公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG购于中杉金桥公司；一步法TB GreenⓇ RT-PCR定量检测试剂盒、PrimeSTARⓇ HS高保真PCR酶购自TaKaRa公司；ClonExpress II One Step Cloning Kit重组酶购自南京诺唯赞生物公司。
1.2 ASFV MGF360-13L生物信息学分析以ASFV CN/GS/2018全基因组序列中MGF360-13L基因为分析对象，使用ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)分析MGF360-13L蛋白的亲疏水性；使用TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)预测MGF360-13L蛋白的跨膜结构；用SignalP-5.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在线预测蛋白质的信号肽；利用PredictProtein在线工具(http://www.predictprotein.org/)对蛋白质二级结构进行预测；用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)的同源建模方法构建蛋白质三级结构模型。通过EBI(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)对基因II型ASFV的MGF360-13L基因进行氨基酸序列比对，利用MEGA7.0.26构建系统进化树。
1.3 ASFV MGF360-13L基因真核表达质粒的构建及验证根据ASFV CN/GS/2018毒株序列设计含有真核表达载体pVAX1同源臂的MGF360-13L全基因扩增引物F1/R1(表 1)，并在目的基因N端添加Flag标签序列；以提取的ASFV CN/GS/2018基因组为模板，使用PrimeSTARⓇHS高保真PCR酶扩增MGF360-13L基因片段，扩增PCR反应程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸70 s，34次循环；72 ℃总延伸5 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收。使用ClonExpress II One Step Cloning Kit连接酶将载体与目的片段进行连接，37 ℃连接30 min，构建完成的重组质粒pVAX1-MGF360-13L送至兰州天启基因生物科技有限公司测序，测序正确的重组质粒转染至293T细胞中进行蛋白表达验证。
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表 1 本研究用引物 Table 1 Primers used in this study |
单基因缺失毒株ASFV-ΔMGF360-13L由亲本毒株ASFV CN/GS/2018与重组转移载体p72mCherry MGF360-13L同源重组生成。p72mCherry MGF360-13L重组转移载体包含MGF360-13L基因上、下游各约1 000 bp的同源臂序列(对应病毒基因组位置分别为29 584~20 594 bp和31 657~32 657 bp)，上、下游同源臂序列间为p72启动子和mCherry基因。分别设计上游同源臂扩增引物360-13L-L-F2/R2、下游同源臂扩增引物360-13L-R-F3/R3和p72mCherry荧光报告盒扩增引物360-13L-mCherry-F4/R4(表 1)，扩增同源臂和p72mCherry荧光基因，使用ClonExpress II One Step Cloning Kit重组酶将上述3个片段与线性化载体pUC19进行连接，将构建完成的p72mCherry-MGF360-13L进行单酶切鉴定后测序验证。
1.5 ASFV-ΔMGF360-13L缺失毒制备将测序正确的p72mCherry MGF360-13L转染BMDM细胞，1 h后感染ASFV CN/GS/2018毒株，使ASFV CN/GS/2018与p72mCherry MGF360-13L在细胞内进行同源重组，生成重组病毒ASFV-ΔMGF360-13L，感染48 h后通过观察mCherry荧光，挑取具有mCherry荧光的BMDM，通过连续14轮极限稀释纯化得到重组ASFV-ΔMGF360-13L。为检测制备缺失毒株的纯度，根据MGF360-13L基因设计引物360-13L-F5/R5(表 1)；分别以提取的ASFV CN/GS/2018和ASFV-ΔMGF360-13L基因组为模板，进行PCR扩增，反应程序: 95 ℃预变性3 min; 95 ℃变性30 s，62 ℃退火15 s，72 ℃延伸70 s，34次循环；72 ℃总延伸5 min。将提取的ASFV-ΔMGF360-13L基因组送基因公司进行测序。
1.6 ASFV-ΔMGF360-13L体外生长曲线测定比较ASFV-ΔMGF360-13L与ASFV CN/GS/2018的体外生长趋势。将PAMs细胞铺于96孔板中过夜培养形成单层细胞，并以MOI=0.01的ASFV-ΔMGF360-13L与ASFV CN/GS/2018感染细胞，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱，吸附1 h后去除接种物，用PBS冲洗3次，加入1.5 mL培养基，在37 ℃、5% CO2细胞培养箱中孵育2、24、48、72和96 h，在感染后不同时间点收取样品，冻融后，在PAMs细胞上进行病毒滴定，通过血细胞吸附试验(HAD)计算病毒滴度。
1.7 ASFV-ΔMGF360-13L感染BMDM细胞后炎性因子的检测为了探究ASFV-ΔMGF360-13L与ASFV CN/GS/2018在感染巨噬细胞后细胞炎性因子表达水平是否相同；将BMDM细胞铺于6孔板中过夜培养形成单层细胞，并以MOI=1分别感染ASFV-ΔMGF360-13L与ASFV CN/GS/2018，在37 ℃、5% CO2细胞培养箱中各分别孵育4、8、12、24、48 h后收取细胞样品；用TRIzol总RNA提取试剂提取总RNA，使用一步法TB GreenⓇRT-PCR定量检测试剂盒检测细胞IL-1β、IL-6和TNF-α炎症因子的mRNA水平。荧光定量PCR反应条件：42 ℃反转录5 min、95 ℃预变性10 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 40 s，40次循环；使用ELISA检测试剂盒检测上清样品中分泌的IL-1β、IL-6和TNF-α含量；并用qPCR检测病毒基因组拷贝数[13]。
1.8 生物安全涉及ASFV病原的操作及样品的制备在中国农业科学院兰州兽医研究所P3实验室开展，试验中所产生的废弃物均经过灭菌杀毒后无害化处理。
2 结果 2.1 MGF360-13L基因生物信息学分析利用ProtScale软件对MGF360-13L基因做亲水性分析，纵坐标负值表示亲水区，可见组成MGF360-13L蛋白的氨基酸多集中在正值，整体表现为疏水性(图 1A)；TMHMM Server v.2.0软件预测表明，MGF360-13L蛋白不存在跨膜区(图 1B)；使用SignalP-5.0 Server软件预测发现，MGF360-13L蛋白S值为0.110 1(S>0.5，则判断为分泌蛋白并且有信号肽)，说明该蛋白不是分泌蛋白且不存在信号肽(图 1C)；预测MGF360-13L蛋白二级结构中α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲分别占52.12%、0.00%、5.38%和27.20%，α-螺旋和无规则卷曲比例高则有助于蛋白质的稳定性；其三级结构如图 1D，有α-螺旋结构富集域, 以β-转角和无规卷曲连接形成其特定结构，与二级结构预测结果一致。通过EBI对比不同ASFV的MGF360-13L蛋白氨基酸序列，发现在不同基因II型病毒分离株中MGF360-13L蛋白序列相对保守，从系统进化树可知我国流行的ASFV基因II型毒株与ASFV-G关系密切(图 2)。
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A.蛋白亲疏水性分析；B.跨膜区预测；C.信号肽预测；D.三级结构预测 A. Hydrophilic analysis; B. Prediction of transmembrane region; C. Signal peptide prediction; D. Tertiary structure prediction 图 1 MGF360-13L生物信息学分析 Fig. 1 Bioinformatics analysis of MGF360-13L |
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图 2 ASFV MGF360-13L基因系统进化树 Fig. 2 Phylogenetic tree of ASFV MGF360-13L gene |
使用ASFV CN/GS/2018基因组DNA为模板，通过PCR方法扩增目的片段MGF360-13L，经1%的琼脂糖凝胶电泳检测可见与预期目的片段大小相同(图 3A)。将连接后的载体进行单酶切(HindⅢ)验证，条带大小与预期条带大小相一致，同时送测序验证(图 3B)；测序正确后提取表达质粒，转染至293T细胞，培养24 h后利用Western blot检测蛋白表达，结果显示，在41 ku处出现特异性条带，ASFV MGF360-13L基因外源表达成功(图 4)。
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A. MGF360-13L基因条带扩增: M.DNA相对分子质量标准；1.阴性对照2.扩增目的基因条带(1 063 bp)。B.重组质粒PCR扩增：M.DNA相对分子质量标准；1.载体对照(2 999 bp)；2.重组质粒扩增条带(4 062 bp) A. Amplification of MGF360-13L; M. DNA relative molecular weight standard: 1. Negative control; 2. Amplification of the target gene(1 063 bp). B. PCR amplification of recombinant plasmid: M. DNA relative molecular weight standard; 1. Vector control(2 999 bp); 2. Amplification band of recombinant plasmid(4 062 bp) 图 3 MGF360-13L基因PCR扩增及载体酶切验证 Fig. 3 PCR amplification and vector enzyme digest verification of MGF360-13L gene |
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1.空白对照；2.转染pAVX1-MGF360-13L在细胞中表达 1. Blank control; 2. Transfected pVAX1-MGF360-13L was expressed in cells 图 4 质粒pAVX1-MGF360-13L表达鉴定 Fig. 4 Expression and identification of plasmid pAVX1-MGF360-13L |
为进一步研究MGF360-13L基因在病毒复制过程中的功能，使用同源重组方法构建基因缺失毒株ASFV-ΔMGF360-13L(图 5)。首先扩增同源臂及荧光基因片段(图 6A)，构建重组转移载体p72mCherry-MGF360-13L，酶切验证(HindⅢ)符合预期大小后质粒测序(图 6B)。将测序正确的重组转移载体转染BMDM细胞，1 h后感染ASFV CN/GS/2018。通过观察荧光判断病毒重组效率及纯化效率(图 7)，连续纯化多代，其间收集细胞病毒提取基因组DNA，利用PCR鉴定病毒纯度，最终经过14轮纯化获得单纯的MGF360-13L单基因缺失毒株(图 6C)。对经过PCR验证后的基因缺失毒株进行测序验证，结果显示ASFV-Δ MGF360-13L与ASFV CN/GS/2018比较，于MGF360-13L基因位置缺失1 063个核苷酸(MGF360-13L)，插入1 294个核苷酸(p72mCherry)，表明ASFV-ΔMGF360-13L毒株构建成功。
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图 5 ASFV-ΔMGF360-13L构建策略示意图 Fig. 5 The schematic diagram of ASFV-ΔMGF360-13L construction strategy |
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A.同源臂片段PCR扩增: M.DNA相对分子质量标准；1、3、5. 阴性对照；2. MGF360-13L上游同源臂扩增(1 000 bp)；4. MGF360-13L下游同源臂扩增(1 000 bp)；6.p72mCherry基因扩增(1 200 bp)。B.重组质粒PCR扩增: M. DNA相对分子质量标准；1. 载体对照(2 300 bp)；2. 重组质粒扩增条带(5 499 bp)。C. ASFV-ΔMGF-360-13L纯度PCR鉴定: M. DNA相对分子质量标准；1. 阴性对照；2.ASFV-ΔMGF360-13L基因组DNA为扩增模板，无条带；3. ASFV CN/GS/2018基因组DNA为扩增模板，扩增出目的基因MGF360-13L条带(1 063 bp) A. PCR amplification of homologous arm fragment: M. DNA relative molecular weight standard; 1, 3, 5. Negative control; 2. Upstream homologous arm amplification of MGF360-13L(1 000 bp) 4. Downstream homologous arm amplification of MGF360-13L(1 000 bp); 6. p72mCherry gene amplification(1 200 bp). B.PCR amplification of recombinant plasmid: M. DNA relative molecular weight standard; 1. Carrier control(2 300 bp); 2. Amplification band of recombinant plasmid (5 499 bp). C.ASFV-ΔMGF-360-13L purity PCR identification: M. DNA relative molecular weight standard; 1. Negative control; 2. ASFV-ΔMGF360-13L genomic DNA as amplification template, without bands; 3.ASFV CN/GS/2018 genomic DNA was used as the amplification template, and the target gene MGF360-13L band was amplified(1 063 bp) 图 6 重组转移载体p72mCherry-MGF360-13L构建及缺失毒纯度鉴定 Fig. 6 Construction of recombinant transfer vector p72mCherry-MGF360-13L and purity identification of the gene deleted strain |
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Bright.自然光观察结果；mCherry.荧光观察结果；Merge.合并观察结果；F1. 第一轮纯化结果；F5. 第五轮纯化结果；F9. 第九轮纯化结果；F14. 第十四轮纯化结果 Bright. Natural light observation results; mCherry. Fluorescence observation results; Merge. Combined observation results; F1. The first round of purification rersults; F5. The fifth round of purification results; F9. The ninth round of purification results; F14. The fourteenth round of purification results 图 7 ASFV-ΔMGF360-13L纯化结果 Fig. 7 Purification result of ASFV-ΔMGF360-13L |
用MOI=0.01的ASFV-ΔMGF360-13L与ASFV CN/GS/2018分别感染PAMs细胞，分别在感染2、24、48、72和96 h收取样品，冻存于－70 ℃冰箱，并用解冻后的裂解液测定病毒滴度。结果显示，ASFV-ΔMGF360-13L与ASFV CN/GS/2018在不同时间点的病毒量无显著差异(图 8)。
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A. HAD50试验显微镜观察结果: Bright. 自然光观察结果；mCherry. 荧光观察结果；Merge. 合并观察结果；Mock. 阴性对照；ASFV CN/GS/2018. 亲本毒株；ASFV-ΔMGF360-13L. 缺失毒株；B. ASFV-ΔMGF360-13L和ASFV CN/GS/2018体外生长特性比较。ns. 差异不显著(P>0.05) A.HAD50 experimental microscope observation: Bright. Natural light observation results; mCherry. Fluorescence observation results; Merge. Combined observation results; Mock. Negative control; ASFV CN/GS/2018. Parent strain; ASFV-ΔMGF360-13L. The gene deleted strain. B.Comparison of in vitro growth characteristics between ASFV-ΔMGF360-13L and ASFV CN/GS/2018. ns. No significant difference (P > 0.05) 图 8 血吸附试验观察结果与病毒体外生长比较 Fig. 8 The results of blood adsorption experiment were compared with the growth of virus in vitro |
用MOI=1的ASFV-ΔMGF360-13L与ASFV CN/GS/2018分别感染BMDM细胞，在感染后4、8、12、24、48 h分别收集样品，提取细胞总RNA，测定总RNA浓度，使用qPCR方法检测细胞IL-1β、IL-6和TNF-α炎性因子相对表达量，采用ELISA检测上清液中炎性因子的含量。结果显示，在ASFV-ΔMGF360-13L与ASFV CN/GS/2018感染后4 h时，检测细胞产生的IL-1β、IL-6和TNF-α炎性因子mRNA水平和蛋白水平无显著性差异；在感染12 h后炎症因子表达mRNA水平和蛋白水平存在显著性差异(图 9A~F，P＜0.05)。qPCR方法测定病毒拷贝数在不同时间点的增长(图 9G)。
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A、C、E. 感染后4、8、12、24、48 h时IL-1β、IL-6和TNF-α相对mRNA表达量；B、D、F. 感染后4、8、12、24、48 h时IL-1β、IL-6和TNF-α的ELISA结果；G. 不同时间点ASFV拷贝数；ns. 差异不显著(P＞0.05)；*、**、***. 差异显著(P < 0.05) A, C, E. The relative mRNA expression levels of IL-1β, IL-6 and TNF-α at 4, 8, 12, 24 and 48 h after infection; B, D, F. The ELISA results of IL-1β, IL-6 and TNF-α at 4, 8, 12, 24 and 48 h after infection; G. ASFV copy number at different time points. ns. No significant difference (P > 0.05);*, **, ***. Significant difference(P < 0.05) 图 9 细胞炎性因子相对表达量及病毒拷贝数检测 Fig. 9 Detection of relative expression level of cytokines and virus copy number |
目前，ASFV仍然威胁着我国的养猪业，严重影响农业经济的发展。由于免疫环境复杂且涉及多种免疫机制和免疫决定因素，ASFV疫苗的研发具有重重阻碍，目前尚没有有效的疫苗，只能通过动物检疫和屠宰来控制疫情。
ASFV基因组编码多达150到200个蛋白，其中大多数还没有经过功能鉴定，ASFV编码的毒力基因、宿主-病毒相互作用方式和发病机制仍远未被了解[14]。因此，识别病毒蛋白功能，解析病毒在体内和体外复制的规律，以及对病毒毒力基因的研究具有重要意义，是研发ASFV疫苗的一个至关重要的环节。
减毒活疫苗是有效开发ASF疫苗的方法之一[15]。研究发现，在高毒力ASFV-G中分别删除9GL、UK和I177L等基因能够致弱ASFV-G的致病性，其缺失毒株在免疫猪只后受到同源亲本ASFV-G攻击时获得了一定的保护[16-17]。也有研究发现，在高毒力ASFV-G中删除MGF360-1L、X69R、J64R基因时并不减弱病毒毒力，与亲本ASFV-G感染时引起的症状无明显区别[18-19]。因此，在庞大的ASFV基因组筛选有效的毒力基因，是成功制备ASFV减毒活疫苗的关键。
现已知MGF家族蛋白在病毒的转录、翻译和免疫逃逸等多个阶段发挥重要作用。研究发现，在高毒力ASFV-G中删除MGF360和MGF505部分基因以及在高毒力ASFV CN/GS/2018中删除MGF110-9L、MGF505-7R基因可以减弱亲本ASFV毒力[8, 12-13]。因此，本研究以MGF360-13L为对象进行研究。通过生物信息学分析，发现MGF360-13L蛋白为亲水性蛋白，且不具有跨膜区，也不是分泌蛋白；成功构建了外源表达质粒pVAX1-MGF360-13L，在293T细胞中成功表达MGF360-13L蛋白；通过同源重组方法构建了单基因缺失毒株ASFV-ΔMGF360-13L，并通过生长曲线的绘制证明其在病毒复制中的非必需性。
ASFV有严格的细胞噬性，其主要靶细胞是巨噬细胞和单核细胞，也有报道其在树突状细胞中复制[20]。这些细胞类型在先天免疫反应中发挥着关键作用[21]。其中，巨噬细胞是专门识别和破坏病原体并启动炎症反应的关键，ASFV感染巨噬细胞会诱导炎症因子表达和促进细胞凋亡[22]。有研究发现，ASFV病毒蛋白L83L能够特异性结合宿主基因IL-1β, L83L基因缺失的ASFV毒株毒力并没有减弱[23]，这也提示了ASFV致病过程的复杂性。本研究通过构建基因缺失毒株，证实了MGF360-13L能够抑制宿主炎性因子的表达。
4 结论在本研究中，使用生物信息学软件分析了ASFV MGF360-13L基因的初步信息，成功构建了外源表达质粒pVAX1-MGF360-13L，构建了单基因缺失毒株ASFV-ΔMGF360-13L，证明该基因为ASFV非必需基因，在感染BMDM细胞时，缺失毒株刺激细胞产生的IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性因子水平高于亲本毒株，证明MGF360-13L基因在AFSV感染BMDM细胞产生炎症因子应答反应具有一定的抑制作用。本文研究为进一步揭示ASFV MGF360-13L基因功能做了铺垫。
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(编辑 范子娟)