2. 中国科学院亚热带农业生态研究所 动物营养生理与代谢过程实验室，长沙 410000;
3. 岭南现代农业科学与技术广东省实验室，广州 510000
2. Laboratory of Animal Nutrition Physiology and Metabolic Processes, Institute of Subtropical Agriculture, Chinese Academy of Sciences, Changsha 410000, China;
3. Guangdong Laboratory for Lingnan Modern Agriculture, Guangzhou 510000, China
宁乡猪是我国优良的地方猪种之一，具有早熟易肥、适应性广、肉质鲜美等特点，因而深受消费者喜爱[1-2]。有研究表明，肌内脂肪(IMF)含量是影响猪肉品质的重要因素之一[3-4]，与杜长大三元杂交商品猪相比，宁乡猪IMF含量更高[5]，但由于未经历高强度选育，其变异也较大，十分不利于优质猪肉的标准化生产。因此，鉴别影响宁乡猪IMF含量的基因，并利用标记辅助选择方法来稳定和提升其IMF含量十分必要。本研究通过对IMF相关基因遗传变异的综合分析，以期筛选出影响宁乡猪IMF含量的基因位点，为宁乡猪IMF含量性状的分子标记辅助选育提供科学依据。
脂肪酸结合蛋白(FABPs)是一类在哺乳动物组织中表达的胞浆蛋白，能够结合脂肪酸和其他疏水性配体[6]。FABPs属于细胞内类脂结合蛋白家族，参与细胞内长链脂肪酸的转运，可将脂肪酸从细胞膜运送到脂肪酸氧化位点及其与甘油二酯及磷脂的合成位置[7]，研究发现FABPs能够调节细胞内脂肪的合成和转运[8]。猪的H-FABP基因5′UTR区和第二内含子处存在与IMF相关的多态性位点，是影响IMF含量的重要候选基因之一[9]。哺乳动物的A-FABP基因参与了甘油三酯的生成过程[10]，直接影响了IMF的含量，对脂肪代谢有重要的调控作用。基因单倍型与表型的关联分析比SNP位点与表型的关联分析更加准确，分析基因单倍型与性状的相关性可以提高表型分析的准确性。另外，有研究指出，通过对不同猪种背最长肌差异表达基因的筛选，发现SLC13A5基因Bsu36 I多态性酶切位点(NC_010454.4:g.50705299T/C)以及NR1H4基因Mwo I多态性酶切位点(NM_001206993:g.83607915G/A)均与IMF含量显著相关[11-12]。本研究的目的在于检测FABPs、SLC13A5和NR1H4基因在宁乡猪上的多态性，为宁乡猪育种工作提供有效分子标记。
1 材料与方法 1.1 试验材料本研究中试验动物来自宁乡大龙猪场，选择达到上市屠宰日龄的172头宁乡公猪。所有猪只均在相同的饲养管理条件下育肥至屠宰，屠宰前24 h禁食，提供自由饮水。屠宰后采集背最长肌样品，于-20 ℃冷冻保存。
1.2 DNA的提取采用传统的苯酚-氯仿抽提法提取组织DNA，测定DNA浓度，根据测定出的样品浓度，用灭菌水稀释DNA至20 ng·mL-1，-20 ℃保存备用。
1.3 IMF含量的测定试验猪屠宰后立即采集左半侧胴体腰椎处背最长肌约50 g，并参照文献[13]采用索氏抽提法进行肌内脂肪提取。
1.4 引物设计合成与PCR扩增根据GenBank注册的X98558和Y16180序列，在H-FABP基因5′上游区和第二内含子区用Primer 5.0设计2对引物。从NCBI下载猪A-FABP基因组序列(GenBank登录号：Y16039)设计引物。依据参考文献[11-12]报道的序列设计SLC13A5和NR1H4基因的引物(表 1)。所有引物均由北京擎科生物科技有限公司合成。
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表 1 H-FABP、NR1H4、A-FABP和SLC13A5的引物序列 Table 1 Primer sequences of H-FABP, NR1H4, A-FABP and SLC13A5 |
PCR扩增体系(25 μL)：Mix 12.5 μL，模板DNA 5 μL，上、下引物(10 μmol·L-1)各1 μL，灭菌蒸馏水5.5 μL。PCR扩增条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，退火15 s，72 ℃延伸15 s，共34个循环；最后72 ℃延伸5 min。PCR产物由1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，要求目的条带清晰、单一无杂带，将符合条件的PCR产物进行酶切试验。
1.5 基因分型H-FABP应用限制性内切酶Hinf Ⅰ、Hae Ⅲ和Msp Ⅰ进行PCR-RFLP分型。Hinf Ⅰ酶切体系(30 μL)：PCR扩增产物10 μL，Buffer 2 μL，限制性内切酶1 μL，灭菌蒸馏水17 μL；37 ℃反应5~15 min。Hae Ⅲ和Msp I酶切体系(31 μL)：PCR扩增产物10 μL，Buffer 2 μL，限制性内切酶1 μL，灭菌蒸馏水18 μL；37 ℃反应1~16 h。酶切产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。H-FABP基因酶切后等位基因的判定及酶切片段的长度见表 2。A-FABP、SLC13A5和NR1H4基因经PCR扩增，获得的良好产物由上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。测序结果用DNAMAN系列软件进行比对分析。
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表 2 H-FABP基因等位基因的判定及酶切片段的长度 Table 2 Determination of alleles of H-FABP gene and length of digested fragments |
群体中的遗传组成用基因型频率和基因频率表示。遗传标记多态程度的常用指标有纯合度(Ho)、杂合度(He)、有效等位基因数(Ne)、多态信息含量(PIC)等。PIC可以用来表示群体中某一位点多态性的程度，PIC>0.5为高度多态，PIC < 0.25为低度多态，0.25 < PIC < 0.5为中度多态[14]。卡方检验判断群体中基因型分布是否处于Hardy-Weinberg平衡状态。
H-FABP基因的Hinf Ⅰ(SNP1)和Hae Ⅲ(SNP2)多态性位点间的连锁不平衡分析采用Haploview软件，采用R语言haplo.stats程序包进行单倍型种类及其频率的分析。采用SPSS 26统计分析软件的GLM(general linear model)程序分析不同基因型与IMF含量的相关性，统计模型为：
| $ Y=\mu+D+R+e $ |
式中，Y为肌内脂肪含量测量值；μ为群体均值；D为体重效应；R为基因型效应；e为随机残差效应。
2 结果 2.1 PCR产物扩增结果扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行检测(图 1)。结果显示，扩增片段与目的片段大小一致且特异性较好，可直接进行RFLP或测序。
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A. H-FABP基因706 bp的PCR产物；B. H-FABP基因816 bp的PCR产物；C. NR1H4基因761 bp的PCR产物；D. A-FABP基因783 bp的PCR产物；E. SLC13A5基因815 bp的PCR产物 A. 706 bp PCR product of H-FABP gene; B. 816 bp PCR product of H-FABP gene; C. 761 bp PCR product of NR1H4 gene; D. 783 bp PCR product of A-FABP gene; E. 815 bp PCR product of SLC13A5 gene 图 1 PCR产物电泳图 Fig. 1 Electrophoresis of PCR products |
在706 bp的扩增片段上存在4个Hinf Ⅰ酶切位点，产生339、172、110、59及26 bp共5个片段，其中第1 324 bp具有多态性，产生了HH、Hh、hh三种基因型；在816 bp扩增片段中存在3个Hae Ⅲ酶切位点，产生405、278、117及16 bp共4个片段，其中第1 811 bp处为多态性酶切位点，产生了DD和Dd两种基因型；在816 bp扩增片段中存在1个Msp Ⅰ酶切位点，产生727、89 bp两个片段，仅检测出AA一种基因型(图 2)。
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A. H-FABP基因Hinf I酶切分型结果图；B. H-FABP基因Hae III酶切分型结果；C. H-FABP基因Msp I酶切分型结果 A. Hinf I digestion results of H-FABP gene; B. Hae III digestion results of H-FABP gene; C. Msp I digestion results of H-FABP gene 图 2 H-FABP基因酶切分型结果 Fig. 2 Results of enzymatic digestion of H-FABP gene |
通过DANMAN和Chromas软件对宁乡猪A-FABP、SLC13A5和NR1H4基因PCR产物测序结果进行比对分析，结果见图 3。A-FABP基因测序结果显示，A-FABP基因783 bp扩增片段中没有发现SNP位点；在SLC13A5基因815 bp扩增片段中发现1个SNP位点(251 bp处)，存在3种基因型：BB型、Bb型和bb型；在NR1H4基因761 bp扩增片段中同样发现1个SNP位点(293 bp处)，测序结果显示共发现了TT、Tt和tt三种基因型。
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A.SLC13A5基因SNP测序峰图；B.NR1H4基因SNP测序峰图 A. SNP sequencing peak map of SLC13A5 gene; B. SNP sequencing peak map of NR1H4 gene 图 3 SLC13A5和NR1H4基因SNP测序峰图 Fig. 3 SNP sequencing peak map of SLC13A5 and NR1H4 genes |
经卡方适合性检验分析，Hinf Ⅰ-RFLP位点和NR1H4基因多态性位点上的等位基因频率和基因型频率都处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)，Hae Ⅲ-RFLP位点、SLC13A5基因多态性位点经卡方适合性检验，都未达到Hardy-Weinberg平衡状态(P < 0.05)，可能与试验群体数量少或近交程度有关。
从表 3可以看出，H-FABP-Hinf Ⅰ酶切位点、SLC13A5和NR1H4基因多态性位点的纯合度分别为0.62、0.54和0.62；多态信息含量分别为0.30、0.35和0.30，均属中度多态(0.25 < PIC < 0.50)；而H-FABP-Hae Ⅲ酶切位点多态信息含量仅有0.07，属于低度多态(PIC < 0.25)，说明该试验结果在一定程度上可作为有效的遗传标记，并作为该群体遗传资源评价的建议性指标。
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表 3 宁乡猪酶切位点多态性分析结果 Table 3 Results of polymorphism analysis of restriction sites in Ningxiang pigs |
宁乡猪多态性位点与IMF含量的关联分析结果见表 4。宁乡猪H-FABP基因Hinf Ⅰ位点酶切后3种基因型的IMF含量表现为Hh>HH>hh，其中Hh基因型与HH和hh基因型的IMF含量之间的差异达到极显著水平(P < 0.01)，HH基因型与hh基因型的IMF含量差异不显著(P>0.05)。在Hae Ⅲ酶切位点上，只出现了DD和Dd两种基因型，其中D等位基因占主导地位，Dd基因型IMF含量极显著高于DD基因型(P < 0.01)。
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表 4 宁乡猪群不同位点各基因型IMF含量的比较 Table 4 Comparison of IMF content of individuals with different genotypes at different sites in Ningxiang pigs |
H-FABP基因Msp Ⅰ酶切及A-FABP基因测序结果显示宁乡猪均不存在多态现象；SLC13A5基因多态性位点上检测出的3种基因型在IMF含量上无显著差异(P>0.05)，但呈现出bb>BB>Bb的趋势；NR1H4基因多态性位点处3种基因型间的IMF含量差异也不显著(P>0.05)。
2.6 宁乡猪H-FABP基因单倍型组合与IMF含量的关联分析连锁不平衡分析发现，H-FABP基因SNP1和SNP2位点处于强连锁不平衡状态(D′>0.72)。单倍型种类及其频率分析表明，H-FABP基因的2个SNPs位点在宁乡猪群体中共形成了3种单倍型(HD、hD和hd)，分别命名为H1、H2和H3，单倍型频率分别为0.74、0.22和0.03。根据2个突变位点的连锁不平衡结果，对H1~H3组成的每个个体的单倍型组合进行分析，共发现5种单倍型组合。
在形成的5种单倍型组合中，其中hD/hd单倍型组合样本数为1，不进行关联分析。用剩余4种单倍型组合与宁乡猪IMF含量性状进行关联分析，结果见表 5。H1H3(其序列为HD/hd)单倍型组合个体的IMF含量显著高于H1H2(其序列为HD/hD)单倍型组合个体(P < 0.05)，极显著高于剩余两种单倍型组合个体(P < 0.01)。因此，在本试验群体中H1H3单倍型组合个体具有最高的IMF含量。
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表 5 H-FABP基因单倍型组合及其与IMF含量性状的关联分析 Table 5 H-FABP gene haplotype combinations and their association with IMF content trait |
大量研究表明，猪IMF含量受多个基因影响[15-18]。Ockner等[19]首次从肠组织液中分离出FABP，进一步研究发现FABP能特异性的结合脂肪酸，参与细胞内脂肪的运输。在哺乳动物中FABPs家族至少有9种蛋白类型[20]。不同类型的FABP在不同的组织和细胞中表达，其中H-FABP在心肌、骨骼肌和乳腺中表达，A-FABP在脂肪细胞中表达[21]。本研究采用PCR-RFLP结合测序技术分析了宁乡猪H-FABP和A-FABP基因的遗传多态性，结果表明H和D为优势等位基因。宁乡猪H-FABP-Hinf Ⅰ位点存在多态性，等位基因H的频率为0.75，表现为中度多态(PIC=0.304 7)，与刘志成等[22]、张陈华等[23]及刘剑锋等[24]在不同猪种中的研究结果基本一致。采用最小二乘效应分析表明，基因型Hh对IMF含量的效应值最大，该结果与王存芳[25]、Gerbens等[26]对杜洛克等国外猪种的分析结果有所差异，导致这一现象的原因可能与中外猪群体的遗传背景不同有关。经分析，H-FABP基因Hae Ⅲ酶切位点Dd基因型的IMF含量最高，并且未检测到dd基因型，这与2003年柳小春等[27]报道的多态性结果一致，可能是由于dd基因型个体较少造成的，同时在一定程度上说明近20年来宁乡猪保种效果良好。林万华等[28-30]对国内外不同猪种Hae Ⅲ位点的多态性分析表明，不同猪种间多态性存在差异，等位基因频率也各有不同。目前，在动物生产中单倍型分析得到越来越多的应用，与单个SNPs位点分析相比，利用单倍型研究QTL与动物生产性能间的相关性，能够更准确的分析表型性状的遗传信息。房嘉园等[31]通过构建包含IGF-1R两种单倍型的表达载体，发现大型猪和小型猪IGF-1R胞外域编码区两种单倍型在转录和翻译水平上影响基因的表达，进而调控动物的生长发育。本研究对H-FABP基因的Hinf Ⅰ和Hae Ⅲ酶切位点进行单倍型分析，共形成3种单倍型、5种单倍型组合，其中H1H3是IMF含量性状的优势单倍型。
在H-FABP-Msp Ⅰ酶切位点上，所有被检测个体的基因型均为AA型。黄大鹏等[32]、Pang等[14]对国内外不同猪种的分析结果表明，此位点上杜洛克猪、长白猪和大白猪3个国外猪种均存在多态性，而地方猪种内江猪、荣昌猪、汉江黑猪和八眉猪为单态。林万华等[28]在杜洛克、长白、大约克、南昌白、二花脸、梅山、玉山黑猪等10个中外猪种上的研究结果也显示，除杜洛克猪外其他猪种在此位点均无多态。根据之前的报道及研究结果可以认为，中国地方猪种在Msp Ⅰ位点上缺乏多态性。
在A-FABP基因的Bsu36 Ⅰ酶切位点上，三江白猪、大白猪、东北民猪、长白猪和大河乌猪都存在多态性[32-35]，并且不同基因型间IMF含量存在显著差异。本研究在此位点上仅检测出一种基因型，可能原因是样本数相对较少，其他基因型在群体中出现的频率较低。目前，猪A-FABP基因的遗传多态性研究相对较少。在松辽黑猪和军牧1号白猪中，A-FABP基因遗传多态性与大理石纹之间存在一定的相关性[36-37]。有研究指出，在杜洛克猪A-FABP基因第1内含子区发现的1条微卫星序列，其多态性与IMF含量相关[38]。因此，利用该基因位点进行与宁乡猪肉质相关性状的选育有待更进一步的研究。
NR1H4基因在哺乳动物肌肉和脂质的能量代谢中起着重要的调节作用[38-39]，Yang等[40]利用PCR-RFLP技术在沙子岭猪NR1H4基因的第9外显子Mwo I酶切位点处检测到1个SNP，在产生的GG、GA和AA三种基因型中，G等位基因在沙子岭猪中频率较高，同时发现该基因在背肌的表达高于其他组织。本研究在NR1H4基因的SNP位点检测到3种基因型，其中Tt基因型的IMF含量高于TT和tt基因型，但不同基因型对IMF含量的关联均未达到显著水平。Luo等[41]研究发现，猪SLC13A5基因Bsu36 I酶切位点多态性与IMF含量有显著的关系，本研究对宁乡猪SLC13A5基因的多态性进行研究，共检测到3种基因型，其中bb型个体的IMF含量最高，但3种基因型间的IMF含量差异并不显著(P>0.05)，与王玲玉[42]在大白猪中的研究结果一致。
4 结论对H-FABP、NR1H4、A-FABP和SLC13A5基因在宁乡猪群体中多态性的研究表明，H-FABP-Msp Ⅰ和A-FABP-Bsu36 Ⅰ两位点不存在多态现象；测序结果显示，SLC13A5和NR1H4两个多态性位点的不同基因型间IMF含量差异均不显著，而H-FABP基因Hinf Ⅰ和Hae Ⅲ位点存在多态性，并与宁乡猪IMF含量显著关联，其中这两个位点形成的单倍型组合HD/hd的IMF含量最高。本研究结果可为宁乡猪IMF含量性状的分子标记辅助选育提供参考。
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(编辑 郭云雁)