细菌性脑膜炎是一种较为严重的感染性疾病，会危害人类健康，影响畜禽养殖业的健康发展[1]。在人医方面，细菌性脑膜炎是十大引发高死亡率的感染性疾病之一，且大部分幸存者会有不同程度的神经系统后遗症[2-3]。在兽医方面，养殖动物由于患脑膜炎失去了其经济价值，给畜牧业造成较大经济损失。
鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer，RA) 是一种革兰阴性菌，主要感染雏鸭，导致鸭浆膜炎和脑膜炎。RA也可以感染鸡、火鸡、鹅、部分野生水禽等多种禽类。感染RA的动物，尤其是易感鸭会出现典型的神经症状，包括头颈震颤或痉挛性点头、共济失调、头颈歪斜、角弓反张、转圈等，最后衰竭死亡[4]。目前已经确定的RA血清型有21种，但每种血清型之间缺乏交叉保护，不利于疫苗免疫的普及。养鸭场在日常饲养中添加抗生素依然是最常用的防治RA的手段，但随着抗生素的应用，耐药菌株不断出现和播散[5]，给RA病的防控带来极大挑战。基于此，筛选并鉴定RA突破血脑屏障(blood brain barrier，BBB)而导致脑膜炎的相关毒力因子，研发出针对关键毒力因子的高免血清，并将其作为阻断RA感染脑组织的一种生物制品，是一种可行的研究思路。
已有的研究对RA的致病机制了解甚少，仅仅发现了几种与RA毒力相关的基因，包括OmpA[6]、VapD[7]、Yb2株的AS87_04050(参与脂多糖合成)[8]和AS87_03730[9]、CH-1株的B739_2187[10]和IX型分泌系统组分[11]。研究者发现, 这些基因缺失或突变后，菌株对雏鸭的致病力有不同程度的减弱，但并未说明这些毒力基因是否与RA导致的脑膜炎相关。对于介导RA突破BBB感染脑组织，进而导致脑膜炎的相关毒力因子的研究还未见报道。
当前研究表明，烯醇化酶(Enolase)是介导猪链球菌2型突破BBB的毒力因子[12-14]。肺炎链球菌Enolase除了利用宿主的纤溶系统促进病原对宿主的入侵外，还可与宿主细胞来源的胞外RNA(eRNA)结合，进而促进细菌对肺泡上皮细胞的入侵[15]。金黄色葡萄球菌Enolase定位于细菌表面，与宿主细胞外基质的一种主要成分层黏连蛋白相互作用，参与细菌的扩散和侵染过程[16]。
迄今为止，关于RA Enolase的生物学功能还未见报道。本研究通过构建enolase基因缺失株和回复株，测定菌株的生长速率，对鸭脑微血管内皮细胞(DBMEC)的黏附和入侵能力，感染动物的血液及脑组织载菌量，以期明确enolase基因在RA突破BBB中是否发挥作用。
1 材料和方法 1.1 材料1.1.1 菌株和质粒 鸭疫里默氏杆菌RA-LZ01菌株(GenBank登录号：NZ_CP045564.1)保存于中国农业科学院兰州兽医研究所草食动物细菌病创新团队；大肠杆菌ATCC25922购自美国菌种保藏中心(American type culture collection)；大肠杆菌X7213和自杀质粒pRE112均购自NTCC国家典型培养物保藏中心；穿梭质粒pCPRA由本实验室构建；Trans-1感受态细胞购自北京全式金公司。
1.1.2 培养基和主要试剂 胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)、胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)均购自美国BD difcoTM公司；LB肉汤购自英国Oxoid公司；琼脂粉购自北京Solarbio公司；2, 6-二氨基更二酸(DPA)购自东京化成工业株式会社；抗生素购自北京Solarbio公司；限制性内切酶SacI、SphI，质粒提取试剂盒，胶回收试剂盒均购自TaKaRa公司；0.22 μm无菌硝酸纤维素膜和过滤器购自美国Millipore公司。
1.1.3 主要仪器 紫外分光光度计和台式高速离心机购自美国Beckman公司；PCR热循环仪购自杭州博日科技公司；CO2恒温培养箱购自美国Thermo公司；摇床购自上海苏坤实业有限公司；凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司。
1.2 方法1.2.1 引物设计 引物均用DNASTAR-Editseq软件进行设计，由西安擎科生物有限公司合成。本研究中所使用的引物和扩增目的片段如表 1所示。
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表 1 PCR引物名称和序列 Table 1 PCR primers and their sequences used in this study |
1.2.2 鸭脑微血管内皮细胞(DBMEC)的培养和鉴定 从樱桃谷鸭胚中分离出大脑皮质，除去脑膜等，反复用PBS冲洗干净，将组织块剪成约0.1 cm3的小块，置于培养瓶中，加入2 mL DBMEC完全培养基，确保不能将组织块悬浮，倒置于5% CO2细胞培养箱中2 h，然后将细胞培养瓶正置，待组织块周围生长的细胞融合成片，即可去除组织块，用胰蛋白酶消化细胞，重新铺瓶，传3~4代，得到符合BMEC形态的细胞。利用血管假性血友病因子(vWF)免疫荧光染色进行鉴定，得到合适的DBMEC；SV40过表达慢病毒转染DBMEC，利用嘌呤霉素(2 mg·L-1)的筛选培养基进行筛选。以未转染的DBMEC细胞作为对照，该细胞被全部杀灭，而在同一时间点存活的转染了SV40过表达慢病毒的细胞为转染成功的DBMEC，将细胞传代至12代以上，得到永生化的DBMEC。
1.2.3 enolase基因缺失株的构建 如表 1所示，以亲本株RA-LZ01菌株基因组作为模板，用Enolase-p1/Enolase-p2和Enolase-p5/Enolase-p6引物扩增出enolase基因的Enolase-UP和Enolase-DO；以LJW-2菌株基因组为模板，用ErmF-p3/ErmF-p4引物扩增出ermF抗性基因；通过重叠PCR将Enolase-UP、ermF抗性基因和Enolase-DO依次进行融合，构建出打靶片段；用SacΙ和SphΙ将打靶片段克隆进自杀质粒pRE112，转化进大肠杆菌X7213，利用含DPA和氯霉素的LB平板筛选阳性供体菌，再与RA-LZ01菌株共培养，利用含红霉素和多黏菌素B的TSA平板筛选缺失株，具体方法参考文献[17-18]。得到的菌株用RA保守引物OmpA-F/OmpA-R、Enolase-p1/Enolase-p6、ErmF-p3/ErmF-p4、Enolase-F/Enolase-R进行PCR鉴定，并对Enolase-p1/Enolase-p6扩增得到的片段进行测序，得到的enolase基因缺失株命名为ΔEnolase。
1.2.4 enolase基因回复株的构建 用表 1中cEnolase-p1/cEnolase-p2引物，PCR扩增出pro+Enolase基因目的条带(含有enolase基因的启动子)。将扩增出的片段用PstI和SphI克隆进pCPRA载体中，并转化进X7213菌株中，利用氨苄青霉素抗性筛选供体菌，与ΔEnolase共培养，再利用头孢西丁和多黏菌素B抗性筛选回复株，方法参考文献[17-18]。用引物cEnolase-p1/cEnolase-p2、ErmF-p3/ErmF-p4和OmpA-F/OmpA-R进行鉴定，得到的回复株命名为cΔEnolase。
1.2.5 菌株生长曲线的测定 测定亲本株RA-LZ01、缺失株ΔEnolase和回复株cΔEnolase 12 h内的生长曲线，具体方法参考文献[17-18]。
1.2.6 菌株对DBMEC的黏附和入侵 将亲本株RA-LZ01、缺失株ΔEnolase以及回复株cΔEnolase分别增菌至OD600约为1.0。用无菌0.01 mol·L－1 PBS(pH 7.4)调整至OD600值均为1.0，测定每株菌的菌落形成单位(colony forming unit，CFU)。用无血清内皮细胞基础培养基稀释菌液，用100个MOI(multiplicity of infection)将菌液(1 mL·孔－1)接入铺满了单层DBMEC的24孔细胞培养板中，置于37 ℃，5% CO2培养箱中孵育2 h，弃上清后用无菌PBS重复洗涤3次，每孔加入1 mL 0.25%的胰酶消化细胞，转移进1.5 mL离心管中，5 000 r·min－1离心后弃上清，并用PBS重复洗涤2次，加入0.5 mL无菌双蒸水，室温作用30 min，用PBS以10倍梯度稀释，涂板于含多黏菌素B的TSA平板上，在CO2培养箱中培养至长出单菌落，计算黏附菌株的CFU。每株菌做3个重复，进行3次独立试验。
另外，菌液(1 mL·孔－1)接入铺满单层DBMEC的24孔细胞培养板中后，置于37 ℃，5% CO2培养箱中孵育3 h，用无菌PBS充分洗涤3次后，加入用内皮细胞基础培养基稀释好的终浓度为100 mg·L-1的氨苄青霉素钠，0.5 mL·孔－1，孵育1 h后，弃上清，经过胰酶消化、PBS洗涤以及双蒸水作用后，测定入侵菌株的CFU。每株菌做3个重复，进行3次独立试验[19-20]。
黏附率和入侵率的计算：黏附率(%)=黏附菌株的CFU/接种菌株的CFU×100；入侵率(%)=入侵菌株的CFU/接种菌株的CFU×100[21]。菌株之间的差异以相对黏附率和入侵率进行比较，把亲本株RA-LZ01对DBMEC的黏附率和入侵率设置为100%[21]。
1.2.7 动物试验 30只7日龄樱桃谷雏鸭随机分为3组，每组10只，用亲本株RA-LZ01、缺失株ΔEnolase和回复株cΔEnolase对雏鸭进行攻毒，攻毒剂量为107 CFU·只－1，攻毒后40 h检测雏鸭血液和脑组织中的载菌量[4]。
1.3 统计学分析试验数据用GraphPad Prism 6.0软件进行分析，所有数据由3次重复试验结果得到，数据采用One-way ANOVA进行分析，P < 0.05认为差异显著，具有生物统计学意义。
2 结果 2.1 DBMEC的培养和鉴定利用vWF免疫荧光对传至12代以上的DBMEC进行鉴定后，对照细胞Vero无绿色荧光出现，而DBMEC观察到绿色荧光，说明DBMEC携带vWF，为血管内皮细胞，培养成功永生化的DBMEC，细胞形态如图 1所示。
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A. Vero细胞DAPI染色(200×)；B. Vero细胞vWF免疫荧光(200×)；C. DBMEC DAPI染色(200×)；D. DBMEC vWF免疫荧光(200×)；E. DBMEC(200×) A. DPAI staining of Vero cells (200×); B. vWF immunofluorescence from Vero cell (200×); C. DPAI staining of DBMEC (200×); D. vWF immunofluorescence from DBMEC (200×); E. DBMEC (200×) 图 1 DBMEC的鉴定 Fig. 1 Identification of DBMEC |
用Enolase-p1/Enolase-p6引物扩增出2 025 bp大小的目的条带(经测序确定为打靶片段)；用ErmF-p3/ErmF-p4引物扩增出801 bp大小的ermF基因；用OmpA-F/OmpA-R引物扩增出1 467 bp大小的目的条带；用Enolase-F/Enolase-R引物未扩增出条带，说明缺失株ΔEnolase构建成功(图 2A)。
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A. enolase基因缺失株ΔEnolase的鉴定；M. DL5000分子质量标准；1. Enolas-p1/Enolase-p6引物鉴定(2 025 bp)；2. ErmF-p3/ErmF-p4引物鉴定(801 bp)；3. OmpA-F/OmpA-R引物鉴定(1 467 bp)；4. Enolase-F/Enolase-R引物鉴定。B. enolase基因回复株cΔEnolase的鉴定；M. DL2000分子质量标准；1. cEnolase-p1/cEnolase-p2引物鉴定(1 829 bp)；2. OmpA-F/OmpA-R引物鉴定(1 467 bp)；3. ErmF-p3/ErmF-p4引物鉴定(801 bp) A. Identification of enolase gene deletion mutant ΔEnolase; M. DL5000 relative molecular mass standard; 1. Enolase-p1/Enolase-p6 primer identification (2 025 bp); 2. ErmF-p3/ErmF-p4 primer identification (801 bp); 3. OmpA-F/OmpA-R primer identification (1 467 bp); 4. Enolase-F/Enolase-R primer identification. B. Identification of the complemented strain cΔEnolase; M. DL2000 relative molecular mass standard; 1. cEnolase-p1/cEnolase-p2 primer identification (1 829 bp); 2. OmpA-F/OmpA-R primer identification (1 467 bp); 3. ErmF-p3/ErmF-p4 primer identification (801 bp) 图 2 enolase基因缺失株ΔEnolase和回复株cΔEnolase的鉴定 Fig. 2 Identification of enolase gene deletion mutant ΔEnolase and complemented strain cΔEnolase |
用cEnolase-p1/cEnolase-p2引物扩增出1 829 bp大小的目的条带(测序确定)；用ErmF-p3/ErmF-p4引物扩增出801 bp大小的ermF基因；用OmpA-F/OmpA-R引物扩增出1 467 bp大小的目的条带，说明回复株cΔEnolase构建成功(图 2B)。
2.3 生长曲线的测定与亲本株RA-LZ01相比，在测定的12 h内，缺失株ΔEnolase在4~10 h内的生长速率显著下降(P < 0.01, 图 3)；回复株cΔEnolase的生长速率与亲本株相比慢约1 h(达到基本一致的OD600 nm值的时间)，相较缺失株其生长速率稍有提高，但没有完全恢复。
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**. P＜0.01，下同 **. P < 0.01, the same as below 图 3 亲本株、缺失株及回复株生长曲线 Fig. 3 Growth curves of parent strain, deletion mutant and complemented strain |
与亲本株RA-LZ01相比，缺失株ΔEnolase对DBMEC的相对黏附率和入侵率均极显著降低(P < 0.001，P < 0.0001)，分别为亲本株黏附率的5.9%和入侵率的2.5%；回复株cΔEnolase显著恢复了对DBMEC的黏附能力，为亲本株黏附率的79.6%；几乎完全恢复了对DBMEC的入侵能力，为亲本株入侵率的97.5%(图 4)。
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*. P＜0.05；***. P＜0.001；****. P＜0.000 1；ns. 无显著差异。下同*. P < 0.05; ***. P < 0.001; ****. P < 0.000 1; ns. No significant difference. The same as below 图 4 RA-LZ01、ΔEnolase和cΔEnolase菌株对DBMEC的相对黏附率和入侵率 Fig. 4 Relative adhesion and invasion rates of RA-LZ01, ΔEnolase and cΔEnolase to DBMEC |
感染亲本株RA-LZ01、缺失株ΔEnolase及回复株cΔEnolase的雏鸭，其血液载菌量差异不显著；但感染ΔEnolase的雏鸭，其脑组织中的载菌量极显著降低(P < 0.01, 图 5)。
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A.血液载菌量；B.脑组织载菌量 A. The amount of bacteria in blood; B. Bacterial count in brain 图 5 RA-LZ01、ΔEnolase和cΔEnolase菌株感染雏鸭血液及脑组织载菌量的测定 Fig. 5 Determination of bacteria loads in blood and brain of duckling infected by RA-LZ01, ΔEnolase and cΔEnolase strains, respectively |
细菌导致宿主发生脑膜炎，首先要突破宿主的血脑屏障(BBB)，进而引起中枢神经系统感染和脑膜炎。BBB是指脑毛细血管壁与神经胶质细胞形成的血液与脑组织之间，以及由脉络丛形成的血液和脑脊液之间的屏障，BBB也是机体参与固有免疫的内部屏障之一[22-23]。BBB的细胞组分主要包括脑微血管内皮细胞(BMEC)、周细胞和星形胶质细胞。大量研究表明，BMEC是研究细菌突破BBB的经典模式细胞，以宿主的BMEC作为体外细胞模型，已经发现了多个与细菌侵袭血脑屏障相关的毒力因子[12-13, 20-21]。本研究成功培养了DBMEC，用于筛选并鉴定鸭疫里默氏杆菌侵袭鸭BBB的相关毒力因子。
Enolase是糖酵解过程中的关键酶，在细胞糖酵解过程中发挥催化作用，为细菌细胞的生长提供能量[24-25]，广泛存在于真核和原核生物中。Enolase有3种异构体(α、β、γ)，原核生物中一般仅存在α-enolase，因此多种细菌表面存在α-enolase，通常称为Enolase。现有研究表明，Enolase是多种细菌的毒力因子，可介导细菌与宿主靶细胞发生黏附和结合，在细菌感染宿主过程中发挥着重要作用。尤其是有研究表明，Enolase可与猪链球菌2型(SS2)的BMEC结合，直接介导SS2对宿主BBB的侵袭；还可以促进IL-8细胞因子的释放，增强BBB的通透性[12-14]。在肺炎链球菌中，Enolase除了能够利用宿主的纤溶系统促进病原对宿主的入侵外，还可与宿主细胞的胞外RNA(eRNA)结合，从而促进了细菌对肺泡上皮细胞的入侵[15]。对福赛斯坦纳菌Enolase的研究表明，Enolase在细菌感染机体诱导炎症的过程中发挥了重要作用[26]。金黄色葡萄球菌的Enolase定位于细菌的表面，与宿主细胞外基质的一种主要成分层黏连蛋白相互作用，参与细菌的扩散和侵染过程[16]。Enolase是铜绿假单胞菌RNA降解体的重要组成成分之一，参与铜绿假单胞菌RNA的加工和基因的调节过程；Enolase也是铜绿假单胞菌的重要毒力因子，在诱导小鼠急性肺炎模型中发挥重要作用，缺失enolase基因使铜绿假单胞菌对氧化应激的耐受能力减弱，使得铜绿假单胞菌更容易被宿主体内的中性粒细胞所杀伤[27]。
Enolase在已知的测通全序的鸭疫里默氏杆菌中高度保守，核苷酸序列同源性为97.37%~100%，氨基酸序列同源性为93.95%~100%，目前对于该基因的生物学功能还未见报道。本研究构建了鸭疫里默氏杆菌的enolase基因缺失株和回复株，对缺失株的生物学表型进行了研究，发现与亲本株RA-LZ01相比，缺失株ΔEnolase的生长速率显著变慢，说明enolase基因缺失后会影响RA-LZ01菌株的生长，在RA-LZ01的生长中发挥重要作用。
对DBMEC的黏附侵袭试验中，发现ΔEnolase对DBMEC的相对黏附率和相对入侵率均极显著降低，而cΔEnolase对DBMEC的黏附侵袭均有回补作用，且其相对入侵率与亲本株相比差异不显著，说明Enolase在RA-LZ01黏附和侵袭DBMEC过程中发挥重要作用。
为进一步验证enolase基因缺失后菌株在黏附和侵袭DBMEC中发生的表型改变，对樱桃谷雏鸭进行了攻毒试验，确定各菌株对雏鸭BBB的侵袭能力。试验结果发现，感染亲本株RA-LZ01、缺失株ΔEnolase及回复株cΔEnolase的雏鸭，其血液中的载菌量没有显著差异，说明enolase基因不影响菌株在雏鸭血液中的存活；但与感染亲本株和回复株的雏鸭相比，感染缺失株的雏鸭脑组织中的载菌量极显著下降，且雏鸭的精神状态相对较好，说明enolase基因缺失致弱了菌株入侵脑组织的能力，提示enolase基因在鸭疫里默氏杆菌突破BBB中发挥重要作用。
4 结论成功构建了鸭疫里默氏杆菌enolase基因缺失株ΔEnolase和回复株cΔEnolase，发现enolase基因参与菌株的生长，显著影响菌株对DBMEC的黏附、入侵以及对雏鸭脑组织的入侵，在鸭疫里默氏杆菌突破鸭BBB中发挥重要作用。
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(编辑 范子娟)