畜牧兽医学报  2022, Vol. 53 Issue (12): 4346-4355. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2022.12.020    PDF    
引用本文
王斐, 杨洁, 吕庆杰, 王米雪, 刘鹏, 张若愚, 史聪聪, 王雪莹, 林琳, 华琳, 宋文博, 梁婉, 陈焕春, 吴斌, 彭忠. 致脑膜炎多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及全基因组重测序[J]. 畜牧兽医学报, 2022, 53(12): 4346-4355.  
WANG Fei, YANG Jie, LÜ Qingjie, WANG Mixue, LIU Peng, ZHANG Ruoyu, SHI Congcong, WANG Xueying, LIN Lin, HUA Lin, SONG Wenbo, LIANG Wan, CHEN Huanchun, WU Bin, PENG Zhong. Isolation and Genomic Characterization of a Meningitis Causing Pasteurella multocida[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2022, 53(12): 4346-4355.  
致脑膜炎多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及全基因组重测序
王斐1,2, 杨洁1,2, 吕庆杰1,2, 王米雪1,2, 刘鹏1,2, 张若愚1,2, 史聪聪1,2, 王雪莹1,2, 林琳1,2, 华琳1,2, 宋文博1,2, 梁婉1,2, 陈焕春1,2, 吴斌1,2, 彭忠1,2,3     
1. 华中农业大学动物医学院，农业微生物学国家重点实验室，武汉 430070;
2. 生猪健康养殖协同创新中心，武汉 430070;
3. 湖北洪山实验室，武汉 430070
收稿日期：2022-01-10
基金项目：国家自然科学基金(31902241)；中国博士后科学基金(2020T130232；2018M640719)；湖北省重点研发计划(2021BBA085)
作者简介：王斐(1994-)，男，湖北黄冈人，博士生，主要从事畜禽病原微生物研究，E-mail: wf2018@webmail.hzau.edu.cn.
通信作者：吴斌，主要从事动物传染病学研究，E-mail: wub@mail.hzau.edu.cn; 彭忠，主要从事动物传染病学研究，E-mail: pengzhong@mail.hzau.edu.cn.
摘要：旨在了解致脑膜炎多杀性巴氏杆菌的生物学特性及其引起脑部感染的生物学基础。本研究从有神经症状的病死猪脑组织中分离鉴定1株多杀性巴氏杆菌SD001，对其开展血清杀菌试验、胞内存活试验、小鼠感染试验，并利用纳米孔测序技术对其进行全基因组测序。SD001相对于猪其他器官中分离的多杀性巴氏杆菌而言表现出更强的抗血清杀菌的能力，其在小鼠巨噬细胞内存活的能力也较强。小鼠感染试验显示，相同剂量的细菌经血液感染后，SD001在小鼠血液和脑组织中的载菌量显著高于猪肺炎型多杀性巴氏杆菌(P ≤ 0.01)，并且SD001造成了小鼠脑组织发生炎症等病理损伤，提示SD001可能造成血流感染并引起小鼠脑膜炎。纳米孔测序显示，SD001的全基因组大小约为2.45 Mb，平均GC含量为40.25%，编码2 281个蛋白以及77个RNA；SD001基因组中含有2条CRISPR结构、5个基因岛、7条前噬菌体序列；毒力基因预测结果显示，SD001含有233个毒力基因；基因分型结果显示，SD001为荚膜：LPS：MLST基因型A: L6:ST10。SD001感染可以引起脑膜炎，其较强的抗血清杀菌能力以及能形成血流感染的能力可能是SD001引起脑部感染的重要原因，在兽医临床关于中枢神经系统感染的诊断中应该纳入多杀性巴氏杆菌感染的可能性。
关键词：多杀性巴氏杆菌    脑膜炎    猪    血清杀菌试验    胞内存活试验    小鼠感染试验    纳米孔测序    
Isolation and Genomic Characterization of a Meningitis Causing Pasteurella multocida
WANG Fei1,2, YANG Jie1,2, LÜ Qingjie1,2, WANG Mixue1,2, LIU Peng1,2, ZHANG Ruoyu1,2, SHI Congcong1,2, WANG Xueying1,2, LIN Lin1,2, HUA Lin1,2, SONG Wenbo1,2, LIANG Wan1,2, CHEN Huanchun1,2, WU Bin1,2, PENG Zhong1,2,3     
1. State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, College of Veterinary Medicine, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China;
2. The Cooperative Innovation Center for Sustainable Pig Production, Wuhan 430070, China;
3. Hubei Hongshan Laboratory, Wuhan 430070, China
Corresponding author: WU Bin, E-mail: wub@mail.hzau.edu.cn; PENG Zhong, E-mail: pengzhong@mail.hzau.edu.cn.
Abstract: This study was designed to investigate the biological characteristics of a meningitis causing Pasteurella multocida and the biological basis for this bacterium causing brain infections. Serum bactericidal tests, intracellular survival tests, mouse infection tests, and nanopore sequencing were performed on a P. multocida strain SD001 which was isolated from the brain of a pig with neurological symptoms. Results were as follows: Compared to those of P. multocida isolates from the other organs of pigs, SD001 displayed a stronger anti-serum bactericidal capacity, and a stronger capacity of surviving in mouse macrophages. In mouse models, SD001 formed a higher bacterial load in both blood and brain than a pneumonic P. multocida strain at the same time points post challenge, and the challenge of SD001 led to inflammatory and other pathological damages in the experimental mice. These findings suggest that SD001 may cause bloodstream infections and meningitis animals. Results from nanopore sequencing revealed that the complete genome sequence of SD001 was 2.45 Mb in size, with an average GC content of 40.25%. The complete genome of SD001 encoded 2 281 putative proteins and 77 RNAs. It also contained two CRISPR sequences, five genomic islands, seven prophages, and 233 virulence factor encoding genes. Genotyping using the complete genome sequence showed that SD001 belonged to capsular: LPS: MLST type A: L6: ST10. SD001 infection could cause meningitis and its strong capacity of anti-serum bactericidal activity as well as inducing bloodstream infection may confer the bacterium capacity of causing brain infections. P. multocida infection should be considered for the diagnosis of brain infections in veterinary clinical settings.
Key words: Pasteurella multocida    meningitis    pig    serum bactericidal test    intracellular survival test    mouse infection test    nanopore sequencing    

多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida，Pm)是一种重要的革兰阴性呼吸道病原菌，能感染多种动物及人，主要引起呼吸道疾病和出血性败血症[1]。Pm毒力因子众多，已被报道的毒力因子包括荚膜、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、黏附因子、毒素、铁代谢相关蛋白、唾液酸代谢酶、透明质酸酶、外膜蛋白等[1-2]。根据编码荚膜或LPS基因的不同，Pm可被分为A、B、D、E、F 5种荚膜基因型或L1~L8 8种LPS基因型[3-4]。此外，多序列位点分型(multilous sequence typing，MLST)也常被用于Pm的分型[1]。在临床上常将上述3种分型系统联合应用(表示为“荚膜：LPS：MLST基因型”)用来对Pm临床分离菌株进行分型，以便更好地阐述不同宿主中分离的Pm的基因型特征[1]。

猪是Pm的重要宿主之一[5]。Pm一般定植于猪上呼吸道(如鼻腔和气管)，主要引起猪群发生萎缩性鼻炎、肺炎、气管炎和支气管炎等呼吸道疾病[6]。临床上也偶有Pm引起猪出血性败血症的病例报道，但不多见[5]。除了上述疾病外，目前鲜见Pm感染引起猪群其他疾病尤其是脑膜炎的报道。本研究从山东某猪场1头表现出神经症状并诊断为脑膜感染的病猪脑组织中分离出1株Pm，命名为SD001。本研究针对SD001的生物学特征进行研究，并利用纳米孔技术进行全基因组测序，明确其基因组特征，为进一步探究Pm引起脑膜炎的机制奠定基础。

1 材料与方法 1.1 实验材料

本研究中使用的参考菌株包括多杀性巴氏杆菌HN07(GenBank登录号：CP007040)，Pm-P1(荚膜A型)和Pm-G1(荚膜A型)，均由本实验室分离并保存。其中，HN07是1株典型的肺炎型Pm[7]，而Pm-P1和Pm-G1则分别分离自因败血症死亡的病猪的脾组织和肝组织。胰蛋白大豆琼脂(TSA)和胰蛋白大豆肉汤(TSB)培养基、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)购自美国Sigma公司。新生牛血清(NBS)购自浙江天杭生物科技股份有限公司。RAW264.7细胞由本实验室保存。

1.2 病例描述

2020年3月，山东某养猪场，育肥栏猪出现咳嗽气喘, 呼吸困难, 后发展为神经症状，表现为肌肉震颤、后腿不稳、卧倒划动。病期用氨苄青霉素、链霉素等药治疗效果不佳。对发病严重的3头猪进行了剖检, 其主要病变为大脑水肿肿胀，软脑膜明显充血。

1.3 病原菌的分离和鉴定

采集有神经症状死亡猪的脑样品于第一时间冰浴运输至实验室进行病原检测。检测对象为常见的可能引起神经感染的病原，包括伪狂犬病病毒(PRV)、日本脑炎病毒(JEV)、猪瘟病毒(CSFV)、链球菌(Ss)、副猪嗜血杆菌(Hps)等。PRV、JEV、CFSV病原检测分别参考GB/T 35911—2018、SN/T 2067—2008、GB/T 16551—2020。病原菌的分离、纯化和鉴定参照美国微生物学会出版的《Manual of Clinical Microbiology》(第12版)进行，即在生物安全柜中利用无菌接种环将脑组织内部未与外部环境接触的部位划线接种至含有10 μg·mL－1 NAD及5% NBS的TSA平板上，然后置于37 ℃培养箱中培养24~36 h。待长出菌落后注意肉眼观察细菌的形态、大小、光泽度，同时尽可能挑取不同形态、大小和光泽度的单菌落接种至含有10 μg·mL－1 NAD及5% NBS的TSB中，置于37 ℃、180 r·min-1条件下震荡培养至浑浊。随后以菌液为模板，利用细菌的16S rRNA基因通用引物(F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′; R: 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行PCR扩增，并将扩增产物送往武汉擎科生物技术有限公司测序。将序列提交至NCBI数据库进行比对，从而确定细菌的种属。Pm鉴定：进一步通过种属特异性基因kmt1进行确认，引物序列及PCR反应条件参考已有报道[3]；同时根据该报道进行Pm荚膜基因型的鉴定。

1.4 一步生长曲线试验

挑取Pm单菌落至含有5%新生牛血清的TSB中培养至对数期，调整菌液OD600 nm至0.6，将菌液分别按照1∶100体积比转接至含有5% NBS的TSB培养基中，使用全自动生长曲线分析仪(Oy Growth Gurves Ab Ltd)进行生长曲线测定。

1.5 血清杀菌试验

从Pm阴性的3~4周龄的健康猪群采集血液，置于4 ℃过夜析出血清。取上清，经3 000 r·min－1离心10 min后，以0.22 μm滤器过滤。制备好血清后，将部分血清56 ℃作用30 min灭活。将Pm在含5%血清的TSA平板上划线培养长出菌落后，以2 mL 0.01 mol·L－1无菌PBS洗脱菌落，调整细菌的浓度为1×107 CFU·mL－1。随后，分别取800 μL正常血清和灭活血清加入到1.5 mL无菌离心管中，同时取200 μL菌液加入与血清充分混合，将混合液于37 ℃作用60 min后，冰浴10 min终止反应，进行10倍连续稀释，取适当的稀释度涂平皿计数，计算CFU。每组做3个重复，整个试验重复两次。最终结果以存活率=[正常血清中的菌量(CFU·mL－1)]/[灭活血清中的菌量(CFU·mL－1)]× 100%来表示。

1.6 细胞内存活试验

使用小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)作为试验细胞。将含菌液的细胞培养基加入细胞长成单层的6孔板中，每孔的细胞数在106左右。将细胞培养板转到37 ℃培养，分别培养1、2、3 h后，以PBS轻洗细胞5遍，移去未结合的细菌。加入含卡那霉素(终浓度100 ng·μL－1)的1640细胞培养基(含10%胎牛血清)，于4 ℃静置30 min杀死结合在细胞表面的细菌。以PBS轻洗细胞5遍，洗去抗生素及死菌，利用1 mL预冷的ddH2O裂解细胞10 min，倍比稀释后取适当稀释度涂平板计数。最终结果以存活率=[胞内菌量(CFU)]/[接种菌量(CFU)]×100%来表示。

1.7 纳米孔测序(ONT sequencing)和生物信息学分析

挑取Pm单菌落接种至含有5% NBS的TSB中，置于37 ℃、180 r·min－1条件下震荡培养至浑浊。利用商业化的QIAamp DNA minikit(Qiagen, Hilden, Germany)试剂盒参照说明书的步骤提取基因组。经浓度为0.35%琼脂糖凝胶电泳、NanoDrop分光光度仪(Thermo Fisher Scientific)和Qubit 3.0荧光测定仪器(Thermo Fisher Scientific)检测合格后，利用纳米孔测序公司(ONT)研发的SQK-LSK109 ligation sequencing kit商业化试剂盒构建大小为20~30 kb的DNA文库，随后利用ONT公司研发的PromethION测序平台进行全基因组重测序。利用Nanocall软件(https://github.com/mateidavid/nanocall)以默认参数对测序数据进行碱基判定(base calling)。ONT测序共获得1 131 731 447 bp的原始数据。原始数据经过滤后，获得1 001 345 400 bp的高质量数据(Q20, 97.98%; Q30, 94.08%)。所获得的数据利用Canu v1.5 (https://canu.readthedocs.io/en/latest/)组装，并利用Racon v3.4.3(https://github.com/isovic/racon) 和Circlator v1.5.5(https://sanger-pathogens.github.io/circlator/)对组装的质量进行检查，最终获得细菌的全基因组序列。所获得的序列提交至NCBI GenBank数据库，登录号为CP090428。

利用Prokka软件(https://github.com/tseemann/prokka)对SD001的全基因组进行注释；基于CRISPRfinder(https://crispr.i2bc.paris-saclay.fr/Server/)进行CRISPR预测；基于IslandViewer 4(https://www.pathogenomics.sfu.ca/islandviewer/)进行基因岛预测；前噬菌体序列通过PHASTER(https://phaster.ca/)进行分析；SD001的基因型(荚膜：LPS：MLST基因型)利用作者前期开发的PmGT在线工具(http://vetinfo.hzau.edu.cn/PmGT/)[8]进行确定；毒力基因采用VFDB数据库(http://www.mgc.ac.cn/VFs/)进行分析。利用MAFFT软件(https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/)进行DNA或氨基酸序列比对，同时利用MEGA11软件(https://www.megasoftware.net/)进行遗传进化分析。进化树基于全基因组序列进行构建，所选的运算方法为NJ法，bootstrap值设定为1 000。多杀性巴氏杆菌HB03(GenBank登录号：NZ_CP003328，猪源，荚膜A型，肺炎型)、3480(GenBank登录号：NC_017764，猪源，荚膜A型，肺炎型)、ATCC43137(GenBank登录号：NZ_CP008918，猪源，荚膜A型，肺炎型)、HN06(GenBank登录号：NC_017027，猪源，荚膜D型，萎缩性鼻炎型)、HN07(GenBank登录号：NZ_CP007040，猪源，荚膜F型，肺炎型)、Pm70(GenBank登录号：NZ_002663，禽源，荚膜F型)的基因组在本研究中作为参考基因组。全基因组比利用BRIG(http://brig.sourceforge.net/)软件进行。

1.8 小鼠感染试验

28只4~5周龄雌性昆明小鼠，分为7组，每组4只，分别通过尾静脉注射的方式感染Pm，感染剂量为每只小鼠107 CFU，具体分组及处理情况如表 1所示(12 h感染情况未展示)。感染后2、4、6、12 h后，摘眼球采血并处死小鼠，解剖取脑组织称重后进行匀浆，稀释后涂板计数，测定组织载菌量(CFU·g－1)。血液通过抗凝管收集，稀释后涂板计数，测定其载菌量。取脑组织制作组织切片进行病理组织学观察。

表 1 动物试验设计 Table 1 Study design of animal experiment
1.9 数据分析

本研究的试验结果以“x±s展示，使用Multiple t-tests或Two-way ANOVA进行统计学分析，P≤0.05定义为结果显著(*)，P≤0.01定义为结果极显著(**)。

2 结果 2.1 多杀性巴氏杆菌SD001的分离鉴定及其在不同条件下的生存能力、生长比较

针对脑组织的实验室检测结果显示，PRV、JEV、CSFV等均为阴性。脑组织样品接种至TSA培养基在37 ℃培养箱中培养24 h后，平板上长出形态较为相似的菌落。随机挑取单菌落经16S rRNA测序后鉴定为Pm，这一结果随后通过PCR扩增Pm的种属特异性基因kmt1得到确认(图 1A)。随后，将所分离的Pm命名为SD001。PCR结果显示SD001的荚膜基因型为A型(图 1A)。血清杀菌试验结果显示，SD001的抗血清杀菌能力显著强于猪肺炎型Pm以及猪肝和肾中分离的Pm(图 1B)；胞内存活试验显示SD001在小鼠巨噬细胞中存活能力也显著强于猪肺炎型Pm以及猪肝和肾中分离的Pm(图 1C~E)；一步生长曲线试验显示SD001的生长速度也较猪肺炎型Pm(HN07)以及猪肝(Pm-G1)和脾(Pm-P1)中分离的Pm显著更快(图 1F)。

A.多杀性巴氏杆菌SD001的PCR鉴定(M.DL2000 DNA相对分子质量标准；1.PCR扩增Pm种属特异性基因，460 bp；2.PCR扩增鉴定荚膜A型基因，1 044 bp；3.阴性对照)；B.不同组织分离的多杀性巴氏杆菌的抗血清杀菌能力；C~E.不同组织分离的多杀性巴氏杆菌在不同时间点在RAW264.7中的存活能力(C.接种后1 h; D.接种后2 h；E.接种后3 h)；F.不同器官分离的多杀性巴氏杆菌的生长曲线对比(**.P < 0.01) A. PCR identification of Pasteurella multocida SD001 (M. DL2000 DNA marker; 1. PCR amplifying the species-specific gene of Pasteurella multocida, 460 bp; 2. PCR amplifying the capsular genotype A gene, 1 044 bp; 3. Negative control); B. Anti-serum bactericidal capacity of Pasteurella multocida isolates from different organs of pigs; C-E. Survival bacteria of different Pasteurella multocida strains in RAW264.7 at different time point post inoculation (C. 1 hours post inoculation; D. 2 hours post inoculation; D. 3 hours post inoculation); F. Growth curve of Pasteurella multocida isolates from different organs (**.P < 0.01) 图 1 致脑膜炎多杀性巴氏杆菌SD001的PCR鉴定及抗血清杀菌能力、胞内存活能力及生长评估 Fig. 1 PCR identification of Pasteurella multocida SD001 and evaluation of its anti-serum bactericidal capacity and surviving capacity in RAW264.7 and growth
2.2 多杀性巴氏杆菌SD001的基因组特征

利用纳米孔测序技术成功获得了SD001的全基因组序列，结果显示，SD001的全基因组大小约为2.45 Mb，平均GC含量为40.25%(图 2)。

图 2 多杀性巴氏杆菌SD001的全基因组环状图 Fig. 2 Circle map of the complete genome of Pasteurella multocida SD001

未发现SD001携带有游离质粒。经Prokka软件注释后，SD001全基因组含有2 399个基因，编码2 281个蛋白以及57个tRNA、19个rRNA和1个tmRNA。SD001基因组中含有2条CRISPR结构，5个基因岛，7条前噬菌体序列。毒力基因预测的结果显示，SD001含有233个毒力基因，其中，24个毒力基因位于基因岛中。利用PmGT基于全基因组序列对SD001分型，结果显示，SD001为荚膜：LPS：MLST基因型A: L6: ST10。遗传进化分析显示，SD001与其他猪源Pm的亲源关系较近(图 3A)。全基因组比对的结果显示相对于猪肺炎型Pm(HB03、3480、ATCC 43137、HN07)和猪萎缩性鼻炎型Pm(HN06)的基因组而言，SD001的基因组中存在3个大的特异性区域，其中区域I为Mu噬菌体编码区，区域II主要编码和DNA修饰、转录、复制等有关的蛋白质，值得一提的是区域III；该区域编码1个表面脂蛋白装配修饰器(surface lipoprotein assembly modifier, SLPAM)、1个转铁蛋白结合蛋白类似溶质结合蛋白(transferrin-binding protein like solute binding protein, TBPLSBP)以及1个TonB依赖受体(TonB-dependent receptor, TDR)(图 3B)。

A. 不同多杀性巴氏杆菌的遗传进化分析；B. 不同组织分离的猪多杀性巴氏杆菌的比较基因组学分析 A. Phylogenetic relationships of different Pasteurella multocida strains; B. Comparisons of the whole genome sequences of different Pasteurella multocida isolates from pigs 图 3 多杀性巴氏杆菌SD001的遗传进化及比较基因组学分析 Fig. 3 Phylogenetic and comparative genomics analyses of Pasteurella multocida SD001
2.3 多杀性巴氏杆菌SD001引起小鼠脑膜炎的能力

小鼠试验结果显示，经尾静脉感染后在相同的时间点，SD001在小鼠脑组织和血液中的载量均显著高于猪肺炎型Pm(图 4)；脑组织切片观察结果显示，SD001感染的小鼠脑组织相对于对照小鼠的脑组织而言，出现炎性细胞浸润、出血等病理变化(图 5)；同时从小鼠脑组织中也分离出了Pm。上述结果表明，SD001经血液感染后可以突破血脑屏障，定植于小鼠脑组织中并引起脑膜炎。

A.感染12 h细菌载量；B.血液载菌量；C.脑组织载菌量。●. SD001；▼. HN07 A. Bacterial load at 12 h post infection; B. Bacterial load in blood; C. Bacterial load in brain. ●. SD001;▼. HN07 图 4 多杀性巴氏杆菌SD001和HN07经尾静脉感染小鼠后在血液和脑组织中的载菌量 Fig. 4 Bacterial load of Pasteurella multocida SD001 and HN07 in mouse blood and brain after challenging via tail vein
A.SD001感染小鼠的脑组织切片；B. PBS感染小鼠的组织切片 A. Pathological damages in brain of the mice challenged with SD001; B. Pathological damages in brain of the mice challenged with PBS 图 5 多杀性巴氏杆菌SD001感染小鼠及PBS感染小鼠的脑组织切片(400×) Fig. 5 Pathological damages in brain of the mice challenged with Pasteurella multocida SD001 and PBS (400×)
3 讨论

作为一种呼吸道病原菌，Pm在体内主要定植于上呼吸道，呼吸系统器官尤其是肺是Pm的主要靶器官[5-6]。然而，本研究从山东地区1头具有神经症状的猪脑组织中分离出了1株Pm。2020年，印度学者首次报道了Pm引起猪的神经系统感染，并在实验室中首次用小鼠模型证实了Pm可以侵入神经系统造成感染[9]。通过查阅文献得知，国内目前还未见类似的报道。进一步通过查阅文献得知，在兽医领域也有Pm引起兔和牛脑部感染的报道[10-11]。而在人医领域Pm引起病人脑部感染的案例报道相对较多[12-15]。人医临床上更是有人员因接触过猪而发生Pm感染脑部的报道[13]。以上结果表明，虽然Pm在临床上引起人和动物脑部感染的病例尽管不多见，但是也绝非个案，在细菌性脑膜炎的临床诊断中应该将Pm感染的可能性纳入。此外，Pm可能导致的公共卫生风险应引起足够的重视。

理论上，几乎所有的致病菌均能引起宿主脑膜炎[16]。然而，在血液中生存、复制并形成高滴度的菌血症则有助于病原菌随血流到达血脑屏障及细菌性脑膜炎的发生[17]。在本研究中，血清杀菌试验的结果显示，SD001相对于猪其他器官中分离的Pm而言具有更强的抗血清杀菌的能力；同时SD001表现出了更强的胞内存活能力、更快的生长速度。这些结果提示SD001在血液中具有较强的生存能力，而这也可能是SD001能造成脑内感染的原因之一。Pm的基因组大小一般为2.4 Mb，平均GC含量在40.2%左右[1]。从纳米孔测序的结果看，SD001的全基因大小、平均GC含量、基因组编码蛋白质及RNA的数目均符合Pm的一般基因组特征。值得一提的是，SD001的基因组中含有较多的基因岛和前噬菌体序列。一般而言，基因岛常常与病原菌的毒力、耐药性以及宿主适应性有关，因此在病原菌的致病过程中发挥着重要的作用[17]，而前噬菌体也有可能参与调控病原菌中毒力基因的上调表达从而影响病原菌的毒力[18-19]。此外，SD001相对于猪肺炎Pm(HB03、3480、ATCC 43137、HN07)和猪萎缩性鼻炎型Pm(HN06)而言，含有3个特异性的蛋白，包括1个表面脂蛋白装配修饰器(SLPAM)、1个转铁蛋白结合蛋白类似溶质结合蛋白(TBPLSBP)以及1个TonB依赖受体(TDR)。SLPAM对于细菌编码表面脂蛋白(SLP)至关重要，而SLP被证实能够促进细菌对宿主细胞的黏附；此外，在肠屏障的细胞模型中还发现SLP可以刺激肠上皮细胞Caco-2中炎症因子(如IL-8)的产生[20]。TBPLSBP和TDR在Pm的铁摄取中发挥着关键的作用；而铁摄取被证实是Pm重要的毒力因子之一，在Pm的环境适应和致病过程中均发挥着重要的作用[1-2]。SD001特有的上述基因元件及基因可能有利于其能突破BBB进入中枢并引起感染。SD001所携带的毒力基因中有23个毒力基因位于基因岛。基因分型的结果显示SD001的基因型为荚膜：LPS：MLST基因型A: L6: ST10。根据已有的报道，该基因型是我国猪群中流行的常见基因型[21-22]。此外，在国外首次关于Pm引起猪脑膜炎的报道中，荚膜A型Pm占了较大比重[9]；该型菌株亦引起兔脑膜炎[10]。

在本研究中，SD001在经血液感染小鼠后在小鼠血液和脑组织中的载量高于猪肺中分离的Pm，进一步表明，SD001能形成一定程度的血流感染。而血流感染被认为是细菌性脑膜炎发生的重要前提[17]。此外，小鼠试验还发现SD001经血液感染后引起了脑组织中炎症等病理损伤的发生。这与国外的报道[9]一致，从而再一次提示SD001可以引起宿主发生脑部感染。

4 结论

从1头表现出神经症状的病死猪脑组织中分离鉴定出多杀性巴氏杆菌SD001。体外研究表明，SD001相对于猪体其他部位分离的Pm而言具有更强的抵抗血清杀菌及吞噬细胞内存活的能力。小鼠试验表明，SD001经血液感染后能在血液中形成高浓度的载量并且可以随血流到达小鼠的脑组织，提示SD001能形成一定程度的血流感染；此外，SD001经血液感染后能在小鼠脑部造成炎症。较强的抗血清杀菌能力以及能形成血流感染的能力可能是SD001引起脑部感染的重要原因。本研究是国内首次关于Pm引起猪脑部感染的报道。鉴于无论是在人医还是兽医领域均有Pm引起人和其他动物脑部感染的报道，因此在兽医临床关于中枢神经系统感染的诊断中应该纳入Pm感染的可能性。

参考文献
[1]
PENG Z, WANG X R, ZHOU R, et al. Pasteurella multocida: genotypes and genomics[J]. Microbiol Mol Biol Rev, 2019, 83(4): e00014-19. DOI:10.1128/MMBR.00014-19
[2]
HARPER M, BOYCE J D, ADLER B. Pasteurella multocida pathogenesis: 125 years after Pasteur[J]. FEMS Microbiol Lett, 2006, 265(1): 1-10. DOI:10.1111/j.1574-6968.2006.00442.x
[3]
TOWNSEND K M, BOYCE J D, CHUNG J Y, et al. Genetic organization of Pasteurella multocida cap loci and development of a multiplex capsular PCR typing system[J]. J Clin Microbiol, 2001, 39(3): 924-929. DOI:10.1128/JCM.39.3.924-929.2001
[4]
HARPER M, JOHN M, TURNI C, et al. Development of a rapid multiplex PCR assay to genotype Pasteurella multocida strains by use of the lipopolysaccharide outer core biosynthesis locus[J]. J Clin Microbiol, 2015, 53(2): 477-485. DOI:10.1128/JCM.02824-14
[5]
WILSON B A, HO M. Pasteurella multocida: from zoonosis to cellular microbiology[J]. Clin Microbiol Revi, 2013, 26(3): 631-655. DOI:10.1128/CMR.00024-13
[6]
WILKIE I W, HARPER M, BOYCE J D, et al. Pasteurella multocida: diseases and pathogenesis[M]//AKTORIES K, ORTH J H C, ADLER B. Pasteurella multocida: Molecular Biology, Toxins and Infection. Berlin: Springer, 2012: 1-22.
[7]
PENG Z, LIANG W, WANG Y G, et al. Experimental pathogenicity and complete genome characterization of a pig origin Pasteurella multocida serogroup F isolate HN07[J]. Vet Microbiol, 2017, 198: 23-33. DOI:10.1016/j.vetmic.2016.11.028
[8]
PENG Z, LIU J Y, LIANG W, et al. Development of an online tool for Pasteurella multocida genotyping and genotypes of Pasteurella multocida from different hosts[J]. Front Vet Sci, 2021, 8: 771157. DOI:10.3389/fvets.2021.771157
[9]
SAHOO M, BALONI S, THAKOR J C, et al. Localization of Pasteurella multocida antigens in the brains of pigs naturally infected with Pasteurellosis revealing a newer aspect of pathogenesis[J]. Microb Pathog, 2020, 140: 103968. DOI:10.1016/j.micpath.2020.103968
[10]
KPODÉKON M. Experimental study of the pathogenesis of meningitis and encephalitis during pasteurellosis in rabbits[J]. Ann Res Vet, 1983, 14(3): 217-224.
[11]
MARZA A D, ABDULLAH F F J, AHMED I M, et al. The ability of lipopolysaccharide (LPS) of Pasteurella multocida B: 2 to induce clinical and pathological lesions in the nervous system of buffalo calves following experimental inoculation[J]. Microb Pathog, 2017, 104: 340-347. DOI:10.1016/j.micpath.2017.01.031
[12]
DUTHEIL F, WAHL D, CHAMOUX A. Pasteurella multocida meningitis in a 93-year-old woman following a cat bite[J]. Méd Mal Infect, 2009, 39(1): 61-63. DOI:10.1016/j.medmal.2008.09.026
[13]
LÓPEZ C, SANCHEZ-RUBIO P, BETRÁN A, et al. Pasteurella multocida bacterial meningitis caused by contact with pigs[J]. Braz J Microbiol, 2013, 44(2): 473-474. DOI:10.1590/S1517-83822013000200021
[14]
ARMSTRONG G R, SEN R A, WILKINSON J. Pasteurella multocida meningitis in an adult: case report[J]. J Clin Pathol, 2000, 53(3): 234-235. DOI:10.1136/jcp.53.3.234
[15]
KUMAR A, DEVLIN H R, VELLEND H. Pasteurella multocida meningitis in an adult: case report and review[J]. Rev Infect Dis, 1990, 12(3): 440-448. DOI:10.1093/clinids/12.3.440
[16]
RODRIGUES C M C, MAIDEN M C J. A world without bacterial meningitis: how genomic epidemiology can inform vaccination strategy[J]. F1000Res, 2018, 7: 401. DOI:10.12688/f1000research.13793.1
[17]
彭忠, 李春辉, 陈焕春, 等. 细菌性脑膜炎概述[J]. 中国感染控制杂志, 2022, 21(1): 97-103.
PENG Z, LI C H, CHEN H C, et al. An overview of bacterial meningitis[J]. Chinese Journal of Infection Control, 2022, 21(1): 97-103. (in Chinese)
[18]
DOBRINDT U, HOCHHUT B, HENTSCHEL U, et al. Genomic islands in pathogenic and environmental microorganisms[J]. Nat Rev Microbiol, 2004, 2(5): 414-424. DOI:10.1038/nrmicro884
[19]
YANG D, WANG S, SUN E C, et al. A temperate Siphoviridae bacteriophage isolate from Siberian tiger enhances the virulence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus through distinct mechanisms[J]. Virulence, 2022, 13(1): 137-148. DOI:10.1080/21505594.2021.2022276
[20]
GUGLIELMETTI S, TAMAGNINI I, MORA D, et al. Implication of an outer surface lipoprotein in adhesion of Bifidobacterium bifidum to Caco-2 cells[J]. Appl Environ Microbiol, 2008, 74(15): 4695-702. DOI:10.1128/AEM.00124-08
[21]
彭忠, 梁婉, 艾伟诚, 等. 我国猪群中多杀性巴氏杆菌的基因型分析[J]. 畜牧兽医学报, 2019, 50(5): 1064-1072.
PENG Z, LIANG W, AI W C, et al. Genotypical characteristics of swine Pasteurella multocida in China[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2019, 50(5): 1064-1072. (in Chinese)
[22]
PENG Z, WANG H N, LIANG W, et al. A capsule/lipopolysaccharide/MLST genotype D/L6/ST11 of Pasteurella multocida is likely to be strongly associated with swine respiratory disease in China[J]. Arch Microbiol, 2018, 200(1): 107-118. DOI:10.1007/s00203-017-1421-y

(编辑   白永平)