, SHI Yinyin, WEN Zuochen, LUO Yunyan, ZHU Xueli, ZHENG Chunting, LI Shuying, HONG Liang, ZHANG Jianbin, GUO Liang, PU Lei
全羧化酶合成酶(holocarboxylase synthetase, Hlcs)是动物体内多种羧化酶的合成酶，通过催化生物素与体内无活性的羧化酶共价连接，使其形成有活性的羧化酶[1]。Hlcs调控的羧化酶主要有乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase, ACC)、丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase, PC)、丙酰辅酶A羧化酶(propionyl-CoA carboxylase, PCC)和甲基巴豆酰辅酶A羧化酶(3-methylcrotonyl-coenzyme A carboxylase, MCC)4种[2]。通过Hlcs合成产物酶之一ACC可以催化乙酰辅酶A转化为丙二酸单酰辅酶A，阻止乙酰辅酶A进入三羧酸循环[3]。细胞糖酵解的产物丙酮酸穿梭进入线粒体，可利用Hlcs合成产物酶之一PC转化为草酰乙酸进入三羧酸循环产能[4]，并且PC在糖异生过程中也至关重要[5]。因此Hlcs的产物酶与细胞糖酵解关系密切。Hlcs缺失会导致生物素与羧化酶结合产生障碍[6-7]，从而造成代谢产物在机体内蓄积[8]，使糖代谢出现障碍[9]。
综上表明，Hlcs与细胞糖酵解有关，但Hlcs对细胞糖酵解的影响鲜有报道。因此，本研究利用siRNA片段干扰Hlcs基因，通过检测在C2C12细胞成肌成脂分化过程中糖酵解相关基因的表达情况，探明Hlcs基因对C2C12细胞成肌成脂分化后糖酵解的影响。
1 材料与方法 1.1 主要试剂和材料C2C12细胞由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所猪遗传育种创新团队提供；DMEM培养液、胎牛血清、马血清、胰岛素购于Gibco公司；生物素(维生素B7)、转膜液、电泳液和发光液购于索莱宝公司；Bodipy493/503染料购于Invitrogen公司；地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、油红O染料购于Sigma公司；Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、反转录试剂盒和荧光定量染料均购于TaKaRa公司；Hlcs、Pkm和Gapdh一抗、FITC标记山羊抗兔IgG(H+L)购于碧云天生物技术有限公司；RIPA裂解液购于上海雅酶生物医药科技有限公司；siRNA片段合成于吉玛基因公司。
1.2 试验技术及方法1.2.1 C2C12细胞的培养与siRNA转染 将C2C12细胞用含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的DMEM高糖培养基，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。待细胞达到70%汇合时，用胰蛋白酶消化细胞3~5 min，加入等量培养基终止消化，以1∶3比例接种细胞。
将对数期生长的细胞以每孔2.4×105个细胞的密度铺入6孔板中，待24 h细胞贴壁后，更换为OPTI培养基后继续培养1~2 h，利用Lipofectamine 3000转染试剂转染siRNA。siRNA处理8~12 h后，更换为生长培养基。
1.2.2 C2C12细胞诱导分化及生物素处理 成肌分化：C2C12细胞接触抑制后1 d，开始诱导分化。用含有2%孕马血清和100 U·mL-1青链霉素的DMEM诱导液诱导成肌分化，2 d后更换为生长培养基[10]。
成脂分化：C2C12细胞接触抑制后1 d，开始诱导分化。用孕马血清成肌诱导液诱导成肌分化2 d后，再用含有0.5 mg·L-1地塞米松、0.5 mmol·L-1 IBMX、10 μg·mL-1胰岛素的DMEM诱导液诱导成脂分化，最终分化为C2C12脂肪细胞。
生物素处理：前期研究发现1 μmol·L-1添加量为最适添加量[11]。在诱导分化过程中，加入1 μmol·L-1浓度生物素处理细胞，共设4个处理组：1)对照组(NC)；2)生物素组(biotin)；3)Hlcs干扰组(siHlcs)；4)生物素与Hlcs干扰共同处理组(siHlcs+Biotin)。
1.2.3 油红O染色和Bodipy染色 成脂分化C2C12细胞用PBS清洗2~3次，用4%多聚甲醛固定细胞15 min后，再用PBS清洗3次。
油红O染色：油红O染液37 ℃孵育30 min。再用PBS清洗3次。利用倒置显微镜观察染色情况。
Bodipy染色：Bodipy染料避光孵育30 min，再用PBS清洗3次。加入DAPI染料，染核5 min，PBS洗3次。利用倒置荧光显微镜观察拍照。
1.2.4 免疫荧光染色 C2C12细胞诱导成肌分化4 d后，弃去培养基，用PBS清洗3次。用4%多聚甲醛固定细胞30 min，PBS清洗3次。通透液通透细胞15 min，PBS清洗1次。封闭液封闭1 h，PBS清洗1次。用封闭液按100∶1的比例稀释一抗Myog，4 ℃孵育过夜或37 ℃孵育2 h。FITC荧光二抗，37 ℃避光孵育1.5 h。DAPI核染5 min，用PBS清洗3次，去除非特异染色，加入抗荧光淬灭剂。荧光显微镜下观察染色后的肌管形态，并拍照。
1.2.5 实时定量荧光PCR(RT-qPCR) 通过Primer软件设计引物，引物序列见表 1。以cDNA为模板，进行RT-qPCR反应，PCR反应体系18 μL：2×qPCR Mix 9 μL，模板3 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 4 μL。PCR程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环。以Gapdh为内参基因，且基因的相对表达量用2-ΔΔCT方法计算。
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表 1 实时荧光定量 PCR 引物序列 Table 1 Primer sequences for real-time quantitative PCR |
1.2.6 蛋白质免疫印迹(Western blotting) 将C2C12细胞诱导分化，提取分化6 d的细胞总蛋白。将变性处理后的蛋白在PAGE凝胶上进行点样，80 V 30 min后转110 V 1.5 h，再将凝胶进行转膜2 h。在室温下用5%脱脂奶封闭硝酸纤维膜30 min，加入Myog一抗4 ℃孵育过夜，次日TBST清洗3次，每次10 min，再加入FITC二抗孵育2 h，最后用TBST清洗3次，每次10 min。用辣根过氧化物酶对硝酸纤维膜进行曝光，获得蛋白条带，并利用ImageJ软件进行灰度分析。
1.3 数据分析利用SPSS统计数据并进行方差分析(one-way ANOVA)。试验数据以“平均值±标准差”的形式表示。P＜0.05表示差异显著。
2 结果 2.1 Hlcs基因及糖酵解相关基因在C2C12细胞成肌分化各个阶段的时序表达用2%马血清诱导C2C12细胞成肌分化。C2C12细胞成肌分化重要阶段的形态学观察如图 1所示，图 1A中C2C12细胞为接触抑制时的细胞形态，即细胞退出增殖期进入分化期；图 1B为成肌诱导第1天的C2C12细胞，从图中可以看出此时细胞纵向排列，少量细胞开始融合；图 1C中的C2C12细胞为成肌诱导第8天的细胞形态，肌管清晰可见且肌管数量增多。
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A. 接触抑制；B. 诱导成肌第1天；C. 诱导成肌第8天 A. Contact inhibition; B. Myogenic day 1; C. Myogenic day 8 图 1 C2C12成肌分化细胞形态 Fig. 1 C2C12 myoblast differentiation cell morphology |
通过实时定量荧光PCR检测细胞成肌分化第0、2、4、6、8天Hlcs基因及酵解相关基因的mRNA表达变化。结果如图 2所示，Hlcs、Pkm、Pfkm、Hk-2基因的mRNA表达量先升高、后降低，在分化第4天表达量达到巅峰。Hlcs、Pkm、Pfkm、Hk-2四者表达量趋势一致，推测Hlcs基因与细胞糖酵解具有相关性。
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图 2 C2C12细胞成肌分化各阶段Hlcs及糖酵解基因表达谱 Fig. 2 Expression profiles of Hlcs and glycolytic genes in various stages of myoblastic differentiation of C2C12 |
用“鸡尾酒”诱导C2C12细胞成脂分化。C2C12细胞成脂分化重要阶段的形态学观察如图 3所示，图 3A为C2C12细胞成脂诱导第1天时的细胞形态，可以看出此时细胞已经汇合；图 3B为成脂诱导第3天的C2C12细胞，此时细胞有小的脂滴形成；图 3C为成脂诱导第8天时C2C12细胞的油红O染色图，可见小脂滴不断聚集形成脂泡。
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A. 诱导成脂分化第1天；B. 诱导成脂分化第3天；C. 诱导成脂分化第8天油红O染色 A. Induced adipogenic differentiation on day 1; B. Induced adipogenic differentiation on day 3; C. The Oil red O staining of C2C12 on day 8 of induced adipogenic differentiation 图 3 C2C12细胞成脂分化与油红O染色 Fig. 3 Adipogenic differentiation of C2C12 cells and Oil red O staining |
通过实时定量荧光PCR检测成脂分化第0、2、4、6、8天Hlcs基因及糖酵解相关基因的mRNA表达变化。结果如图 4所示，Hlcs、Pkm、Pfkm、Hk-2的mRNA表达量均呈增加趋势，第2~4天表达量增加较第0~2天快，并在第8天表达量达到巅峰，且Hlcs、Pkm、Pfkm、Hk-2四者mRNA表达量趋势一致。
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图 4 C2C12细胞成脂分化各阶段Hlcs及糖酵解基因表达谱 Fig. 4 Expression profiles of Hlcs and glycolytic genes in various stages of lipogenic differentiation of C2C12 cell |
用siRNA干扰片段降低Hlcs基因的表达，用2%马血清诱导成肌分化，在荧光倒置显微镜下观察C2C12细胞成肌分化情况，结果如图 5所示，与NC组相比，生物素和siHlcs处理C2C12细胞后，其肌管数量明显变少，且肌管融合指数显著低于NC组(P＜0.05)。
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A. Myog 免疫荧光染色；B.融合指数(融合指数为多核肌管核数(大于等于两个细胞核)与总细胞核数的比例) A. Myog immunofluorescence staining; B. Fusion index (The fusion index is the ratio of the number of multinucleated myotubular nuclei (greater than or equal to two nuclei) to the total number of nuclei) 图 5 C2C12细胞成肌分化免疫荧光染色 Fig. 5 Myogenic differentiation of C2C12 cells by immunofluorescence staining |
RT-qPCR检测mRNA结果如图 6所示。由图 6A可知，与NC组相比，添加生物素组、siHlcs组、siHlcs和生物素共同处理组均显著降低了Hlcs的mRNA表达量(P＜0.05)；图 6B显示，与NC组相比，添加生物素组、siHlcs组、siHlcs和生物素共同处理组均显著升高了Pkm的mRNA表达量(P＜0.05)；由图 6C可知，与NC组相比，添加生物素组显著升高了Hk-2的表达量(P＜0.05)，而siHlcs组、siHlcs和生物素共同处理组均显著降低了Hk-2的mRNA表达量(P＜0.05)；由图 6D可知，与NC组相比，添加生物素组、siHlcs组、siHlcs和生物素共同处理组均显著降低了Pfkm的mRNA表达量(P＜0.05)。此外，Western blotting结果显示(图 6E-G)，与NC组相比，添加生物素组、siHlcs组、siHlcs和生物素共同处理组均显著降低了Hlcs的蛋白丰度(P＜0.05)；与NC组相比，添加生物素组、siHlcs组、siHlcs和生物素共同处理组均显著升高了Pkm的蛋白丰度(P＜0.05)。
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A. Hlcs mRNA 相对表达量；B. Pkm mRNA 相对表达量；C. Hk-2 mRNA 相对表达量；D. Pfkm mRNA 相对表达量；E. Hlcs、Pkm 蛋白的免疫印迹；F. Hlcs 蛋白的免疫印迹定量分析；G. Pkm 蛋白的免疫印迹定量分析。不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)，下同 A. Relative mRNA expression of Hlcs; B. Relative mRNA expression of Pkm; C. Relative mRNA expression of Hk-2; D. Relative mRNA expression of Pfkm; E. Protein immunoblotting of Hlcs and Pkm; F. Quantitative analysis of Western blotting of Hlcs; G. Quantitative analysis of Western blotting of Pkm. Different lowercase letters mean significant difference (P < 0.05), the same as below 图 6 Hlcs基因干扰对C2C12成肌分化过程中酵解基因表达的影响 Fig. 6 Effects of Hlcs gene interference on the expression of glycolysis genes during myoblast differentiation of C2C12 |
用siRNA干扰Hlcs的表达，用Bodipy染色检测siHlcs对C2C12细胞成脂分化的影响，结果如图 7所示，与NC组相比，添加生物素组脂滴形成减少，siHlcs组脂滴形成减少，而siHlcs与生物素共同处理则可缓解siHlcs的抑制作用。
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A. 脂滴 Bodipy 染色；B. Bodipy 荧光强度量化图 A.Lipid droplet Bodipy staining; B. Bodipy fluorescence intensity quantification diagram 图 7 C2C12 细胞成脂分化 Bodipy 染色 Fig. 7 Adipogenic differentiation of C2C12 cells by Bodipy staining |
RT-qPCR检测mRNA表达量结果如图 8所示。由图 8A可知，与NC组相比，添加生物素组、siHlcs组、siHlcs与生物素共同处理组均显著降低了Hlcs的mRNA表达量。图 8B显示，与NC组相比，添加生物素组、siHlcs组、siHlcs与生物素共同处理组均显著升高了Pkm的mRNA表达量。图 8C中，与NC组相比，添加生物素组、siHlcs组显著降低了Hk-2的mRNA表达量，而siHlcs与生物素共同处理组无显著差异(P＞0.05)。Western blotting结果显示，与NC组相比，添加生物素组、siHlcs组和siHlcs与生物素共同处理组均显著降低了Hlcs的蛋白表达量(图 8F)，而添加生物素组和siHlcs组均能上调Pkm的蛋白表达量，siHlcs与生物素共同处理组与NC组相比无显著差异(图 8G)。
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A. Hlcs mRNA 相对表达量；B. Pkm mRNA 相对表达量；C. Hk-2 mRNA 相对表达量；D. Pfkm mRNA 相对表达量；E. Hlcs、Pkm 蛋白的免疫印迹；F. Hlcs 蛋白的免疫印迹定量分析；G. Pkm 蛋白的免疫印迹定量分析 A. Relative mRNA expression of Hlcs; B. Relative mRNA expression of Pkm; C. Relative mRNA expression of Hk-2; D. Relative mRNA expression of Pfkm; E. Protein immunoblotting of Hlcs and Pkm; F. Quantitative analysis of Western blotting of Hlcs; G. Quantitative analysis of Western blotting of Pkm 图 8 Hlcs基因干扰对C2C12成脂分化过程中酵解基因表达的影响 Fig. 8 Effects of Hlcs gene interference on the expression of glycolysis genes during adipogenic differentiation of C2C12 |
细胞中葡萄糖的利用分为两部分，一部分是糖酵解，另一部分是通过糖酵解终产物进入三羧酸循环产能。细胞糖酵解是利用己糖激酶(hexokinase 2，Hk-2)、磷酸果糖激酶(phosphofructokinase，Pfkm)和丙酮酸激酶(pyruvate kinase，Pkm)等将葡萄糖转变为丙酮酸的过程[12]。本研究发现，C2C12细胞成肌分化过程中Hlcs、Pkm、Pfkm和Hk-2基因呈先升高，第4天时表达量最高，之后降低的表达趋势。这可能是因为细胞在成肌分化中期，细胞融合形成肌管，需要大量能量[13-14]。本研究发现，Pfkm在C2C12成肌分化后期表达量下降，与孙慧[15]研究Pfkm在衰老间充质干细胞中表达量下降的结果一致。本研究发现，随着C2C12细胞成脂分化的进行，Hlcs基因的表达量逐渐升高，且在C2C12细胞成脂分化的后期Pkm、Pfkm和Hk-2基因表达量升高，可能与肌内脂肪细胞主要通过周围肌肉细胞提供的葡萄糖为来源合成脂肪[16]，随着分化的进行，细胞需要产生更多的脂肪，糖酵解速率加快，产生更多的中间产物(如乙酰辅酶A)转化为脂肪[17-18]。所以C2C12细胞随着成脂分化的进行糖酵解基因表达量逐渐增加。
基于前期研究发现，Hlcs基因与C2C12细胞不同分化状态下糖酵解相关基因的表达趋势相同，且Hlcs基因的下游羧化酶与糖酵解功能密切相关，故进行后续干扰Hlcs相关研究。细胞糖酵解过程只产生少量的ATP，但糖酵解中间产物可作为原料合成氨基酸[19-20]。C2C12细胞成肌分化过程中对照组细胞糖酵解基因表达高，酵解活动旺盛，中间产物转化为氨基酸。干扰Hlcs基因后，与对照组相比，Pfkm和Hk-2表达量显著降低。Hlcs作为全羧化酶合成酶，其表达量降低，PC的合成受阻，从而限制丙酮酸在线粒体内转化为草酰乙酸，导致草酰乙酸减少，三羧酸循环无法顺利进行[21]。草酰乙酸和三羧酸循环的中间产物合成障碍，无法顺利合成相应氨基酸，导致相关产物在细胞内蓄积，抑制Pfkm和Hk-2表达[22-23]。且有研究证明，Pfkm基因敲除的猪肾上皮细胞的糖酵解效率降低，造成糖酵解中间产物的积累，影响到线粒体活性，抑制细胞ATP的产生[24]。细胞成肌分化过程中，肌肉糖代谢中间产物如丙酮酸和草酰乙酸等合成非必须氨基酸[12, 25-26]。C2C12细胞成肌分化过程中干扰Hlcs基因后Pkm基因的表达增加，可能是因为Hlcs缺失，导致PC缺失，丙酮酸无法转化成草酰乙酸，无法生成相应氨基酸，导致Pkm的表达代偿性增加[12]。也有可能Hlcs缺失减少了PC合成，导致草酰乙酸增补减少，进而使磷酸烯醇式丙酮酸合成减少。加之糖酵解上游的Pfkm和Hk-2表达降低，同时导致磷酸烯醇式丙酮酸的合成降低，是否代偿性导致Pkm表达增加尚不明确。生物素是多种羧化酶的辅助因子，可催化葡萄糖生成和氨基酸分解的关键反应[27-28]。缺乏生物素会导致葡萄糖的利用率降低，从而阻碍糖酵解反应的发生[29-31]。本研究发现，在成肌分化C2C12细胞中，添加生物素会上调Pkm、Hk-2的表达，可能是由于添加生物素后，促进细胞内AMPK活性[11, 32]，从而促进葡萄糖吸收而抑制糖异生，加速糖酵解进程[33-36]。
与成肌细胞不同，成脂细胞内的大量能量向合成脂肪酸的途径流转。本研究发现，在C2C12细胞成脂分化中，干扰Hlcs基因后Pkm表达量同样增高。除了磷酸烯醇式丙酮酸减少导致Pkm代偿性增加的原因外，还有可能是因为Hlcs表达量降低后，ACC缺失，乙酰辅酶A在ACC的催化下转化为丙二酰单酰辅酶A受阻，无法起始脂肪酸合成途径，导致脂肪酸含量降低，从而促进Pkm的活性[12, 37-38]。有报道称，高浓度长链脂肪酸会抑制Pkm的活性[12]。加之高强度的成脂诱导分化，细胞内需要大量的乙酰辅酶A合成脂肪，但是又由于缺乏ACC无法顺利合成，所以代偿性的增加Pkm，促进丙酮酸的生成，进而促进乙酰辅酶A的产生。脂肪酸合成途径中，三羧酸转运体系使用柠檬酸作为乙酰基的载体，将线粒体产生的乙酰辅酶A转移到细胞溶胶中参与脂肪酸合成[12, 39]。本研究发现，在成脂分化的C2C12细胞中，干扰Hlcs基因后Pfkm表达量升高。可能是因为干扰Hlcs使ACC和PC合成受阻[37]，导致三羧酸转运体系中草酰乙酸的合成减少，丙酮酸产生更多的乙酰辅酶A，乙酰辅酶A无法合成脂肪，也由于缺乏草酰乙酸，乙酰辅酶A无法和草酰乙酸顺利合成柠檬酸。所以与对照组相比，低浓度柠檬酸促进Pfkm的表达[12, 40]。与对照组相比，在成脂过程中，Hlcs干扰组ACC和PC缺乏，导致三羧酸循环受限，脂肪生成受阻，导致ADP在体内蓄积，ADP为Pfkm的促进剂，促进6-磷酸果糖利用Pfkm合成1, 6-二磷酸果糖。上述过程均与脂肪生成有关，而Hk-2基因是细胞糖酵解的初始阶段，单独受6磷酸葡萄糖含量的调控。成脂过程中，Hlcs基因缺乏导致Hk-2基因表达下调的原因尚待进一步研究。
4 结论在C2C12细胞成肌和成脂分化过程中，糖酵解相关基因Hk-2、Pkm、Pfkm mRNA的表达与Hlcs基因表达趋势一致；干扰Hlcs基因可以抑制成肌分化C2C12细胞Pfkm和Hk-2基因的表达，促进Pkm的表达；而促进成脂分化C2C12细胞Pfkm和Pkm的表达，抑制Hk-2基因的表达；添加生物素能够促进C2C12细胞成肌成脂分化后酵解相关基因的表达。证明Hlcs基因和生物素在C2C12细胞酵解过程中有重要调控作用。
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(编辑 郭云雁)