2. 中国农业科学院兰州兽医研究所，家畜疫病病原生物学国家重点实验室，兰州 730046;
3. 温州医科大学检验医学院、生命科学学院，检验医学教育部重点实验室、温州市环境卫生微生物检验重点实验室，温州 325035;
4. 云南农业大学动物医学院，云南省高校兽医公共卫生重点实验室，昆明 650201
2. State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology, Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730046, China;
3. Wenzhou Key Laboratory of Sanitary Microbiology, Key Laboratory of Laboratory Medicine, Ministry of Education, School of Laboratory Medicine and Life Sciences, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035, China;
4. Key Laboratory of Veterinary Public Health of Higher Education of Yunnan Province, College of Veterinary Medicine, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China
刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)简称弓形虫，它可感染几乎所有的温血动物，引起危害严重的人兽共患弓形虫病[1]。全世界约1/3的人慢性感染弓形虫，感染途径主要是摄入被弓形虫卵囊污染的食品或含有弓形虫包囊的肉类[2]。不同个体感染弓形虫的症状不同，免疫功能正常的人群感染弓形虫表现为无症状；但免疫缺陷患者(例如器官移植患者、癌症患者和HIV感染患者等)感染弓形虫可导致弓形虫脑炎、脉络膜视网膜炎、甚至死亡；孕妇感染弓形虫可能导致流产、畸胎、甚至死胎[1-3]。弓形虫除引起人类疾病外，还可能导致家畜流产和死胎，尤其是猪、绵羊和山羊。因此，弓形虫是一种威胁畜牧业发展和人类健康的重要人兽共患寄生虫。
治疗弓形虫病最有效的方案是组合使用乙胺嘧啶-磺胺嘧啶[4]。但这种治疗方案仍有多种劣势，包括仅对弓形虫快速分裂的速殖子有效，但对包囊中相对缓慢分裂的缓殖子没有显著的治疗效果；不能治愈持续感染；治疗后的宿主可能出现多种副作用[4]。针对弓形虫病的疫苗有助于预防弓形虫病，也可减少宿主对化学疗法的依赖和化学疗法造成的副作用。但目前只有一种商业可用的弓形虫疫苗(ToxovaxⓇ)被许可用于防止绵羊流产，且这种减毒活疫苗并不适用于预防人弓形虫病[5-6]。
致密颗粒蛋白(dense granule proteins，GRAs)是由弓形虫的致密颗粒分泌的一类蛋白质，具有重要的生物学功能。有些致密颗粒蛋白通过调控宿主细胞的基因表达、信号通路进而调控宿主的免疫反应，是弓形虫重要的毒力因子，也是潜在的疫苗候选分子；有些致密颗粒蛋白参与弓形虫营养物质的摄取、蛋白质的转运与定位等重要的生理过程，以期成为治疗弓形虫病的潜在药物靶点。因此，作者对弓形虫致密颗粒蛋白生物学功能的最新研究进展进行综述，旨在为弓形虫的致病机制、药物靶点、疫苗等相关研究提供新思路。
1 致密颗粒蛋白的概述致密颗粒(dense granule，DG)是弓形虫的一个亚细胞分泌器官，于20世纪60年代被发现，其在电子显微镜下的形态类似于聚集的球状颗粒，大小约为200 nm；致密颗粒分泌的蛋白被统一命名为致密颗粒蛋白[7-8]。致密颗粒蛋白中的氨基酸主要为脯氨酸，但不同的致密颗粒蛋白的氨基酸组成、含量、结构域均不同，因此其发挥的生理学功能也有很大差异。在不同的生长周期，弓形虫分泌的致密颗粒蛋白种类和数量不同。速殖子在入侵宿主细胞后会分泌致密颗粒蛋白[7-8]，这些致密颗粒蛋白往往溶于纳虫空泡(parasitophorous vacuole，PV)管腔、结合于纳虫泡膜(PV membrane，PVM)、定位于PV内膜结构的微管网状结构(intravacuolar network，IVN)或被分泌到宿主细胞细胞质或转运至宿主细胞核中，参与调控宿主细胞免疫、调节宿主细胞周期、蛋白转运、营养吸收等多种重要的生理过程。
2 致密颗粒蛋白的生物学功能目前，已报道近70种致密颗粒蛋白，主要包括典型的GRA类致密颗粒蛋白(GRAs)、STAT转录抑制剂(inhibitor of STAT transcription，TgIST)、线粒体结合因子(mitochondrial association factor，MAF)、c-Myc调节因子(c-Myc regulation，MYR)等，其分泌后的定位主要包括PVM、IVN、PV、宿主细胞核、宿主细胞质等。
2.1 调节宿主细胞的免疫反应弓形虫速殖子入侵宿主细胞后，致密颗粒蛋白可改变宿主细胞的免疫状态和细胞内环境，以实现免疫逃避和长期寄生。这类致密颗粒蛋白包括主要定位于PVM及PV的GRA6、GRA7、GRA15、GRA60、MAF1，主要定位于PV的GRA25，以及分泌后转运至宿主细胞核的GRA24、TgIST、TEEGR/HCE和宿主细胞质的GRA18、MAG1(matrix antigen 1)，其调节宿主免疫反应的途径包括操控宿主的免疫信号通路和(或)宿主免疫相关基因的表达、抵抗免疫相关GTP酶(immunity related GTPases, IRG)介导的防御体系(表 1)。
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表 1 参与调节宿主细胞免疫反应的致密颗粒蛋白 Table 1 Dense granule proteins involved in regulating immune response of host cells |
2.1.1 操控宿主的免疫信号通路和(或)免疫相关的基因表达 弓形虫入侵宿主细胞后，会在宿主细胞质内形成一个由PVM包裹的PV，并在PV中繁殖。定位于PVM的GRA6、GRA15、MAF1可调控宿主免疫相关的信号通路和基因表达，进而控调细胞因子的表达。GRA6通过钙调节配体(calcium modulating ligand，CAMLG)激活T细胞核因子4(nuclear factor of activated T cells 4，NFAT4)，进而操控宿主细胞产生免疫应答，例如刺激趋化因子CXCL2(C-X-C motif chemokine ligand-2)和CCL2(C-C motif chemokine ligand-2)的产生[9]，将炎性单核细胞和中性粒细胞吸引到感染部位，进而抑制弓形虫的扩散[10]。GRA15是一种虫株特异性效应物，在Ⅱ型弓形虫Pru虫株中介导NF-κB(nuclear factor kappa B)的核易位和调控NF-κB介导的宿主细胞转录，促进白细胞介素12(interleukin-12，IL-12)的表达[11]；GRA15还可通过核苷酸结合寡聚结构域(nucleotide binding oligomeric domain，NOD)样模式识别受体3(NOD-like receptor 3，NLRP3)刺激炎症小体的形成，并诱导IL-1β的分泌[12]。另外，定位于PVM的弓形虫线粒体结合因子1(MAF1)在弓形虫感染期间调节先天免疫反应中起着关键作用。研究表明，MAF1可参与弓形虫对宿主线粒体的招募(host mitochondrial association，HMA)，改变宿主细胞免疫基因的转录和感染小鼠体内细胞因子的表达，例如增强IL-6、IL-10和CCL5的表达，进而调控弓形虫的生长[13-14]。
GRA24、TgIST、TEEGR/HCE(Toxoplasma E2F4-associated EIH2-inducing gene regulator)分泌后最终易位到细胞核，影响宿主的基因表达和(或)信号转导。GRA24被分泌后易位至宿主细胞质，与p38α丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)结合并激活转运至宿主细胞核，通过激活促炎性细胞因子，尤其是CCL2、单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1, MCP-1)和IL-12的产生，引发强烈的炎症反应，从而增强感染部位的吞噬细胞的吞噬活性，限制弓形虫的生长繁殖[15]。STAT转录抑制剂(TgIST)分泌后跨过PVM并聚集在宿主细胞核发挥功能，例如将Mi-2/NuRD(Mi-2/nucleosome remodeling and deacetylase)复合物募集到STAT1依赖性启动子上，从而导致宿主细胞核内的染色质改变和转录受阻[16]；通过阻断STAT1信号传导，抑制宿主细胞对Ⅱ型干扰素IFN-γ的免疫反应，对控制感染至关重要[16-18]；通过抑制宿主细胞中STAT1/STAT2介导的转录来阻断Ⅰ型干扰素IFN-β反应[17]；在感染早期，通过阻断免疫血清球蛋白(immune serum globulin, ISG)介导的有效寄生虫杀灭作用，保护原始细胞内第一波入侵的速殖子[16]。弓形虫E2F4相关的EZH2诱导基因调控因子(TEEGR/HCE)分泌后被最终转运至细胞核，可结合宿主转录因子E2F3和E2F4并诱导基因表达，同时通过开启EZH2以促进非宿主细胞容许的染色质的形成，进而抑制宿主NF-κB信号的转导并调节宿主细胞周期，促进弓形虫在宿主细胞内的复制[19]。GRA28也是分泌后最终转运至宿主细胞核的一种致密颗粒蛋白[21]，但其生物学功能仍需进一步研究。
GRA18和MAG1跨越PVM后，可最终易位到宿主细胞质，调控宿主细胞的免疫反应。GRA18穿过PVM后在宿主细胞的细胞质中选择性地调控宿主细胞免疫基因的表达[20]。在巨噬细胞感染的情况下，GRA18可诱导趋化因子CCL17和CCL22的表达以及抗炎反应相关的特定基因的表达[20]。MAG1除分布在速殖子的PV基质、包囊的囊壁和基质外，在速殖子和缓殖子阶段均会分泌到宿主细胞质内；MAG1是弓形虫的毒力因子和炎症调节分子，在宿主细胞质内可刺激IL-1β的分泌进而抑制炎症小体的激活，有利于弓形虫的存活和慢性感染的建立[21]。定位于PV的GRA25则可降低被感染巨噬细胞的CCL2和CXCL1的表达，是Ⅱ型弓形虫的毒力因子和免疫调节剂[22]。
弓形虫感染宿主后，宿主会识别弓形虫并激活自身的固有免疫、诱导产生获得性免疫，进而控制弓形虫在宿主的大量繁殖；而弓形虫也会分泌一些效应蛋白到宿主中，通过调控宿主的基因表达或信号通路转导，逃避宿主的免疫反应、避免宿主过早识别并清除弓形虫和被感染的宿主细胞。除以上GRA6、GRA15、GRA24、TgIST等致密颗粒蛋白外，弓形虫还可能分泌其他未知的效应蛋白至宿主细胞，也可能调控未知基因的表达或信号通路的转导，进而维持两者之间的免疫平衡。激活宿主免疫反应的效应蛋白可用于构建亚单位疫苗，抑制宿主免疫反应的蛋白可用于构建基因缺失弱毒疫苗。因此，进一步高通量筛选并鉴别新的分泌到宿主细胞的致密颗粒蛋白或其他效应蛋白、发现新的宿主与弓形虫互作并影响两者免疫平衡的基因或信号通路，对揭示宿主与弓形虫之间的免疫互作机制及阐明弓形虫的致病机制均意义重大。
2.1.2 抵抗IRG防御体系 除以上致密颗粒蛋白可通过调控宿主细胞信号通路和(或)基因表达进而调节宿主细胞的免疫反应外，定位于PVM的部分致密颗粒蛋白可抑制通过IFN-γ诱导产生的IRG，避免宿主细胞对PV的破坏，进而改变宿主免疫反应(表 1)。GRA7、GRA60也可抵抗宿主细胞的IRG防御系统，增强弓形虫的毒力[23-24]。在入侵宿主细胞时，GRA7被磷酸化并与棒状体蛋白ROP18相互作用后，使调节免疫相关GTP酶6(IRGA6)特异性失活，从而抵抗IFN-γ激活的宿主先天免疫[23]。GRA60可抑制宿主细胞IRGA10和IRGA6被招募到PVM上，以促进弓形虫在宿主细胞中的复制[24]，是Ⅰ型弓形虫RH虫株抵抗IRG的重要毒力因子。除此之外，定位于IVN的GRA12可抵抗宿主细胞IFN-γ介导的免疫反应，是弓形虫重要的毒力因子，但其与IRG6在PVM的招募无关[25-27]。研究表明，在小鼠体内，IFN-γ可控制弓形虫的生长主要是由于其可诱导IRGs和鸟苷酸结合蛋白(guanylate binding proteins，GBPs)的产生，大量的IRGs和GBPs结合到PVM后，最终导致弓形虫死亡[28-29]。GRA12虽与IRG6在PVM的聚集无关，但其可能与其他IRGs或GBPs有关。因此，进一步挖掘弓形虫中能抑制IRGs或GBPs的致密颗粒蛋白，将有助于发现其他毒力因子。
2.2 调节宿主细胞周期GRA16和TEEGR/HCE可通过改变宿主细胞中的信号转导而调整宿主细胞的细胞周期，降低弓形虫在宿主细胞中的繁殖速度(表 2)。GRA16分泌后穿越PVM，在宿主细胞质与B55蛋白磷酸酶调控亚基2A(protein phosphatase 2A regulatory subunits B55，PP2A-B55)和疱疹病毒相关泛素特异性蛋白酶(herpes virus-associated ubiquitin-specific protease，HAUSP)结合后核易位，进而干扰肿瘤抑制因子P53的稳定性和活性，延长宿主细胞周期中的G2期[30-31]。TEEGR/HCE可与特定的转录因子E2F3、E2F4、DP1结合，可调控宿主细胞内编码细胞周期蛋白E的基因表达，从而促使感染细胞较快速地通过G1/S转换期，并进入G2期，以利于弓形虫的生长[32]。另外，与GRA16转运相关的致密颗粒蛋白MYR1~4和GRA44可通过介导GRA16的易位，进而致使宿主细胞c-Myc和细胞周期调节蛋白E1上调[33-34](表 2)。但目前尚不清楚宿主细胞停滞在G2期会有益于弓形虫生长的机制，需要进一步探究。
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表 2 参与调节宿主细胞周期的致密颗粒蛋白 Table 2 Dense granule proteins involved in regulating host cell cycle |
致密颗粒蛋白分泌后需转运至PVM或宿主细胞质或宿主细胞核，以发挥其功能，如参与虫体生长、调控虫体的毒力及包囊形成、维持PV和PVM的稳定性以及调控虫体的营养摄取和宿主信号通路的转导等。目前发现，参与致密颗粒蛋白转运和定位的有MYR(1~4)、TgPPM3C(protein phosphatases Mg21/Mn21 dependent 3C)、GRA42、GRA43、GRA44和GRA45等(表 3)。
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表 3 参与蛋白转运和定位的致密颗粒蛋白 Table 3 Dense granule proteins involved in protein transport and localization |
部分致密颗粒蛋白主要定位于PVM，其在弓形虫分泌的效应蛋白的转运过程中发挥重要作用，特别是MYRs、TgPPM3C。MYR是弓形虫的一类分泌蛋白，因其可调控宿主细胞中c-Myc的表达而命名[35]，目前发现的MYR主要包括MYR1、MYR2、MYR3和MYR4；MYR2和MYR3分泌后在PVM上与MYR1共定位，且MYR3与MYR1稳定地结合在PVM上[36]，这类MYR均参与弓形虫分泌蛋白的易位。研究表明，弓形虫感染宿主细胞后，大多数对弓形虫感染应答的差异性基因均依赖于MYR1[40]；MYR1可与GRA44[34]、GRA45[33]、TgPPM3C[38]相互作用，将弓形虫分泌的效应子易位到宿主细胞后[30, 35]，影响宿主细胞的代谢和基因表达等[41]；MYR1还可与GRA44、GRA45、MYR4互作，共同介导GRA16的易位以及宿主细胞c-Myc和细胞周期调节蛋白E1的上调[33]。TgPPM3C是含有丝氨酸/苏氨酸磷酸酶结构域的致密颗粒蛋白，可与MYR1互作，参与GRA18、GRA28、MYR1的磷酸化，并可介导这类分泌蛋白到宿主细胞的转运过程[38]。
主要定位于PV的GRA42、GRA43、GRA44和GRA45也参与分泌蛋白的转运和定位。GRA42和GRA43介导了包括GRA17、GRA23、GRA35在内的多种致密颗粒蛋白在PVM的正确定位[39]。GRA44与GRA45以及弓形虫高尔基体天冬氨酰蛋白酶(aspartyl protease V，ASP5)、MYR1、MYR2、MYR3、PPM3C、棒状体蛋白17(ROP17)共同形成的PVM转运系统，将GRA蛋白由PV转运到宿主细胞核[33]。GRA44和GRA45作为ASP的底物，主要参与GRA16和GRA24至宿主细胞核的转运；GRA44还与MYR1/2/3复合物互作，激活宿主致癌因子c-Myc[34]。伴侣蛋白GRA45可以通过维持其在分泌途径中的天然折叠状态将PVM定位的GRAs正确转运和定位，例如GRA5、GRA7、MAF1、GRA23和GRA44的定位与转运[37]。另外，GRA45还是弓形虫的毒力因子，敲除后弓形虫的生长和毒力均下降[37]。
ASP5在弓形虫致密颗粒转运系统中发挥至关重要的作用。研究表明，ASP5可识别转运原件(Toxoplasma export element，TEXEL)，即RRL位点[42-43]。含有RRL位点的致密颗粒蛋白会在高尔基体中被ASP5切割，切割后被转运至PVM，例如MYR1、GRA16、GRA19、GRA20和GRA44[42-43]。而部分不含有RRL位点的致密颗粒蛋白的定位也会因ASP5缺失而受到影响[42-43]，例如GRA2、GRA3、GRA7、GRA35、GRA24、MYR2、MYR3和TEEGR/HCE1，这可能是因为ASP5操控了其他参与转运这类蛋白的转运子。分子伴侣GRA42、GRA43、GRA45参与GRA17、GRA23、GRA35等在PVM上的定位[39]，GRA45还影响定位在宿主细胞核的致密颗粒蛋白的转运[37]。但GRA45含有RRL位点，GRA42和GRA43不含有RRL位点，说明可能存在其他含有RRL位点的调控蛋白影响GRA42和GRA43的功能。这启示着需要进一步挖掘参与GRAs转运的致密颗粒蛋白，完善对弓形虫致密颗粒蛋白转运机制的认识。
2.4 参与营养物质的摄取弓形虫需要从宿主细胞中摄取自身生长发育所需的营养素。PVM作为弓形虫与宿主细胞质的物理屏障界面，可介导营养物质的摄取和运输、并最终将营养物质转运至PV内供弓形虫生长所用。多种定位于PVM的GRAs在维持PVM渗透性以及摄取营养物质的过程中发挥重要作用[44-59]，例如GRA2、GRA3、GRA6、GRA7、GRA14、GRA17、GRA23(表 4)。
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表 4 参与营养物质摄取的致密颗粒蛋白 Table 4 Dense granule proteins involved in nutrient uptake |
2.4.1 参与PVM中微孔的形成，维持PV的正常形态和PVM的渗透性 PVM是一种选择性渗透膜，允许高达1.3 ku的分子物质在不依赖电荷的情况下进行自由扩散[60]。GRA17和GRA23定位于弓形虫的致密颗粒、PVM和IVN中，参与PVM中微孔的组成，可介导宿主细胞质和PV内小分子物质的运输，对维持PVM的渗透性起着重要作用[44, 46]。研究表明，弓形虫缺失GRA17后，PV出现体积增大的异常形态，PVM减弱了对小分子的渗透性，但在GRA17的缺失株回补高表达的GRA23后，可部分恢复PV的形态以及PVM对小分子的渗透性[44]。这说明GRA17与GRA23协同参与弓形虫PVM的渗透性，其对弓形虫营养物质的摄入以及有毒有害产物的排出至关重要[44]。另外，GRA17在慢性感染阶段定位于包囊膜，对包囊的正常形态和包囊膜通透性的维持以及物质的转运也至关重要[47]。GRA17和GRA23也是弓形虫重要的毒力因子，Ⅰ型和Ⅱ型的基因敲除虫株均可在小鼠急性、慢性和先天性感染中构建免疫保护作用[45, 48-49]。由此可知，PVM中微孔对维持PV内的渗透压、从宿主细胞质摄取营养物质以及排除有毒的代谢产物等过程至关重要。进一步探索PVM中微孔的组成成分，将有助于揭示小分子在弓形虫与宿主细胞之间的渗透机制。
2.4.2 参与IVN的形成或维持IVN的稳定 弓形虫侵入宿主细胞后，会在宿主细胞内形成的PV中复制。PV内具有一个与PVM连接的纳米管网络(IVN)，其由直径为20~50 nm的膜小管组成，贯穿整个空泡空间。IVN增加了弓形虫与宿主之间物质交换的表面积，有利于效应蛋白和营养物质的吸收，进而促进弓形虫的生长[50]。IVN在弓形虫入侵后几分钟内形成，但其具体的形成机制仍然未知。目前，多种定位于IVN的GRAs相继被发现，例如GRA1、GRA2、GRA4、GRA6、GRA9、GRA12、GRA41、WNG1等。其中，GRA2、GRA6、GRA41和WNG1参与IVN形成；GRA6和WNG1维持IVN的稳定。
IVN的生物发生需要GRA2和GRA6。GRA2的两个完整的两亲性α-螺旋是IVN正确形成所必需的[50]；GRA2缺失会导致PV内结构明显紊乱，对宿主细胞溶质蛋白、Rab小泡和脂滴的摄取显著减少[51, 61]。GRA6缺失后INV的初始结构正常，但IVN的成熟结构发生突变[50, 61]。另外，GRA2和GRA6也是弓形虫的毒力因子[52]。GRA41是一种与IVN相关的致密颗粒蛋白，其缺失后组成IVN的小管变短且数量减少，形成小管的小泡数量增多，致使INV形态出现异常[53]。但GRA2、GRA6、GRA41转运至IVN的机制仍然未知。GRA12也是PV内与IVN相关的蛋白，可抵抗宿主IFN-γ介导的免疫反应，进而调控宿主免疫应答，是Ⅰ型和Ⅱ型弓形虫的毒力因子，在急性和慢性感染中均发挥了重要作用[25-27]。除以上致密颗粒蛋白外，定位于PV内的WNG1激酶也是一种参与IVN的形成与稳定的致密颗粒蛋白，这是由于包括GRA4、GRA6在内的多种与IVN形成有关的GRA类蛋白均需要被WNG1磷酸化后才可发挥功能[54]。除GRA4、GRA6外，仍可能存在其他具有磷酸化位点的GRAs被WNGI磷酸化，进而影响IVN的形成。而IVN作为PVM的延伸，可有效地增强弓形虫对营养物质的吸收效率。由此推测，影响IVN形成的因子可能会限制弓形虫的生长。因此，深入研究IVN的形成过程、参与IVN形成的GRAs的转运方式、WNG1的其他磷酸化底物等，将有助于深入揭示IVN的形成机制和生物学功能，发现弓形虫的潜在药物靶点。
2.4.3 参与脂质营养的摄取 弓形虫会从宿主细胞中摄取多种脂质物质，例如鞘磷脂、胆固醇等。定位于PVM的部分GRA本身是跨膜蛋白或与跨膜蛋白互作，形成特定的脂质摄取结构，进而影响弓形虫对宿主细胞中脂质的摄取。GRA3是一种定位于PVM和包囊囊壁的Ⅰ型跨膜蛋白，是GRA7的组成链[57]；GRA3可与内质网的Ⅱ型跨膜蛋白CAMLG相互作用，特异性地结合脂质，促进PVM的结构修饰，进而招募宿主高尔基体并将其吞噬到PV中，摄取宿主细胞内的鞘磷脂[55]。GRA7可与宿主的微管相互结合形成纳虫泡胞内膜-宿主微管桥(host organelle-sequestering tubulo-structures，HOST)结构，帮助虫体摄取宿主溶酶体中的胆固醇；GRA7还使脂质体变形成管状膜，并与GRA2、GRA6联合限制了PV内的IVN扩展[56]。截至目前，HOST结构的组成部分、HOST结构摄取宿主细胞中营养物质的种类、脂质物质摄取后的转运及应用机制的相关研究仍是空白。开展相关研究将为揭示弓形虫摄取宿主营养物质的机制提供新思路。
在弓形虫中，参与物质代谢的致密颗粒蛋白较少，目前报道只有GRA39参与弓形虫的脂质代谢。GRA39定位于PV，参与Ⅱ型弓形虫的脂质代谢，可通过调控弓形虫脂质来影响虫体的生长和毒力[58]。缺失GRA39蛋白后，Ⅱ型弓形虫虫株脂质堆积显著，且弓形虫生长缓慢、毒力和组织包囊数均显著下降[58]。但缺失GRA39导致弓形虫脂质堆积的原因尚不清楚，GRA39可能参与弓形虫摄取脂质的转运或脂质再利用的过程，进一步的相关研究将填补弓形虫脂质代谢的部分空白。
2.4.4 参与对宿主可溶性蛋白质的摄取 与运输相关的宿主内体分类复合物(endosomal sorting complex required for transport，ESCRT)除参与弓形虫对宿主的入侵外[62]，在弓形虫复制时会被招募到PVM，参与对宿主细胞质内蛋白质的摄入[63]。GRA14和其他致密颗粒蛋白会与ESCRT互作，介导摄取了宿主蛋白质的囊泡可以以依赖ESCRT机制的病毒样粒子的出芽方式跨过PVM，进而消化吸收从宿主细胞质内获取的蛋白[59]。另外，IVN形成所需的GRA2也参与对宿主蛋白的吸收[61]。GRA14虽定位于IVN，但其不参与IVN结构的形成[64]。据此可推断，GRA2缺失后，弓形虫对宿主蛋白的吸收减少可能是由于IVN结构异常破坏了GRA14的分布、进而影响了GRA14与ESCRT的互作。IVN形成所需的其他致密颗粒蛋白可能会影响GRA14在IVN的分布，ESCRT也可能与其他致密颗粒蛋白间发生互作，这均需要进一步的研究证实。
2.5 参与弓形虫的逸出弓形虫在宿主体内的扩散依赖于弓形虫的逸出，弓形虫从宿主细胞内逸出依赖于胞内钙离子浓度的升高以及微线体蛋白的分泌。GRA8、GRA22和GRA41与弓形虫在宿主细胞内的逸出存在关联(表 5)。GRA22定位于致密颗粒和PV，参与对弓形虫逸出的调控[65]；缺失GRA22后弓形虫的逸出时间提前[65]。定位于IVN的GRA41对维持弓形虫的钙离子稳态至关重要。缺失GRA41后弓形虫摄取胞外钙离子的稳态失调，从感染细胞内的逸出延迟[53]。但GRA22和GRA41并非含有钙离子结合位点，其影响弓形虫逸出的机制可能与钙离子稳态无关；其能影响弓形虫的逸出可能只是这两种致密颗粒蛋白缺失间接导致的结果；而且具体因何种机制引起还需进一步的研究。另外，GRA8定位于PVM，是弓形虫速殖子阶段膜下细胞骨架的组成部分[66]，与弓形虫膜下细胞骨架的组织和运动相关；敲除Ⅰ型(RH株)虫株的GRA8基因，可降低其对宿主细胞的入侵能力和从宿主细胞的逸出能力[66](表 5)。
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表 5 参与逸出的致密颗粒蛋白 Table 5 Dense granule proteins involved in egress |
针对GRAs的基本功能的研究主要聚焦在速殖子阶段，但在免疫功能正常的情况下，速殖子转化为生长较为缓慢的缓殖子，以包囊的形式存在于骨骼、心、脑组织中，建立慢性感染。一旦宿主免疫力下降，会导致严重的甚至致命的弓形虫脑炎[1]。研究发现，多种致密颗粒蛋白也参与弓形虫的慢性感染，在包囊的形成中发挥重要作用(表 6)。
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表 6 参与慢性感染中包囊形成的致密颗粒蛋白 Table 6 Dense granule proteins involved in cyst formation in chronic infection |
主要定位于PVM的GRA3、GRA5、GRA7、GRA8、GRA9、GRA14和GRA17参与包囊的形成，这类蛋白缺失后，弓形虫慢性感染阶段的小鼠脑包囊数显著减少[27, 47, 67]。在包囊发育和成熟阶段，GRA3和GRA14影响包囊囊壁组成物质在囊壁周围的积聚率[67]，其在Ⅱ型弓形虫的缺失可显著减少感染小鼠体内的包囊数量[27]；定位于包囊膜的GRA17可介导物质的转运、调节缓殖子在包囊内的活力[47]；GRA3和GRA7介导囊壁和囊膜的发育和成熟[67]；GRA7和GRA5在整个包囊发育过程中定位于囊膜和囊壁区域，有助于PVM保持完整并发育成囊膜[67]。GRA8与GRA3、GRA7、GRA9和GRA14一致，其基因敲除后，感染小鼠的脑包囊数可减少60%~80%[67]。
与IVN相关的GRA2、GRA4、GRA6、GRA9、GRA12对囊壁和囊膜的发育和成熟也至关重要。缺失GRA2、GRA4和GRA6后，弓形虫在小鼠慢性感染阶段形成的脑包囊数可显著减少90%[26]。缺失GRA12后，慢性感染小鼠中形成的脑包囊数几乎完全消失[25-27]；而与GRA12同源的GRA12A、GRA12B和GRA12D在弓形虫慢性感染中参与包囊的形成、成熟与激活[68]。
部分在缓殖子阶段表达量高的致密颗粒蛋白也参与包囊的形成。GRA50~GRA53均定位于囊壁[69]，属于囊壁蛋白(CST)。CST1、GRA50(CST2)缺失后，包囊囊壁变得脆弱，且在慢性感染中形成的脑包囊数显著减少[71-72]。另外，定位于PV的GRA55和GRA39对小鼠脑包囊的形成或维持也是至关重要的[58-70]。
目前，参与慢性感染中包囊建立的多个致密颗粒蛋白已被鉴定，但这类致密颗粒蛋白可能是作为调节因子调控包囊的形成，也可能是包囊的结构性组成成分。磷酸化研究表明，参与包囊建立的多种致密颗粒蛋白在缓殖子阶段和速殖子阶段的磷酸化水平不同[26, 73]。由此推断，在包囊转化过程中，致密颗粒蛋白被磷酸化可能是一种调控致密颗粒蛋白在包囊分布的方式。因此，进一步研究含有磷酸化位点的致密颗粒蛋白在缓殖子阶段的功能，以及深入研究包囊囊壁、囊膜的组成成分，将进一步揭示弓形虫在慢性感染阶段转化为包囊的机制。
3 小结近年来，CRISPR-Cas9基因编辑技术在弓形虫研究中得到了广泛的应用，针对弓形虫重要基因和蛋白质生物学功能、致病机制、药物靶点以及疫苗的研究也不断展开。目前尚未研制出安全有效的防控弓形虫病的理想药物或疫苗。致密颗粒蛋白作为弓形虫一类重要的分泌蛋白质，不仅种类丰富，而且参与调控宿主细胞信号传导和基因表达以及免疫逃避、营养物质的摄取等重要的生物学过程。基因组学、转录组学、蛋白组学等组学技术和免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，Co-IP)、邻近依赖生物素鉴定(proximity-dependent biotin identification，BioID)等互作技术在弓形虫研究中的应用，将有助于深入挖掘不同阶段或参与不同功能的致密颗粒蛋白。CRISPR-Cas9基因编辑技术则可帮助人们高效地构建致密颗粒蛋白的基因缺失株，进而深入研究其生物学功能。因此，进一步挖掘并探索弓形虫的新型致密颗粒蛋白及其生物学功能，将推动弓形虫致病机制的研究和抗弓形虫疫苗或潜在药物的研发。
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(编辑 白永平)