非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的一种急性、热性和高度接触性传染病。近日，农业农村部报道，截至2022年4月7日，2022年发生的非洲猪瘟(African swine fever，ASF)疫情为野猪1 938起，家猪388起。ASFV是一种以软蜱和猪分别作为中间宿主和终末宿主的DNA病毒^[1-2]。ASF起源于非洲，并于1921年在肯尼亚首次被报道，随后蔓延至欧洲、南美洲以及欧亚交界处等地区^[3]。我国首例ASF病例于2018年8月3日被报告，在随后几个月内蔓延至全国。此外，ASF在亚洲迅速蔓延，包括越南、韩国、柬埔寨、缅甸等，严重影响猪相关产品的生产和贸易与国家的社会经济产业^[4]。2022年，ASF疫情在全球持续蔓延，进一步表明需要加强对ASF疫情的监测。除了养猪企业应对ASF实行防控外，还需要对野猪感染ASFV采取有效的防控措施，以防止疫情的进一步蔓延。

ASFV是非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)、非洲猪瘟病毒属(Asfivirus)的成员，基因组长度为170~190 kb，为双链DNA病毒(dsDNA)。病毒在细胞质内复制，病毒颗粒呈二十面体对称，直径约为200 nm，具有同心结构，编码近200种蛋白质^[5-6]。CD2v是ASFV外膜蛋白中唯一的特征性病毒蛋白，它能介导RBC与病毒产生吸附现象。CD2v由ORF EP402R基因编码，大小约45.3 ku，与T淋巴细胞表面的黏附受体CD2相似^[7]。CD2v是一种糖蛋白，由一个信号肽、一个跨膜区和两个免疫球蛋白样结构域组成，它具有与CD2相似的氨基酸序列^[8-11]。此外，猪红细胞(RBCs)表面有CD2受体，因此ASFV可以吸附猪RBCs。由于其他猪源病毒不能吸附RBCs，因此ASFV具有吸附RBCs的独特特性^[12]。已发现从ASFV基因组中删除EP402R基因会降低ASFV引起的死亡率，并可以延缓病毒血症的发生和病毒向组织的传播，这表明CD2v介导的ASFV吸附RBCs的能力有助于病毒在宿主中的传播^{[11, 13]}。基于此，本研究拟探讨ASFV吸附RBCs后对细胞凋亡的影响，以及ASFV吸附诱导RBCs发生凋亡后对猪外周血单核细胞(PBMs)吞噬能力的影响。

在这项研究中，作者通过感染ASFV的PAMs发现了血液吸附(haemadsorption，HAD)现象。进一步研究表明，ASFV可诱导RBCs发生凋亡。还发现凋亡的RBCs可以促进PBMs的吞噬作用，表明这种现象可能是加剧宿主ASFV感染传播的另一种方式，为ASFV的感染传播和致病机制的研究提供理论基础。

1 材料与方法 1.1 细胞和病毒

猪肺泡巨噬细胞(PAMs)、猪外周血单核细胞(PBMs)和猪红细胞(RBCs)均取自4周龄的断奶仔猪；高毒力的ASFV分离株GZ201801分离自中国广州，为基因Ⅱ型。

1.2 主要试剂

胎牛血清(FBS)、RPMI-1640培养基、细胞培养级别青霉素和链霉素抗生素、0.25% EDTA-胰酶均购自Gibco公司；十八烷基罗丹明B氯化物(R18)购自Life Technologies公司；Annexin V-APC染色试剂盒，购自Keygen Biotech公司；RIPA蛋白裂解液、蛋白酶抑制剂、4×Laemmle SDS-PAGE缓冲液(含有DL-二硫苏糖醇)、DAPI染色液购自Beyotime公司；Trans-Blot Turbo快速转移系统购自Bio-Rad公司；Cleaved-caspase3、α-Tublin一抗购自CST公司；IRDye^Ⓡ 800CW二抗购自LI-COR公司；Latex beads黄绿色荧光微球悬液购自Sigma公司。

1.3 主要仪器

CO₂培养箱购自Thermo公司；细胞计数仪购自Countstar公司；倒置显微镜购自Leica公司；流式细胞仪购自Cytoflex公司；Odyssey成像系统购自LI-COR公司；激光共聚焦显微镜购自Olympus公司。

1.4 方法

1.4.1 病毒感染 　　将ASFV分别接种在PAMs和RBCs细胞中，并补充10%胎牛血清、2 mmol·L^－1 L-谷氨酰胺、100 U·mL^－1青霉素、100 U·mL^－1链霉素和0.4 mmol·L^－1非必需氨基酸的培养基，并将细胞放置于5% CO₂的37 ℃培养箱中培养。

1.4.2 病毒HAD₅₀测定 　　参照Zhao等^[14]的方法，将原代PAMs培养在96孔板中，并将病毒液进行10倍被比稀释为8个梯度，感染于96孔板中接种的PAMs，在含有5% CO₂的37 ℃细胞培养箱中孵育1 h后，弃掉上清液后换成10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，同时添加含有1%的猪RBCs，在7 d内观察HAD现象，并使用Reed和Muench方法计算ASFV的HAD₅₀^[15]。

1.4.3 病毒侵染检测试验 　　将ASFV接种PAMs和猪RBCs，并采用流式细胞术来检测ASFV是否入侵猪RBCs。十八烷基罗丹明B(R18)是一种不溶于磷脂的亲脂性探针，可插入病毒包膜^[16]。当R18插入脂质膜后，R18的荧光会自猝灭，当病毒囊膜与细胞膜融合时，探针逐渐被稀释并释放荧光信号(Ex/Em=560/590 nm)，采用流式细胞仪通过检测荧光信号可以判断病毒对细胞的入侵^[17]。本研究将5 mL ASFV (HAD₅₀=10^-5·0.1 mL^－1)的病毒液与5 μL R18染料(3 μmol·L^－1)混合并在37 ℃细胞培养箱中避光孵育20 min。随后，将混合物接种至分别铺有1×10⁵细胞数的原代PAMs或猪RBCs的24孔板中，将其置于4 ℃冰箱中孵育1 h以使病毒黏附到细胞表面。接下来，将板转移到37 ℃细胞培养箱中培养1 h以使病毒进入细胞。此外，将5 mL RPMI-1640培养基和5 μL R18混合并接种细胞作为阴性对照。孵育后，收集PAMs和RBCs并使用流式细胞仪检测入侵病毒的百分率。

1.4.4 细胞凋亡检测 　　使用Annexin Ⅴ-APC细胞凋亡检测试剂盒测定RBC凋亡情况，通过Cytoflex流式细胞仪和Cyexpert软件进行检测和结果分析。作者在1、3、5和7 d的4个时间点检测感染0.1、1、3 MOI ASFV的RBC凋亡情况。将接种5×10⁵RBCs的12孔细胞培养板中上清液弃掉，用1 mL PBS冲洗后接种ASFV，4 ℃冰箱放置1 h后转移至5% CO₂的37 ℃细胞培养箱中，孵育1 h后更换含有10% FBS的RPMI-1640培养基；随后，将细胞置于37 ℃细胞培养箱中进行培养。在接种ASFV后的1、3、5和7 d收集红细胞并使用Annexin V-APC细胞凋亡检测试剂盒处理细胞，通过流式细胞术检测RBCs凋亡情况。

1.4.5 Western blot试验 　　将处理并收集的细胞在添加有蛋白酶抑制剂的RIPA蛋白裂解液中裂解，并添加4×Laemmle SDS-PAGE缓冲液(含有DL-二硫苏糖醇)在100 ℃下加热15 min变性。然后根据说明书在SDS-PAGE凝胶上分离蛋白质并使用Trans-Blot Turbo快速转移系统将蛋白转移到硝酸纤维素(NC)膜上。使用5%脱脂牛奶(溶解在Tris缓冲盐水中)在37 ℃下封闭NC膜1 h，然后与兔源Cleaved-Caspase3单克隆抗体室温下孵育1 h或在4 ℃下孵育过夜。使用洗涤缓冲液(含0.1% Tween20的TBS)将膜洗涤3次(每次15 min)，并与IRDye^Ⓡ 800CW红外山羊抗兔源二抗在37 ℃下孵育1 h。将NC膜在洗涤缓冲液中洗涤3次，并使用Odyssey成像系统成像以显示蛋白质条带。α-Tublin蛋白用作蛋白上样内参。

1.4.6 PBMs吞噬能力检测 　　分别将接种1 MOI ASFV 1、2、3、4、5、6和7 d的5×10⁵RBCs与10 μL黄绿色荧光微球悬浮液一起添加到接种有5×10⁵PBMs的12孔细胞培养板中，12 h后弃掉细胞上清液，并在孔板中加入1 mL PBS后放在室温摇床上进行洗涤，共洗3次，每次15 min，以将未被吞入的黄绿色荧光微球充分清洗掉，使用DAPI对PBMs进行细胞核染色，5 min后用PBS在室温摇床上洗涤3次，每次5 min，随后通过激光共聚焦显微镜观察PBMs细胞对各组黄绿色荧光微球的吞噬数量。

2 结果 2.1 ASFV诱导RBCs发生凋亡

为探讨ASFV吸附RBCs后对RBCs的影响，本研究检测了接种ASFV的RBCs的凋亡情况。参照Zhao等^[14]的方法测得ASFV的HAD₅₀结果为10^-6.875·mL^－1。使用0.1 MOI ASFV接种1、3、5和7 d后，RBCs的凋亡百分率分别为1.27%、3.23%、7.39%和8.56%。使用1 MOI ASFV接种1、3、5、7 d后细胞的凋亡百分率分别为1.54%、3.73%、8.46%和10.74%。使用3 MOI ASFV接种1、3、5和7 d后，细胞的凋亡百分率分别为2.65%、5.01%、12.44%和18.61%(图 1A)。接种0.1、1、3 MOI ASFV的1、3、5、7 d后，检测RBCs中Cleaved-caspase3蛋白表达水平，发现随着接种剂量和时间的增加，细胞凋亡Cleaved-caspase3蛋白的表达水平显著上调(图 1B)。以上结果表明，ASFV以剂量和时间依赖性诱导RBCs发生凋亡。

2.2 感染ASFV的PAMs产生HAD现象

在接种GZ201801-ASFV后，即使在接种了100倍稀释病毒的孔中PAMs也显示出明显的HAD现象(图 2)。证实基因Ⅱ型ASFV具有吸附RBCs的能力。

2.3 ASFV侵染PAMs而非RBCs

本研究以ASFV易感PAMs为阳性对照，通过检测ASFV病毒囊膜和细胞膜的融合来判断ASFV是否侵入RBCs。通过流式细胞仪检测R18在细胞膜表面的荧光，结果显示，ASFV感染的PAMs中具42.14%的细胞检测到荧光，表明ASFV可以有效侵入PAMs；而ASFV处理的RBCs中未检测到有荧光的细胞(0.2%在仪器误差范围内)，表明ASFV不具有侵染RBCs的能力(图 3)。

2.4 凋亡RBCs促进PBMs的吞噬作用

为确定凋亡的RBCs是否影响PBMs的吞噬能力，使用黄绿色荧光微球浮液来检测PBMs吞噬能力的变化。用1 MOI ASFV处理RBCs 1、2、3、4、5、6和7 d后收集RBCs，并将处理的RBCs与黄绿色荧光微球悬浮液一起添加到PBMs中。12 h后，通过激光共聚焦显微镜观察PBMs对黄绿色荧光微球的吞噬数量。结果显示，随着ASFV对RBCs处理的时间增加，被PBMs吞噬的黄绿色荧光微球数逐渐增加(图 4)，蓝色为细胞核，绿色为荧光微球。通过对接种ASFV的RBCs和PBMs进行吉姆萨染色，红色箭头为加入培养PBMs中的RBCs，发现随着ASFV处理RBCs时间的增加，PBMs吞噬RBCs数逐渐增加(图 5)。结果表明，随着ASFV诱导RBCs凋亡数的增加，PBMs的吞噬能力也显著增强。

3 讨论

RBCs是血液中最丰富的血细胞类型，它们也是无脊椎动物通过血液运输氧气的最重要介质，并且具有重要的免疫功能。RBCs程序性死亡的正常生理过程受多种内外因素影响，如氧化应激、渗透性休克、病原体感染、供能不足等。这些内在或外在因素对RBCs造成一定程度的损伤后，机体会加速受损RBCs程序性死亡，避免受损细胞破裂溶血，进一步引发炎症反应。本研究发现ASFV可诱导RBCs发生凋亡，凋亡的RBCs能促进PBMs的吞噬作用。因此，研究ASFV诱导RBCs凋亡的机制，将有助于更深入地了解ASFV的致病机制。红细胞膜由双层磷脂组成，内层含有磷脂酰丝氨酸(PS)，细胞发生凋亡后，PS外翻到细胞膜外并被携带PS受体的巨噬细胞迅速识别，从而吞噬凋亡的RBCs^[18]。RBCs暴露于Ca²⁺离子载体离子霉素后诱导细胞皱缩、细胞膜起泡形成凋亡小体和PS外翻，随后在细胞表面暴露PS，发生细胞凋亡，PS暴露在细胞膜外表面会刺激吞噬细胞吞噬凋亡的RBCs^[19], 迅速将凋亡的RBCs从血液循环中清除，从而避免血液循环中存在有害的RBCs发生溶血和血红蛋白(Hb)释放^[20]。PBMs是ASFV的靶细胞，当ASFV侵染猪体内后病毒进入血液感染PBMs，ASFV能诱导血液中RBCs发生凋亡并促进PBMs的吞噬功能，导致PBMs吞噬和感染病毒的数量增加。因此猜测ASFV诱导RBCs发生凋亡并促进单核细胞的吞噬功能是ASFV感染靶细胞的另一种方式。当ASFV感染PBMs时，受感染的PBMs会失去吞噬血液中凋亡RBCs的能力^[21]，这种现象可能与ASFV感染引起的溶血性贫血症状有关。此外，PS外翻后会增加红细胞之间的黏附程度，增大了红细胞与血管壁之间的摩擦力，并增加了细胞凋亡诱导的RBCs细胞膜的通透性，从而导致细胞质释放的Ca²⁺激活纤维蛋白和血小板，活化血小板产生纤维蛋白^[22]，这导致细胞黏附和聚集成明显的丝状发射状态，从而增加全血的黏度导致血管阻塞和血栓形成。

综上所述，虽然ASFV在感染猪后会吸附于RBCs，加速病毒在全身的传播，但ASFV不能侵染RBCs。说明RBCs不能成为潜在的ASFV靶细胞，然而ASFV可诱导RBCs发生凋亡并提升PBMs的吞噬能力。因此，阻止ASFV吸附RBCs可能会下调ASFV引起的RBCs凋亡水平，从而降低ASF感染引发的自身免疫性溶血性贫血的发生率。深入研究ASFV诱导RBCs细胞膜的脂质代谢、离子通道的激活等，可为ASF的防治提供更全面的理论依据。尽管针对ASF的疫苗正处于研发阶段，但仍需要对ASFV的致病机制进行深入研究。因此，通过阐明ASFV与宿主细胞的相互作用，可以对ASF实施更有效的预防、控制和治疗措施，以降低ASF对养猪业和国民经济造成的危害。

4 结论

本试验检测ASFV对RBCs的作用，发现ASFV不能入侵RBCs，但以时间和剂量依赖性方式诱导RBCs发生凋亡。同时，通过吉姆萨染色试验和绿色荧光微球的处理发现，凋亡的RBCs可以增加PBMs的吞噬功能，ASFV诱导RBCs凋亡的百分比越高，PBMs的吞噬能力越强，表明这种现象是加剧宿主ASFV感染传播的另一种方式。本研究为ASFV的感染传播和致病机制的研究提供理论基础。