畜牧兽医学报  2022, Vol. 53 Issue (11): 4110-4115. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2022.11.036    PDF    
引用本文
令狐远凤, 潘永, 杨阳, 段世宇, 张家莉, 张宝太, 杨琦. 鼠伤寒沙门菌伴侣蛋白Hfq与小RNA GcvB结合位点的初步分析[J]. 畜牧兽医学报, 2022, 53(11): 4110-4115.  
LINGHU Yuanfeng, PAN Yong, YANG Yang, DUAN Shiyu, ZHANG Jiali, ZHANG Baotai, YANG Qi. Preliminary Exploration of Binding Sites of Salmonella Typhimurium Chaperone Protein Hfq on Small RNA GcvB[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2022, 53(11): 4110-4115.  
鼠伤寒沙门菌伴侣蛋白Hfq与小RNA GcvB结合位点的初步分析
令狐远凤1,2, 潘永3, 杨阳1,2, 段世宇1,2, 张家莉1,2, 张宝太1,2, 杨琦1,2     
1. 贵州大学动物科学学院, 贵阳 550025;
2. 贵州大学动物疫病研究所, 贵阳 550025;
3. 贵州省农业科学院畜牧兽医研究所, 贵阳 550025
收稿日期：2022-02-17
基金项目：国家自然科学基金（31760740）；贵州省研究生教育创新计划项目（GZZ2017002）
作者简介：令狐远凤(1997-), 贵州遵义人, 女, 硕士生, 主要从事动物微生物学研究, E-mail: 3319314357@qq.com.
通信作者：杨琦, 主要从事动物微生物学研究, E-mail: yangqinmg@163.com.
摘要：旨在探究Hfq与GcvB可能的作用结合位点，本研究首先筛查GcvB中Hfq结合偏好型富U基序。通过λ-Red同源重组酶系统构建GcvB富U基序突变或截短菌株，构建GcvB终止子茎延伸菌株。运用P22噬菌体转导技术构建相应的hfq基因缺失菌株以及oppA：：lacZ基因融合菌株。通过qRT-PCR检测重组菌株的gcvB基因转录水平，β-半乳糖苷酶试验检测oppA基因编码蛋白水平。预测结果显示，GcvB存在2个Hfq结合偏好型富U基序U5和U8。qRT-PCR结果显示，U5基序的突变未造成gcvB基因转录水平明显的变化，而gcvB基因转录水平随U8基序的截短而下调，截短为U5和U4时下调最为明显，分别下调40.5%和37.5%。延伸U4截短菌株的GcvB终止子茎，结果发现，gcvB基因转录水平几乎恢复到了对照组的水平，同时也发现，尽管U4截短菌株gcvB基因转录水平得以恢复，却丧失了Hfq协同GcvB转录后负调控oppA mRNA的能力。以上结果表明，U5基序与Hfq维持GcvB稳定性无明显关联。U8基序对Hfq协助GcvB转录后负调控oppA mRNA以及维持GcvB稳定性是重要的，推测其为Hfq与GcvB的作用结合位点。
关键词：沙门菌    λ-Red同源重组系统    GcvB    伴侣蛋白Hfq    oppA    
Preliminary Exploration of Binding Sites of Salmonella Typhimurium Chaperone Protein Hfq on Small RNA GcvB
LINGHU Yuanfeng1,2, PAN Yong3, YANG Yang1,2, DUAN Shiyu1,2, ZHANG Jiali1,2, ZHANG Baotai1,2, YANG Qi1,2     
1. College of Animal Science, Guizhou University, Guiyang 550025, China;
2. Institute of Animal Diseases, Guizhou University, Guiyang 550025, China;
3. Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Guizhou Academy of Agricultural Sciences, Guiyang 550025, China
Corresponding author: YANG Qi, E-mail: yangqinmg@163.com.
Abstract: To explore the possible binding sites of Hfq on GcvB, in this study, the Hfq binding preference U-rich motif in GcvB was screened. The mutant and truncated strains of the GcvB U-rich motif were constructed by the λ-Red homologous recombinase system, and the GcvB terminator stem extension strain was constructed at the same time. P22 phage transduction technology was used to construct corresponding hfq gene deletion strains and oppA: : lacZ gene fusion strains. The gcvB gene transcription expression level of the recombinant strain was detected by qRT-PCR, and the oppA gene protein expression level was detected by the β-galactosidase test. The results showed that the mutation of U5 motif did not cause obvious changes in the transcription and expression level of gcvB gene, but when the U8 motif was truncated to U5 and U4, it was reduced by 40.5% and 37.5%, respectively. After the GcvB terminator stem of the U4 truncated strain was extended, it was discovered that the transcription and expression level of gcvB gene was restored, but the ability to Hfq negatively regulating oppA mRNA was weakened after co-transcription. The above results show that the U5 motif has no obvious relationship with Hfq maintaining the stability of GcvB, but the U8 motif is important for Hfq to assist GcvB with regulating oppA mRNA negatively after co-transcription and maintain GcvB stability. In summary, we speculate that the U8 motif is the binding site of Hfq on GcvB.
Key words: Salmonella    λ-Red homologous recombination system    GcvB    chaperone Hfq    oppA    

STM sRNA GcvB是一类重要的RNA分子，其无法编码相应的蛋白质，而是通过与Hfq协同作用，转录后调控STM有关靶mRNA[1]。现已经验证确认受GcvB直接调控的靶mRNA在STM中近30个，其中，大部分靶mRNA与GcvB的结合位点也已阐明[2]。sRNA-Hfq -mRNA三联体在细菌中普遍存在，Hfq不仅能够维持sRNA在细菌中转录后的稳定性，而且可重塑sRNA与其靶mRNA的二级结构构象，使sRNA易于与其靶mRNA结合[3]。Hfq六聚体通常利用其近端面与sRNA富含U的序列结合并作用[4]。

STM Hfq具有维持GcvB在体内稳定性的作用，但Hfq与GcvB具体的作用结合位点尚未探究透彻。鉴于此，本研究将利用RNA二级结构预测软件分析GcvB二级结构并筛查Hfq结合偏好型的富U基序；利用λ-Red同源重组酶系统构建相应序列的突变或截短菌株；利用噬菌体转导技术构建相应的hfq或gcvB基因缺失菌株以及lacZ基因融合菌株；通过qRT-PCR检测不同重组菌株gcvB基因的转录水平；通过β-半乳糖苷酶试验检测不同重组菌株oppA基因的蛋白水平，最后分析Hfq与GcvB富U基序的作用关系，为阐明STM Hfq与GcvB的作用机理提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 主要实验材料

MA7455菌株(STM LT2/pKD46)，MA10241菌株(STM LT2 ΔgcvB: :cat)，MA10675菌株(STM LT2 Δhfq: :tetRA)，P22噬菌体均由法国国家科学研究中心(CNRS)分子遗传学Bossi实验室惠赠。STM LT2 oppA: :lacZ菌株由本实验室构建。氯霉素、盐酸四环素、卡那霉素、dNTPs Mix及ONPG均购自北京索莱宝科技有限公司。AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix和胶回收试剂盒均购自南京诺唯赞生物科技有限公司。NovoScript® Plus All-in-one 1 st Strand cDNA Synthesis SuperMix (gDNA Purge)购自近岸蛋白生物科技有限公司。

1.2 引物设计与合成

登录NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，获取STM LT2株的全基因序列(GeneID：AE006468.2), 根据基因序列设计引物(表 1)，引物由Primer select软件设计，并由上海生工生物工程有限公司合成。

表 1 PCR引物序列 Table 1 The primer sequence for PCR
1.3 GcvB二级结构预测和富U基序筛查

使用Mfold软件预测GcvB二级结构。登录网站(http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold)，打开RNA Folding Form (Version 2.3 energies)选项，输入gcvB基因完整序列，其余参数按默认方案设置，导出并分析结果。筛查GcvB中Hfq结合偏好型富U基序。

1.4 GcvB富U基序突变或截短菌株的构建

利用λ-Red同源重组酶系统，以P1/P2为引物，MA10241菌株总DNA为模板，PCR扩增后产物回收作为模板，P3/P10为引物，产物经纯化后与pKD46感受态细胞进行电转，在平板上培养后以P8/P9为引物鉴定其菌落，筛选出STM LT2 gcvB: : cat；以P4/P10为引物，PCR扩增用于替换gcvB基因内部为T的目的片段，分别以P5/P10、P6/P10、P7/P10和P8/P10为引物，PCR扩增用于截短gcvB基因T8的目的片段，用上述相同方法将鉴定正确的菌株分别命名为STM LT2 gcvB(130—134TTTTT>GGGGG): : cat、STM LT2 gcvB Δ(206): : cat、STM LT2 gcvB Δ(205—206): : cat、STM LT2 gcvB Δ(204—206): : cat和STM LT2 gcvB Δ(203—206): : cat；以STM LT2 gcvB Δ(204—206): : cat菌株总DNA为模板，P1/P2为引物，其产物为模板，P9/ P10为引物，以相同方法鉴定正确的菌株命名为STM LT2gcvB[Δ(203—206), (184—185): : CCCC, (192—193): : GGGG]: : cat。

1.5 P22噬菌体的转导

将鼠伤寒沙门菌MA10675和STM LT2 oppA: : lacZ缺失菌株作为供体菌株，GcvB富U基序突变或截短菌株为受体菌，分别取受体菌100、50 μL稀释后供体菌borth至2.0 mL EP管中混匀置于37 ℃摇床孵育1 h后涂布筛选，以引物P10/P11、P6/P7分别对hfq基因的缺失、oppA-lacZ融合基因进行鉴定。

1.6 qRT-PCR反应

根据R6950 Bacterial RNA Kit，提取鼠伤寒沙门菌LT2的RNA，以反转录得到的cDNA作为模板，P11/P12(gcvB基因)和P13/P14(16S rDNA基因)为引物，按照SYBR©Premix Ex TaqTM II(Tli RNaseH Plus)试剂盒说明书进行qPCR，以16S rDNA基因为内参基因，以STM LT2 gcvB: : cat菌株为对照。最终采用相对比较法即Ct法(Qr=2-ΔΔCt)计算分析数据[5]。

1.7 β-半乳糖苷酶活性的检测

取50 μL待测菌株置于5 mL LB中，培养至OD600 nm=0.4后，取0.1 mL至新试管中，以Z buffer定容到1 mL。滴加3滴甲苯后在42 ℃水浴摇床中振荡2 h，将试管转于28 ℃水浴锅加入0.2 mL ONPG，记录加入时间(t0)。当试管中呈现出黄色时，加入0.5 mL Na2CO3终止反应，记录终止时间(tf)。将试管中终止所得液体离心后测其OD420nm，记录数值。通过公式计算β-半乳糖苷酶活性。

$ \;\;\;\;\;\;\beta \text {-半乳糖苷酶活性 }=\left(1\;000 \times\left(\mathrm{OD}_{420 \mathrm{~nm}}\right) /\left[\left(t_f-\right.\right.\right.\\ \left.\left.t_0\right) \times \mathrm{OD}_{600 \mathrm{~nm}}\right] $
2 结果 2.1 GcvB二级结构预测及富U基序筛查结果

使用Mfold软件预测STM LT2 GcvB的二级结构。结果显示，GcvB碱基可退火形成6个茎环结构，查找到的两个Hfq结合偏好型基序，U5位于第4个与第5个茎环之间，U8位于GcvB 3′末端，且均处于单链状态。

2.2 GcvB U5基序突变菌株/U8基序截短菌株及其hfq基因缺失菌株的构建结果

利用λ-Red同源重组酶系统和噬菌体转导技术构建相应的hfq基因缺失菌株。以STM LT2 gcvB: : cat菌株DNA为模板，利用λ-Red同源重组酶系统将gcvB基因T5(130—134 nt)突变为G5, 将gcvB基因T8 (199—207 nt)截短。PCR鉴定结果显示，所有重组菌株均出现与预期相符的918、1 964 bp目的条带，将PCR测序后进行峰图比对，STM LT2 gcvB基因T5(130—134 nt)已突变为G5，STM LT2 gcvB基因T8 (199—207 nt)已分别被截短突变为T7、T6、T5和T4。

2.3 gcvB T5基序突变对gcvB转录水平的影响

经过qRT-PCR试验结果显示，与野生型菌株(WT)相比，T5基序突变后gcvB基因转录水平未产生明显变化，敲除hfq基因后gcvB基因转录水平下调52%，敲除hfq基因的基础上T5基序的突变使gcvB基因转录水平下调51%。以上结果表明，hfq与gcvB基因转录水平呈正相关，但gcvB T5基序与gcvB基因的转录水平无明显关联。

2.4 gcvB T8基序截短对GcvB转录水平的影响

对gcvB T8基序截短菌株(T7、T6、T5和T4)及相应的hfq基因缺失菌株的gcvB转录水平进行检测。qRT-PCR检测结果显示，与WT相比，T7和T6菌株gcvB基因转录水平未产生明显变化，而T5和T4菌株分别下调40.5%和37.5%。敲除hfq基因的基础上截短T8基序，与WT相比，T7、T6、T5和T4菌株分别下调58.5%、57.8%、75.2%和77.8%(图 1)。以上结果表明，gcvB基因T8基序的截短对其转录水平产生了抑制作用，截短为T5和T4时作用最为明显。

WT. STM LT2 gcvB: : cat; gcvB-7T. STM LT2 gcvB Δ(206): : cat; gcvB-6T. STM LT2 gcvB Δ(205—206): : cat; gcvB-5T. STM LT2 gcvB Δ(204—206): : cat; gcvB-4T. STM LT2 gcvB Δ(203—206): : cat; Δhfq. STM LT2 gcvB: : cat Δhfq: : tetRA; gcvB-7TΔhfq. STM LT2 gcvB Δ(206): : cat Δhfq: : tetRA; gcvB-6TΔhfq. STM LT2 gcvB Δ(205—206): : cat Δhfq: : tetRA; gcvB-5TΔhfq. STM LT2 gcvB Δ(204—206): : cat Δhfq: : tetRA; gcvB-4TΔhfq. STM LT2 gcvB Δ(203—206): : cat Δhfq: : tetRA 图 1 gcvB基因转录水平qRT-PCR检测结果 Fig. 1 The results of transcriptional expression level of gcvB gene by qRT-PCR
2.5 GcvB终止子茎延伸菌株及其hfq基因缺失菌株的构建结果

利用λ-Red同源重组酶系统在gcvB基因185—186位碱基之间插入C4序列, 191—192位碱基之间插入G4序列，构建GcvB终止子茎延伸菌株，在此基础上，利用噬菌体转导技术构建hfq基因缺失菌株。PCR产物测序峰图比对表明目的片段已正确构建。

2.6 终止子茎延伸对GcvB转录水平的影响

对STM LT2 gcvB Δ(203—206): : cat菌株GcvB终止子茎延伸菌株及其hfq基因缺失菌株的gcvB转录水平进行检测。qRT-PCR检测结果显示，与WT相比，gcvB-LS4T终止子茎延伸菌株gcvB基因转录水平略微下调19.6%，而在此基础上敲除hfq基因后，gcvB基因转录水平下调29%。与仅敲除hfq基因时相比，gcvB-LS4TgcvBΔhfq基因转录水平上调为原来的1.6倍(图 2)。以上结果表明，终止子茎的延伸与gcvB基因的转录水平呈正相关。

WT. STM LT2 gcvB: : cat; gcvB-LS4T. STM LT2 gcvB[Δ(203—206), (184—185): : CCCC, (192—193): : GGGG]: : cat; Δhfq. STM LT2 gcvB: : cat Δhfq: : tetRA; gcvB-LS4TΔhfq. STM LT2 gcvB[Δ(203—206), (184—185): : CCCC, (192—193): : GGGG]: : cat Δhfq: : tetRA 图 2 gcvB基因转录水平qRT-PCR检测结果 Fig. 2 The results of transcriptional expression level of gcvB gene by qRT-PCR
2.7 oppA: :lacZ基因融合菌株的构建结果

以STM LT2 oppA: :lacZ菌株作为供体菌，STM LT2 gcvB: :cat、STM LT2 gcvB Δ(203—206): : cat和STM LT2 gcvB[Δ(203—206), (184—185): : CCCC, (192—193): : GGGG]: : cat分别为受体菌，运用噬菌体转导技术构建相应的oppA: : lacZ基因融合菌株。PCR鉴定结果显示，所有重组菌株均出现与预期相符的918、914、922、250 bp目的条带(图 3)。

M. DL2000 marker; 1. STM LT2 gcvB: :cat oppA: :lacZ; 2. STM LT2 gcvB Δ(203—206): : cat oppA: :lacZ; 3. STM LT2 gcvB[Δ(203—206), (184—185): : CCCC, (192—193): : GGGG]: : cat oppA: :lacZ 图 3 oppA: :lacZ融合基因噬菌体转导试验PCR扩增片段电泳结果 Fig. 3 PCR electrophoresis results of phage transduction experiment of oppA: :lacZ fusion gene
2.8 GcvB终止子茎延伸对oppA蛋白水平的影响

通过检测oppA: :lacZ基因融合菌株β-半乳糖苷酶活性，探究gcvB T8截短为T4以及延伸终止子茎对OppA蛋白表达的影响。结果显示，与WT相比，gcvB基因T8截短为T4后，oppA基因蛋白水平上调为原来的1.7倍。延伸该菌株的GcvB终止子茎后oppA基因蛋白水平上调为原来的1.7倍。以上结果表明，GcvB终止子茎的延伸虽恢复了因gcvB基因T8基序截短为T4时gcvB基因转录水平的下调，却未恢复下调OppA蛋白表达的能力。

3 讨论

Sauer和Weichenrieder[6]通过分析尺寸排阻色谱法证实了大肠杆菌Hfq与sRNA RybB的3′末端U6具有很高的亲和力，由于大多数Hfq依赖型sRNA 3′末端都具有4~8个尿嘧啶，该研究揭示了一种重要的Hfq与sRNA作用模式。Otaka等[4]发现截短大肠杆菌sRNA SgrS 3′末端U8时，SgrS丧失了与Hfq结合并使ptsG mRNA沉默的能力，再次证实了sRNA 3′末端polyU对Hfq结合的重要性。本研究中，对沙门菌sRNA GcvB二级结构预测，考虑到U5处于GcvB内部且在茎环结构附近，缺失将严重引起二级结构的改变从而增加了变量，不利于试验分析GcvB与Hfq之间的作用关系，因此对U5进行了突变处理，对U8进行截短处理。先前的研究已表明，Hfq主要与SgrS 3′末端U8结合，从而增强了SgrS的稳定性。试验检测了突变的U5及截短的U8菌株gcvB基因的转录水平，结果显示，U5的突变并未引起gcvB基因转录水平的显著变化，而U8的截短导致gcvB基因转录水平的明显变化，当GcvB 3′末端尿嘧啶数量缩减为5个时，GcvB转录水平开始表现出明显的下调。经初步验证，U8基序对于Hfq维持GcvB的稳定性以及协助GcvB负调控OppA的表达是必要的。

由于怀疑GcvB U8基序的缩短破坏了gcvB的转录终止进程，本研究在GcvB U8基序截短为U4的基础上延伸了U8基序前的终止子茎，与未延伸终止子茎相比，GcvB转录水平上调，几乎恢复至野生型菌株的水平，在此基础上敲除hfq基因也并未使GcvB转录水平发生明显变化，仅略微下调。但结果仍不能充分说明GcvB U8基序截短为U4 GcvB转录水平下调的原因是破坏了gcvB的转录终止进程或是破坏了GcvB与Hfq结合的关键基序，研究推测两种方式均存在。而通过对oppA基因蛋白水平的检测，发现GcvB U4菌株和其终止子茎延伸菌株oppA基因蛋白水平均较野生型菌株上调，该结果提示尽管终止子茎的延伸恢复了GcvB转录水平，但其抑制oppA mRNA的翻译的能力已然丧失，而Hfq是GcvB发挥调控作用依赖的伴侣蛋白。结果进一步说明GcvB U8基序对于Hfq维持GcvB的稳定性是重要的。

4 结论

U5基序与Hfq维持GcvB稳定性无明显关联。U8基序对Hfq协助GcvB转录后负调控oppA mRNA以及维持GcvB稳定性来说是重要的，推测其为Hfq与GcvB的作用结合位点。

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(编辑   白永平)