, BAI Yilan, LI Xin, GUI Yaping, JU Houbin, GONG Guohua, XIA Luming, CHEN Weifeng, ZHU Xiaoying, CHANG Xiaojing, LI Zengqiang, TANG Congsheng, WANG Jian
, ZHAO Hongjin
猫杯状病毒(feline calicivirus，FCV)属于杯状病毒科、水疱疹病毒属，是一种引起猫科动物口腔与上呼吸道疾病的重要病原[1]。FCV呈世界性分布，在猫科动物中具有高度传染性，猫及老虎、猎豹等野生猫科动物均易感[2]。FCV主要临床症状表现为鼻炎、结膜炎、急性口腔溃、肺炎、慢性胃炎和跛行等。近年来，由于FCV高度的变异性产生的强毒株可引起严重、急性、致死性全身性疾病，死亡率高达50%，症状可表现为溃疡性皮炎、急性关节炎、肠炎、流产以及跛行等全身感染，对猫及猫科动物造成严重威胁[3]。
FCV全基因组由3个开放性阅读框(open reading frame，ORF)组成，其中，ORF2基因编码结构蛋白VP1，按功能域ORF2又可划分为A、B、C、D、E和F 6个区[4]。C和E区变异性较大，特别是E区包含鉴别VS-FCV的特征性氨基酸突变位点，变异最为明显，也是早期疫苗免疫失败的重要原因[5]。为了进一步了解FCV在上海地区流行状况及其遗传变异和演化方向，本研究从2021年1月—3月，从上海地区上呼吸道症状猫的病料中分离鉴定得到13株FCV，对其VP1基因进行遗传演化分析，丰富了国内FCV分离株的基础数据，也为该病毒强毒株的筛选和疫苗研究提供参考依据。
1 材料与方法 1.1 样品采集及处理从上海市中心城区宠物医院收集了17份具有上呼吸道症状患猫的眼结膜、口咽和鼻黏膜拭子样品，记录患猫的年龄、猫三联灭活疫苗免疫情况、主要临床症状(表 1)。将采集的拭子加2 mL PBS缓冲液浸泡后，用0.22 μm微孔滤膜过滤，－20 ℃保存备用。
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表 1 临床样品采集的详细信息 Table 1 Details of the clinical samples |
F81细胞(猫肾传代细胞)由上海市动物疫病预防控制中心兽医实验室保存。猫三联灭活疫苗(猫鼻气管炎、嵌杯病毒病、泛白细胞减少症)(批号：D286389A)购自硕腾(上海)企业管理有限公司；DMEM细胞培养液(批号：2126865)、0.25%浓度胰酶消化液(批号：2042303)均购自GIBCO公司；胎牛血清(批号：2418)购自Sigma公司；核酸提取试剂盒(批号：MDII14-01)购自Magen公司；PrimeScriptTM RT-PCR Kit(批号：AJ62323A)、LA PCRTM Kit Ver.2.1(批号：AK5301)、Prime ScriptTM One Step RT-PCR Kit Ver.2(Dye Plus)(批号：AKE0559A)购自宝生物工程(大连)公司；猫疱疹病毒1型荧光PCR检测试剂盒(批号：FHV20210504)、猫细小病毒荧光PCR检测试剂盒(批号：FPV20210604)购自上海尔创生物科技有限公司。
1.3 病料的RT-PCR鉴定吸取50 μL上述处理的样品，猫三联灭活疫苗作阳性对照，阴性拭子作阴性对照，提取总RNA，依据参照文献[6]合成引物：上游引物FCV-JCF：5′-GCCTCAAACATTAGGAGTGC-3′；下游引物FCV-JCR：5′-CCCTGGGGTTAGGCGCAG-3′，扩增片段为420 bp，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。按照文献[6]的方法进行RT-PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳分析，将出现预期目的片段的RT-PCR产物送上海桑尼生物科技有限公司进行测序，测序结果用NCBI中的BLAST工具进行比对分析，确认是否为FCV基因序列。同时将FCV阳性的样本接种F81细胞，进行病毒的分离培养。
1.4 病毒分离F81细胞常规消化传代，待长成单层且贴壁率达到90%时，将细胞按照1∶3的比例消化传代，同时将上述病料同步接种到细胞中，37 ℃，5% CO2浓度培养箱中培养，每6 h观察细胞病变1次，70%细胞出现细胞病变、圆缩和脱落时，将培养液冻融3次，收集细胞上清。
1.5 病毒鉴定1.5.1 FCV VP1基因的扩增 依据参考文献[4]合成FCV VP1基因全长扩增引物，FCV-VP1上游引物：5′-ATGTGCTCAACCTGCGC-3′；FCV-VP1下游引物：5′-TCATAATTTAGTCATTGAGCTCCT-3′。FCV VP1基因序列全长2 007~2 010 bp，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。体系总体积为50 μL：PrimeScriptTM RT-PCR Kit buffer 25 μL，Enzyme Mix 2 μL，上、下游引物(浓度均为10 μmol·L－1)各1 μL，RNA模板1 μL，双蒸水补至50 μL。反应条件：50 ℃反转录30 min；94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。取5 μL RT-PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，阳性RT-PCR产物送上海桑尼生物科技有限公司进行测序。测序结果用NCBI中的BLAST工具进行比对分析，确认是否为FCV的VP1基因序列。
1.5.2 形态学鉴定 将分离病毒株第3代培养物接种F81细胞，待70%细胞出现CPE后反复冻融3次收毒，将收获的细胞液冻融3次后，10 000 r·min－1离心1 h，除去细胞碎片，随后上清液与终浓度为10%的聚乙二醇8000(PEG8000)混合过夜。在4 ℃下12 000 r·min－1离心2 h后，用Tris缓冲盐溶液(TBS)重悬，经2%磷钨酸负染后进行透射电镜观察。
1.5.3 外源病毒检测 对13株分离株进行猫疱疹病毒1型(FHV-1)和猫细小病毒(FPV)两种外源病毒检测。根据猫疱疹病毒1型荧光PCR检测试剂盒和猫细小病毒荧光PCR检测试剂盒要求，对分离病毒株第3代培养物进行FHV-1和FPV荧光PCR检测。
1.6 构建遗传演化树分别参照国内外FCV强毒株、经典株和疫苗株VP1基因序列(表 2)[7]，利用MEGA 6.0和DNAStar v7.1软件构建FCV VP1基因遗传演化分析树，并分析其序列特征。
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表 2 FCV VP1参考序列 Table 2 Reference strains of FCV VP1 gene |
1.7.1 分离株有限稀释纯化 将FCV-SH202101和FCV-SH202113分离病毒株第3代培养物用细胞培养液进行10倍的倍比稀释，共稀释11个稀释度，将稀释液与消化好的细胞悬液按照体积比1∶3加入至6孔板中，第12孔加细胞悬液作阴性对照，每孔体积为2 mL。37 ℃，5% CO2浓度培养箱中培养，每6 h观察细胞病变1次。待70%细胞出现细胞病变、圆缩和脱落时，收获出现细胞病变的最大稀释度孔的上清进行二次有限稀释纯化，共稀释纯化6次，测定纯化后病毒液的TCID50，－80 ℃保存备用。
1.7.2 攻毒试验 将6只健康中华田园猫(3只2~3月龄幼猫，3只2岁左右成年猫，均未免疫过猫三联灭活疫苗)分为A组、B组和对照组，每组均为2只，包括1只幼猫和1只成年猫。A和B组猫均采用滴鼻和口服方式分别接种108.73TCID50·mL－1的FCV-SH202101和1010.26 TCID50·mL－1的FCV-SH202113分离株病毒液，接种剂量为滴鼻和口服各1 mL·只－1；对照组猫接种相同剂量的DMEM细胞培养液。不同感染组隔离饲养，自由采食、饮水，每日监测猫的临床症状和死亡情况，同时采集眼、口、鼻拭子用于排毒情况的检测。
2 结果 2.1 病料的RT-PCR检测17份病料经FCV RT-PCR扩增，其中，编号为BD20210104-2~BD20210104-8、BD20210112-1、BD20210127-1、BD20210804-1、BD20210804-3~BD20210804-5的13份样品扩增产物经凝胶电泳检测显示，在420 bp左右出现与预期目的产物大小一致的目的条带，部分病料样品的扩增结果见图 1。将13份样品的RT-PCR产物进行测序，测序结果在NCBI中进行BLAST比对分析，确认13个序列均为FCV的基因序列，表明13份样品均为FCV阳性。
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M. DL2000 DNA相对分子质量标准；1~4. RT-PCR阳性病料样本；5~8. RT-PCR阴性病料样本；9. 阳性对照；10. 阴性对照 M. DL2000 DNA marker; 1-4. RT-PCR positive samples; 5-8. RT-PCR negative samples; 9. Positive control; 10. Negative control 图 1 部分病料FCV RT-PCR检测结果 Fig. 1 FCV RT-PCR detecting results of part samples |
13份FCV阳性病料接种F81细胞，盲传3代，第3代细胞培养物接种F81细胞24 h，均产生CPE，细胞出现圆缩、拉丝、聚集现象，然后脱落、漂浮在细胞维持液中(图 2)。
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A.接种BD20210104-2第3代细胞培养物的F81细胞；B.阴性对照 A. F81cells inoculated the 3rd generation cell culture of BD20210104-2; B. Negative control 图 2 接种BD20210104-2第3代细胞培养物24 h后F81细胞病变结果 Fig. 2 CPE of the 3rd generation cell culture of BD20210104-2 in F81 cells at 24 h |
将13份病毒上清液提取RNA，进行FCV VP1 RT-PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳检测后得到约2 000 bp大小的条带，与预期2 007 bp大小一致(图 3)。测序结果拼接后，得到13株FCV的VP1全基因序列，将13株病毒VP1基因序列在NCBI中进行BLAST比对分析，确认13株序列均为FCV的VP1基因序列，表明13株分离株为FCV，分别命名为FCV-SH202101~FCV-SH202113。
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M. DL2000 DNA相对分子质量标准；1~13. FCV VP1 RT-PCR阳性产物 M. DL2000 DNA marker; 1-13. FCV VP1 RT-PCR positive products 图 3 FCV VP1 RT-PCR结果 Fig. 3 FCV VP1 RT-PCR detecting results |
FCV-SH202101株F81细胞第4代培养物经电镜负染观察可见无囊膜，呈圆形、椭圆形等形态，直径30~40 nm的病毒粒子(图 4)，与杯状病毒粒子形态特征相符，表明分离株病毒为FCV。
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图 4 FCV-SH202101病毒粒子电镜图 Fig. 4 Electron microscopy image of isolated FCV-SH202101 strain |
对13株FCV分离株进行FHV-1和FPV两种外源病毒荧光PCR检测，结果均为阴性。
2.6 FCV VP1同源性及遗传演化分析2.6.1 分离株与国内外参考株VP1基因同源性及遗传演化分析 将13株FCV分离株与国内外参考株VP1基因进行同源性分析。结果显示，13株上海分离株之间的核苷酸序列相似性为74.3%~99.8%，其中，FCV-SH202103株与FCV-SH202104株相似性最高，为99.8%；FCV-SH202108株与FCV-SH202111株相似性最低，为74.3%。与国内外强毒株相似性为73.8%~82.9%，其中，FCV-SH202113株与FCV-5株相似性最高，为82.9%；与国内外经典株相似性为73.4%~80.1%，氨基酸序列分析显示，FCV-SH202102株与FCV-YH-16株的相似性高达91.9%，FCV-SH202108株与FB-NJ-13株的相似性最低，为82.1%；与疫苗株相似性为73.2%~79.8%，氨基酸相似性FCV-SH202103株与F4株高达89.4%，FCV-SH202102株与F4株最低，为82.7%。
遗传演化树分析显示，13株分离株分布于3个分支，FCV-SH202108株与上海分离株SH/2014遗传关系较近，FCV-SH202103、FCV-SH202104和FCV-SH202112遗传关系较近，与国外参考株和疫苗株处于同一分支；FCV-SH202113株与强毒株FCV-5遗传关系较近，处于同一分支；其余毒株与国内参考株处于同一分支，且FCV-SH202101、FCV-SH202102、FCV-SH202106、FCV-SH202107、FCV-SH202109和FCV-SH202110遗传关系较近(图 5)。
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▲表示分离毒株 ▲stands for isolated strain 图 5 分离株与参考株VP1基因序列遗传演化树 Fig. 5 Maximum-likelihood tree based on VP1 gene of isolated strains and reference strains |
2.6.2 VS-FCV特征性氨基酸分析 以部分E区(426—461 aa) 分析的具有VS-FCV突变特征氨基酸位点为依据，确定430、438、443、448、452、455和458为VS-FCV特征性氨基酸位点(图 6)。结果表明5株分离株与VS-FCV有6个位点吻合，7株分离株有5个位点吻合，1株分离株有4个位点吻合(表 3)。
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图 6 VP1蛋白部分E区的氨基酸比较图 Fig. 6 Comparison of amino acid sequences of partical E region in VP1 protein |
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表 3 FCV VP1蛋白部分E区强毒株特征性氨基酸位点分析 Table 3 VS-FCV characteristic amino acid sites analysis of partical E region in VP1 protein |
2.7.1 病毒液TCID50的测定 测定FCV-SH202101株和FCV-SH202113株细胞半数感染量分别为108.73和1010.26 TCID50·mL－1。
2.7.2 感染猫的临床症状 FCV202101株和FCV2021131株感染中华田园猫后，48 h内幼猫陆续出现杯状病毒上呼吸道症状，如眼屎增多、气喘、咳嗽等，体温最高升至39.5 ℃，5 d后幼猫均濒临死亡。A组成年猫1周后出现眼屎增多现象，11 d后猫濒临死亡；B组成年猫1周后无明显的临床症状，2周后出现临床症状，精神沉郁、不食、发烧、眼屎大量增多，18 d后死亡。
2.7.3 感染猫的排毒情况 每日采集不同感染组猫的眼、鼻、口拭子，利用RT-PCR方法检测其排毒情况(表 4)，结果表明，FCV202101株和FCV2021131株感染猫3 d后，可持续从眼、鼻、口拭子中检测到FCV。
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表 4 猫感染FCV后排毒情况 Table 4 Virus shedding of cats after FCV infection |
2.7.4 感染猫的发病与死亡情况 FCV202015株和FCV202031株感染猫后，均可导致试验猫的发病和死亡(图 7)，对幼猫具有较强的致死性，且病程短、发病急，对成年猫也具有致死性，但病程长短不一。
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图 7 试验组猫感染FCV后存活率 Fig. 7 Survival rate of cats after FCV infection |
近年来，随着国民生活水平的逐步提高，上海市猫宠呈逐年上升趋势，已逐渐成为宠物市场的主流。在猫的传染病病例中，猫杯状病毒感染病例占1/3以上[8]。本研究对17例呼吸道症状的猫病例进行猫杯状病毒的分离，经过细胞病变、VP1测序、病毒电镜观察，13株分离株都鉴定为FCV，阳性率达到76.47%，与周孟云等[4]在杭州宠物猫中调查的结果基本一致，表明上海市具有呼吸道症状的宠物猫杯状病毒感染比较普遍。
由于FCV的RNA聚合酶缺乏校正功能，导致其基因组频繁变异，当出现VS-FCV时，就可能导致疫苗失去保护力[9]。美国的Pedersen等[10]首次报道在1998年采集的样品中发现了VS-FCV，2003年英国及2009年法国也暴发过疫苗免疫的成年猫感染VS-FCV，2013年Velasco等[11]报道了西班牙暴发VS-FCV，2018年郭慧敏等[12]首次报道了VS-FCV在我国流行。上海地区13株FCV分离株之间的VP1核苷酸序列相似性为74.3%~99.8%，与国内外参考株的核苷酸序列相似性为73.2%~80.1%，氨基酸相似性82.7%~91.9%，其中与疫苗株的核苷酸相似性只有73.2%~79.8%，氨基酸的相似性为82.7%~89.4%，分离株VP1核苷酸序列和氨基酸序列相似性均不高，符合FCV易突变的特征。遗传演化树显示，2株分离株与强毒株处于同一分支，8株分离株与国内经典株处于同一分支，3株分离株与国外经典株亲缘关系较近，研究表明，上海市主要流行株可能来自国内北方地区，少数毒株来自国外，与刘春国等[13]研究结果一致，表明上海市FCV起源于不同祖先，其遗传存在生物多样性。虽然Smith等[14]认为FCV-F9疫苗株仍然能够预防FCV的感染，但是遗传演化树显示，本市分离株与疫苗株遗传关系较远，可能是当前疫苗对猫的免疫效果不佳的主要原因。
分离株与国内强毒株SH2014(Shanghai)株相似性为74.7%~77.4%，与国外强毒株相似性为73.8%~82.9%。分离株与强毒株同源性虽然不一致，但是仅从核苷酸和氨基酸序列同源性上并不能将经典FCV与VS-FCV株区分出来[5]。遗传演化树显示，FCV-SH202108株和FCV-SH202113株与强毒株遗传关系较近，其中，FCV-SH202113株与FCV-5处于同一分支，FCV-SH202108株虽然与经典株LS015处于同一分支，但同时与强毒株FCV-George Walder、FCV-Jengo、FCV-Kaos、UTCVM-H1、SH2014(Shanghai)、UTCVM-H2遗传关系较近，表明FCV-SH202108和FCV-SH202113株具有强毒株的可能。FCV VP1衣壳蛋白可分为A、B、C、D、E和F等6个区，其中E为超变区，有研究发现VS-FCV具有特征性氨基酸位点，Foley等[15]对E区具有VS-FCV突变特征的氨基酸位点进行比较分析发现，430位、438位、443位、448位、452位、455位和458位aa可能与其致病性相关。对E区中7个可能的强毒株特征性氨基酸位点分析，发现FCV-SH202101、FCV-SH202102、FCV-SH202107、FCV-SH202109和FCV-SH202110株有6个氨基酸位点与已公开VS-FCV株吻合，而已报道的广西株只有一个吻合位点[16]。因此FCV-SH202101、FCV-SH202102、FCV-SH202107、FCV-SH202109和FCV-SH202110株也具有强毒株的可能。
从采样宿主临床症状、VP1进化树和VS-FCV特征性氨基酸位点进行分析，选择FCV-SH202101株和FCV-SH202113株进行动物感染试验，研究表明，FCV-SH202101株和FCV-SH202113株感染中华田园猫后均可导致发病和死亡，病毒的潜伏期为1~2 d，接种后第3天即可检测出排毒，不同年龄段猫的病程不一致，幼猫5 d后可导致死亡，成年猫病程可持续11~18 d，说明FCV-SH202101株和FCV-SH202113株可能为VS-FCV中国分离株，但VS-FCV的确诊还需要进一步研究病毒复制病例各脏器FCV的分布和滴度、病理变化以及可否造成感染猫的群体性发病与死亡等。
4 结论本研究从临床呼吸道症状猫分离到13株能在F81上形成CPE的病毒，经测序和电镜观察鉴定为FCV，VP1序列分析表明上海地区FCV流行株主要来自国内北方地区，少数毒株来自国外地区，动物感染试验表明2株FCV具有VS-FCV致病性特征，为VS-FCV毒株的筛选提供了有力的证据，也为FCV疫苗的研究提供了技术支持。
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(编辑 白永平)