2. 西北农林科技大学动物医学院, 杨凌 712100;
3. 江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心, 扬州 225009
, LI Xiang1, WENG Maoyang2, JIN Qianyue1, GUO Junqing1, XING Guangxu1, ZHANG Gaiping1,2,3
2. Northwest Agricultural & Forest University, College of Veterinary Medicine, Yangling 712100, China;
3. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China
伪狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)是具有囊膜的双链DNA病毒，基因组大小约140 kb，编码至少70个蛋白，属于α-疱疹病毒亚科(Alphaherpesvirinae)，水痘病毒属(Varicellovirus)[1]。猪是PRV的唯一自然宿主，PRV感染猪后引起的疾病称为伪狂犬病(pseudorabies, PR)，常见的临床表现包括母猪繁殖障碍、仔猪神经症状以及中大猪呼吸道症状等[2-3]。PRV在我国猪群中具有较高的流行率，是危害我国养猪业的重要病原之一。此外，PRV还可感染狗、猫、牛、羊、狐狸、水貂和狼等多种动物，具有很广的感染谱，且除了猪以外，其他动物多在感染后24~48 h内死亡[4]。
US3蛋白是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，存在于所有的α-疱疹病毒亚科成员中，也是PRV的一个重要毒力蛋白[5]。研究显示，US3可以诱导丝切蛋白(cofilin)去磷酸化和RhoA蛋白的磷酸化，从而影响细胞骨架重排[6-7]；可以通过降解Bcl-2相关转录因子1(Bcl-2 associated transcription factor 1，Bclaf1)和诱导IRF3的高度磷酸化来抑制Ⅰ型干扰素信号[8]；通过激活PI3-K/Akt和NF-κB信号通路来调控抗凋亡基因的表达等[9]。但目前对US3参与的生物学过程及其分子机理的揭示还很有限，有必要深入发掘鉴定新的和US3互作的宿主蛋白，从而进一步拓展对US3生物学功能的认知。
膜联蛋白A2(annexin A2，ANXA2)是一个具有多种生物学功能的钙磷脂结合蛋白，参与囊泡转运、细胞骨架膜动力学和信号转导等多个生物学过程[10-11]。在病毒感染过程中也发挥着重要作用，有报道显示，ANXA2可以和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的Nsp9互作，从而促进PRRSV在MARC-145细胞上的增殖[11]；ANXA2还可以和宿主波形蛋白(vimentin)互作，来促进PRRSV和猪圆环病毒2型(PCV2)的复制[12]；ANXA2可以和猪瘟病毒(CSFV)NS5A和E2蛋白互作，促进CSFV在PK-15细胞上的增殖[13]。但目前尚没有针对ANXA2是否影响PRV复制增殖的相关研究报道。
本研究中，作者通过免疫共沉淀和pull-down分析验证了US3和ANXA2的相互作用，发现抑制ANXA2的表达可以显著影响PRV的增殖，过表达ANXA2对PRV和凋亡刺激剂诱导的细胞凋亡具有负调控作用。
1 材料与方法 1.1 材料PK-15细胞和3D4/21细胞由本实验室保存；PRV毒株HeNLH/2017(GenBank：MT775883)由本实验室从临床病料中分离鉴定[3]；小干扰RNA由上海吉玛公司合成，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；pEGFP-C1、pEGFP-N1和pCMV-3xflag质粒由本实验室保存；pEGFP-US3、pEGFP-ANXA2、pCMV-3xflag-US3、pCMV-3xflag-A2和pEASY-Blunt-UL54重组质粒由本实验室构建并保存；Flag亲和磁珠购自ThermoFisher Scientific公司，GFP-Trap磁珠购自ChromTek公司；PRV gE蛋白单克隆抗体由本实验室制备、保存。
1.2 试剂无内毒素质粒提取试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司；转染试剂Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；Q5超保真酶和限制性内切酶购自NEB公司；核酸提取试剂Mini Best Virus DNA/RNA Extraction kit和反转录试剂Prime ScriptTM RT reagent kit购自TaKaRa公司；TRIzolR Reagent购自索莱宝生物科技有限公司；RIPA细胞裂解液和细胞凋亡刺激剂(apoptotic stimulator)购自碧云天生物技术公司；ECL超敏化学发光液(P10300)购自新赛美公司；SYBR Green荧光定量试剂购自Roche公司；ProteoSilverTM Stain Kit银染试剂购自Sigma公司；GFP抗体(D5.1)、ANXA2抗体(D11G2)、Caspase-3抗体和Cleaved Caspase-3抗体购自Cell Signaling Technology公司；Flag抗体和β-tubulin抗体购自Abbkine公司；AnnexinV-APC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自凯基生物公司。
1.3 US3潜在互作蛋白发掘pEGFP-N1和pEGFP-US3分别转染PK-15细胞，24 h后收取蛋白样品，并用GFP-Trap磁珠进行pull-down，制备的蛋白样品跑SDS-PAGE，按照ProteoSilverTM Stain Kit银染试剂的说明书进行银染，待加入终止液后，在白色背景板下比较银染后的pEGFP-N1和pEGFP-US3组的样品条带，用干净刀片切取差异性条带，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行LC-MS质谱分析。
1.4 免疫共沉淀和pull-down分析pEGFP-ANXA2、pEGFP-N1、pCMV-3xflag和pCMV-3xflag-US3分别进行两两组合，转染HEK 293T细胞，转染36 h后，用Flag亲和磁珠和GFP-Trap磁珠分别进行免疫共沉淀分析。取pCMV-3xflag和pCMV-3xflag-US3质粒转染PK-15细胞，36 h后收取蛋白样品，用Flag亲和磁珠进行pull-down，用ANXA2和Flag抗体进行免疫印迹分析。
1.5 荧光定量RT-PCR利用TRIzolR法分别提取RNAi对照组和处理组细胞的总RNA，然后进行反转录获得cDNA，以获得的cDNA为模板，通过检测ANXA2和内参基因GAPDH的mRNA含量来验证ANXA2在转录水平的敲低效果；利用绝对荧光定量PCR评估敲低ANXA2的表达对PRV基因组复制的影响，按照病毒DNA/RNA提取试剂盒的说明书进行RNAi对照组和处理组病毒核酸的提取。然后以pEASY-Blunt-UL54质粒标准品建立标准曲线，用建立的针对PRV UL54基因的荧光定量PCR进行扩增，并根据标准曲线计算基因的拷贝数，用来代表各组中PRV DNA的含量。具体的引物和siRNA序列见表 1。
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表 1 引物和siRNA序列信息 Table 1 The primers and siRNA sequence information |
采用半数细胞培养物感染量(50% tissue culture infective dose，TCID50)来进行测定，将PK-15细胞以1.0 ×104个细胞·孔－1铺于96孔板，待每个孔的单层细胞长至90%的丰度时，弃去上清培养基，用PBS润洗3次；然后加入用DMEM细胞维持液(含2.0%FBS)10倍倍比稀释的病毒液样品，获得稀释度依次为10－1~10－10的待测病毒稀释液；96孔板的第一列对应10－1稀释度的混合液，第二列对应10－2稀释度的混合液，依次类推，最后两列作为空白组，加入无病毒液的维持液，每个稀释度设8个重复。置于细胞培养箱，培养3~5 d，期间在显微镜下观察PRV感染引起的细胞病变情况，记录每个稀释度发生细胞病变的孔数，用Reed-Muench法计算TCID50。
1.7 Western blot分析利用RIPA细胞裂解液收取细胞蛋白样品，制备的蛋白样品经变性处理后，取适量加到12.0%变性蛋白预制胶上样孔中进行电泳(SDS-PAGE)，然后经过转印将蛋白转移至硝酸纤维素膜，用5.0%的脱脂奶粉(0.5%PBST配制)对膜进行室温封闭2 h，接着分别用特异性的一抗或二抗(见“1.2”)继续室温孵育1 h，最后将配制的ECL超敏化学发光液均匀加到PVDF膜上，置于凝胶成像扫描仪调整合适的曝光时间进行观察。
1.8 流式细胞术PRV感染或者凋亡刺激剂刺激PK-15细胞，在指定时间点收取细胞，并用PBS进行悬浮，按照说明书用Annexin V-APC/PI对细胞进行避光染色5 min，然后使用Beckman CytoFLEX设备进行流式细胞检测分析，所有数据使用CytExpert软件进行分析处理。
1.9 数据统计荧光定量PCR/RT-PCR、病毒滴度测定和细胞凋亡的流式分析试验均进行了3次重复，各组数据用GraphPad Prism软件中的t检验或者ANOVA方法进行统计学差异性分析。P < 0.05(*)表示差异显著，P < 0.01(**)表示差异极显著，ns表示无显著差异。
2 结果 2.1 US3潜在互作蛋白筛选通过蛋白pull-down、银染和串联质谱(LC-MS)分析，发现了多个与PRV US3蛋白具有潜在相互作用的宿主蛋白(表 2)。
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表 2 LC-MS质谱分析结果 Table 2 The results of LC-MS mass spectrometry |
pEGFP-ANXA2与pCMV-3xflag-US3，pEGFP-N1与pCMV-3xflag-US3，pEGFP-ANXA2与pCMV-3xflag分别共转染HEK 293T细胞，收取蛋白样品后，用Flag亲和磁珠或GFP-Trap磁珠分别进行免疫共沉淀分析。结果如图 1所示，Flag亲和磁珠进行免疫沉淀分析时，可以检测到特异的GFP-ANXA2条带(图 1A)；GFP-Trap磁珠进行免疫沉淀分析时，可以检测到特异性的Flag-US3条带(图 1B)。进一步用pCMV-3xflag和pCMV-3xflag-US3质粒转染PK-15细胞，36 h后收取蛋白样品，用Flag亲和磁珠进行pull-down，分别用ANXA2和Flag抗体进行免疫印迹分析，结果显示，US3可以和内源性的ANXA2发生特异的相互作用(图 1C)。
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A、B.免疫共沉淀验证外源性ANXA2和US3的互作；C.Pull-down分析US3和内源性ANXA2的互作 A, B. The interaction between ANXA2 and US3 was detected by co-IP assay in vitro; C. The interaction between ANXA2 and US3 was verified by pull-down assay in vivo 图 1 ANXA2蛋白和US3蛋白之间的相互作用 Fig. 1 The interaction between ANXA2 and US3 |
PK-15细胞转染小干扰RNA 36 h后，用相对荧光定量PCR和免疫印迹法检测ANXA2转录和表达的抑制效果，结果如图 2A和B所示，Si ANXA2-670#序列对的基因沉默效果最好，选择该序列进行后续的试验。为进一步验证ANXA2对PRV增殖的影响，PK-15细胞转染Si NC和Si ANXA2-670# 36 h后，用PRV进行感染(MOI=0.1)，在指定的时间点收取样品，通过分析基因拷贝数、病毒滴度和gE蛋白的表达水平(图 2C~E)，结果发现，与Si NC组相比较，敲低ANXA2的表达后显著抑制了PRV在PK-15细胞上的复制增殖。
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A、B. qRT-PCR和免疫印迹评估ANXA2的敲低效果；C. 病毒基因含量的检测；D. 病毒滴度(TCID50)的检测；E. 病毒蛋白表达水平分析；*. P < 0.05, **. P < 0.01, ***. P < 0.001, ns. P>0.05 A, B. ANXA2 expression levels were elevated by qRT-PCR and Western blot; C. PRV genome copy numbers detected by qPCR; D. Viral load (TCID50) detected by virus titration; *. P < 0.05, **. P < 0.01. ***. P < 0.001, ns. P>0.05 图 2 敲低ANXA2的表达抑制PRV在PK-15细胞上的增殖 Fig. 2 Knockdown of ANXA2 in PK-15 cells inhibits the proliferation of PRV |
细胞凋亡是宿主细胞抵抗各种病原微生物感染的关键防御机制，作者分析了PRV感染对细胞凋亡的影响。结果如图 3所示，3D4/21细胞(图 3A)和PK-15细胞(图 3B)感染PRV(MOI=0.1)的指定时间点收集蛋白样品，通过免疫印迹检测显示，与对照组相比，凋亡效应蛋白Caspase-3发生了明显的活化剪切；进一步的利用流式细胞仪检测Annexin V和PI染色细胞情况，发现PRV感染后，Annexin V和PI双染的晚期凋亡细胞明显增多(图 3C)。这些结果表明，PRV感染宿主细胞后会诱导细胞凋亡的发生。
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A、B. Western blot分析caspase-3剪切体蛋白水平的变化；C. 流式细胞术分析细胞凋亡情况 A, B. The cleaved caspase-3 were detected by Western blot; C. The cell death percentage was analyzed by flow cytometry 图 3 PRV感染诱导细胞凋亡 Fig. 3 The apoptosis induced by PRV infection |
有研究报道ANXA2可以抵抗X射线辐射诱导的细胞凋亡[14]，但ANXA2是否参与了病毒感染诱导的细胞凋亡调控尚不清楚。在PK-15细胞上分别过量或敲低ANXA2的表达，然后用PRV进行感染(MOI=0.1)24 h，收取蛋白样品进行免疫印迹分析。其中PRV US3蛋白是已知的具有抑制细胞凋亡的作用，作为阳性对照。结果显示，在过表达ANXA2的条件下(图 4A)，ANXA2对PRV诱导的细胞凋亡显示出了明显的抑制效应；而敲低ANXA2的表达后(图 4B)，则对PRV诱导的细胞凋亡具有显著的促进作用。
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A. 过表达ANXA2抑制PRV感染诱导的细胞凋亡；B. 敲低ANXA2的表达促进PRV感染诱导的细胞凋亡 B. Overexpression of ANXA2 inhibited the apoptosis induced by PRV infection; B. Knockdown the expression of ANXA2 promoted the apoptosis induced by PRV infection 图 4 ANXA2蛋白影响PRV感染诱导的细胞凋亡 Fig. 4 The ANXA2 protein affects the apoptosis induced by PRV infection |
为进一步验证ANXA2对细胞凋亡的影响，同样在过表达或敲低ANXA2表达的条件下，用凋亡刺激剂刺激PK-15细胞10 h，然后收集样品用对应的抗体进行免疫印迹分析。结果如图 5A和B所示，ANXA2对凋亡刺激剂诱导的细胞凋亡具有显著的抑制作用。
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A. 过表达ANXA2抑制凋亡刺激剂诱导的细胞凋亡；B. 敲低ANXA2的表达增强凋亡刺激剂诱导的细胞凋亡 B. Overexpression of ANXA2 inhibited the apoptosis induced by apoptotic stimulator; B. Knockdown the expression of ANXA2 inhanced the apoptosis induced by apoptotic stimulator 图 5 ANXA2蛋白影响凋亡刺激剂诱导的细胞凋亡 Fig. 5 The ANXA2 protein affects the apoptosis induced by apoptotic stimulator |
PK-15细胞在ANXA2敲低或过表达的条件下，用凋亡刺激剂刺激2 h后，收取细胞用Annexin V-APC/PI凋亡检测试剂盒对细胞进行染色，然后进行流式细胞仪检测。结果如图 6A和B所示，敲低ANXA2的表达对凋亡刺激剂诱导的细胞凋亡呈现出促进效应，而过表达ANXA2的条件下，则表现出显著的抑制细胞凋亡的效应。
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A. 过表达ANXA2抑制凋亡刺激剂诱导的细胞凋亡；B. 敲低ANXA2的表达增强凋亡刺激剂诱导的细胞凋亡。**.P < 0.01 B. Overexpression of ANXA2 inhibited the apoptosis induced by apoptotic stimulator; B. Knockdown the expression of ANXA2 enhanced the apoptosis induced by apoptotic stimulator. **.P < 0.01 图 6 流式细胞术分析ANXA2对细胞凋亡的影响 Fig. 6 The effects of ANXA2 to apoptosis were evaluated by flow cytometry assay |
US3蛋白激酶是一个在α疱疹病毒中高度保守的蛋白，已有的研究显示US3蛋白参与了细胞骨架重排、免疫调控和细胞凋亡等多个生物学过程，是PRV进入细胞后的入核和出核过程的重要调控蛋白[8, 15-16]。关于US3互作蛋白的筛选鉴定将有助于更好地理解US3蛋白的生物学功能，如Jansens等[5]利用磷酸化组学分析了过表达US3的条件下对宿主蛋白磷酸化的影响，鉴定发现了14个显著去磷酸化的蛋白和64个显著磷酸化的蛋白。在前期试验中，通过在PK-15细胞过表达GFP-US3蛋白，然后利用GFP-Trap磁珠pull down，结合银染和蛋白质谱技术(LC/MS)，发现宿主ANXA2是一个潜在的与US3互作蛋白。在本研究中，作者通过免疫共沉淀技术和pull-down技术进一步验证了ANXA2和US3的相互作用。ANXA2作为一个新鉴定的和US3互作的宿主蛋白，拓展了对US3蛋白作用底物的认识，其具体行使的生物学功能及分子机制还有待进一步深入研究。
ANXA2在PRV感染过程中的作用尚不清楚。有研究显示，PRV感染神经细胞后，可以刺激轴突处局部的蛋白合成，丰度较高的蛋白有ANXA2和外周蛋白(peripherin)，这些蛋白参与了PRV在神经细胞的逆向转运过程[17]。在对PRV病毒粒子包含宿主蛋白成分的鉴定研究中，也发现了ANXA2存在于成熟的病毒粒子中[18]。本研究中，作者利用小RNA干扰技术来抑制ANXA2的表达，发现敲低ANXA2的表达，可以显著抑制PRV在PK-15细胞上的复制增殖。结果提示ANXA2在PRV复制增殖的过程中发挥着一定的作用。
细胞凋亡是宿主细胞抵抗各种病原微生物感染的重要防御机制之一[19-20]。有报道显示，US3可以通过激活PI3-K/Akt和NF-κB信号通路来抑制PRV感染诱导的细胞凋亡[9]；而也有报道显示，在P53基因诱导的凋亡过程中，ANXA2的表达受到显著抑制，ANXA2也可以抵抗X射线诱导的细胞凋亡[10]。本研究中，作者通过免疫印迹和流式细胞术，验证了过表达ANXA2对PRV和凋亡刺激剂诱导的细胞凋亡的影响，确定了ANXA2具有负调控细胞凋亡的作用，但其具体的分子机制尚需要进一步的研究证实。
4 结论ANXA2是一个新的可以和PRV US3蛋白相互作用的宿主蛋白，PRV的复制增殖需要ANXA2的参与，ANXA2具有负调控细胞凋亡的作用。
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(编辑 白永平)