毒素-抗毒素(toxin-antitoxin, T-A)系统广泛存在于细菌基因组或质粒中，在调控细菌的生理活动中发挥着重要的作用，包括维持基因组的稳定性、促进抗生素压力下持留细胞的形成、增强噬菌体感染的耐受性、调控细菌细胞程序性死亡和致病力以及生物被膜的形成[1-2]，因此T-A系统已成为多重耐药病原菌致病机理和防控技术研究的新靶标，引起了国内外研究者的高度关注。本文将对T-A系统在细菌生物被膜形成中的作用和调控机制进行综述，以期为更好地掌握T-A系统在细菌生物被膜形成中的作用以及二者之间的调控机制提供参考。
1 细菌生物被膜的危害性细菌生物被膜是细菌黏附聚集到有生命或无生命固体表面形成具有复杂结构的群落组织，广泛存在于自然界，可在江河、岩石以及自来水管和人及动物体内组织等表面形成，具有广泛的危害性。细菌生物被膜作为细菌重要的抗应激机制之一，是细菌适应应激环境(不利环境)而采取的一种生存策略，具有极强的耐药性及免疫逃逸性，是造成临床慢性感染和持续感染的主要原因之一[3]，研究显示：生物被膜细菌对抗生素和杀菌消毒剂的抵抗力比悬浮的非生物被膜细菌高100倍~1 000倍[4-5]，成熟的生物被膜(生长期超过2%)比新生物被膜(生长期小于2%)耐药性更强[6]，因此细菌生物被膜可导致抗菌药物在兽医临床上的治疗失败[7]。生物被膜存在于农产品加工业、乳品加工业、鱼品加工业、禽和肉品加工业以及即食食品加工业[8]，可存在于所有类型的食品加工装置(如塑料、玻璃、金属、木头)及食品产品的表面[9-11]，生物被膜的形成保护了生物被膜内细菌免受食品防腐剂、消毒剂等的清除，耐受高渗透压(腌制食品)，增加了食品中细菌存活和后续交叉污染的可能性，并且降低了食品的保存期限，还可引起食源性传染病的传播而危害人类健康。因此，对于生物被膜形成机制的研究可以为生物被膜的控制和清除提供新的思路和研究策略，本文对T-A系统参与细菌生物被膜形成的作用及其分子机制进行综述，以期为细菌生物被膜形成的分子机制和控制与清除策略的研究提供参考。
2 T-A系统在细菌生物被膜形成中的作用T-A系统最早于1983年在低拷贝质粒上被发现[12]，目前，T-A系统普遍存在于细菌和古细菌中，包括人类和动物的致病菌。T-A系统均由2个共表达基因组成，一个基因编码结构较为稳定的毒素分子，另一个编码不稳定的抗毒素分子。目前根据抗毒素的性质和T-A系统的组成将T-A系统分为8种类型[13]，并且越来越多的研究已经证实T-A系统参与了细菌的生物被膜形成[1, 14]。
2.1 Ⅰ型T-A系统在细菌生物被膜形成中的作用在Ⅰ型T-A系统中毒素分子是蛋白质，抗毒素分子是由编码毒素的基因反方向转录而成的反义RNA，其抑制毒素蛋白mRNA的翻译，这一类T-A包括ldr-Rdl、SymE-SymR、hok-sok、ShoB-OhsC、Zor-Orz、Ibs-Sib、txpA-RatA、bsrG-SR4、IstR-TisB等。枯草芽胞杆菌Ⅰ型T-A系统有txpA-RatA、bsrG-SR4、bsrE-SR5、yonT-yoyJ/SR6、bsrH/as-bsrH等[15]，在营养限制条件下，txpA毒素基因缺失导致非正常形态细菌聚集，干扰细菌群落的正常形成而破坏生物被膜的对称性；氮分子缺乏增强TxpA毒素的转录，同时使生物被膜中的细菌对TxpA的作用变得更为敏感[16]。金黄色葡萄球菌Ⅰ型T-A系统的毒素基因sprG2不仅可以被抗毒素分子sprF2抑制，还可以被SarA抑制，而SarA影响细菌的毒力、代谢、生物被膜形成和对抗生素的耐药性，并且抑制生物被膜形成相关基因ica操纵子和capA1的表达[17]，因此sprG2-sprF2对细菌生物被膜形成的影响可能与SarA有关。大肠杆菌生物被膜形成诱导Ⅰ型T-A系统毒素基因ralR的表达[18]，而在Clostridium difficile中生物被膜相关的因子对部分Ⅰ型T-A系统具有调控作用[19]。
2.2 Ⅱ型T-A系统在细菌生物被膜形成中的作用Ⅱ型T-A系统的毒素和抗毒素分子均为小分子蛋白质，抗毒素蛋白与毒素蛋白直接相互作用形成紧密结合的复合物抑制子而发挥作用[20]，目前研究最普遍和最广泛的是Ⅱ型T-A系统[21]，在E. coli K-12染色体上至少有19对Ⅱ型T-A系统，包括mazEF、relBE、yefM-yoeB、dinJ-yafQ、prlF-yhaV、chpBI-chpBK、hicAB、yafNO、hipBA、mqsAR、ygjNM和ygiUT等，大多数的毒素分子均为核糖核酸内切酶(RNase)，以不同的特异性分别剪切mRNA抑制蛋白翻译，而抗毒素分子直接通过蛋白质相互作用中和毒素分子的功能发挥，并且可以通过与启动子区域的操纵元件结合调控T-A操纵子转录[22]，其中，RelE、YoeB、YafO、YafQ和YhaV毒素蛋白具有翻译依赖性RNase活性，而MazF、ChpBK、HicA和MqsR毒素蛋白的核糖核酸内切酶活性与核糖体无关[23-30]。
目前，越来越多的研究已经证实多个Ⅱ型T-A系统参与了细菌生物被膜的形成[14]，在肠外致病性大肠杆菌中缺失Ⅱ型T-A系统hicAB、prlF-yhaV和yafNO均可使细菌的生物被膜形成能力显著下降[31-34]。MqsRA是第一个被发现与生物被膜形成有直接作用的Ⅱ型T-A系统[35]，并且对其调控生物被膜形成的分子机制进行了较深入的研究。MqsR表达下降可以直接降低参与curli菌毛形成的调控子CsgD的表达，导致信号分子c-di-GMP和curli菌毛的形成减少，促使生物被膜形成能力下降[36]。而氧化应激作用使Lon蛋白酶对MqsA发生降解作用，促使生物被膜形成[37]。MqsR的核酸内切酶活性在5′-GCU位点特异性地剪切mRNA[23]，并且这种特异性还可降解Ⅴ型抗毒素蛋白GhoS的mRNA，从而对Ⅴ型T-A系统GhoT-GhoS起调控作用[38]。然而，也有研究结果表明，大肠杆菌mqsRA缺失菌株不影响生物被膜的形成，与野生型菌株具有相似的细菌附着生物量，并且curli菌毛形成和csgD的表达没有差异性[39]。此外mqsA的超表达也不影响细菌附着生物量和curli菌毛的形成[39]，推测Ⅱ型T-A系统mqsRA在调控细菌生物被膜形成中具有复杂性，或许因菌株不同或种属不同而具有差异性。因此T-A系统对生物被膜的调控具有不同的分子机制，仍然需要进一步大量研究明确其差异性才能更好地掌握T-A系统参与生物被膜形成的作用机理。
有研究报道，分别缺失Ⅱ型T-A系统MazEF、RelBE、ChpB、YoeB-YefM或YafQ-DinJ的E.coli菌株生物被膜在形成初期受到抑制，导致生物被膜形成能力下降，主要原因是由于细菌的附着能力下降，然而在生物被膜形成后期这些缺失菌株通过减少生物被膜的分散作用而增强了生物被膜形成能力；通过对这5个缺失株转录组的分析发现共同诱导了一个功能未知蛋白基因yjgK的表达；5个毒素蛋白的缺失可以促进生物被膜的早期形成，而超表达毒素蛋白则可以在早期抑制生物被膜的形成，并且证实yjgK基因可以控制细菌生物被膜的形成，与5个T-A系统的缺失对生物被膜的影响具有一致性[40]。当大肠杆菌K-12菌株中毒素基因yafQ缺失后，其生物被膜形成能力与野生菌相似，但yafQ缺失菌株生物被膜暴露于杀菌浓度的头孢唑林和妥布霉素中，生物被膜中的活菌数下降了2 400倍以上，而超表达yafQ基因的菌株活菌数增加了10 000倍以上[41]。因此T-A系统不仅在生物被膜形成期具有影响作用，而且还可以增强生物被膜中细菌的耐受性，进而增加生物被膜的危害性，这将对生物被膜的清除和控制提出更大的挑战。
大肠杆菌中CcdAB和HipAB在致病菌中是非常保守的，在E. coli Nissle 1917(EcN)菌株中，抑制ccdAB或hipAB基因的表达显著降低EcN菌株在平台稳定期的生物被膜形成能力，当ccdAB和hipAB基因同时被抑制时生物被膜形成能力急剧下降，ccdAB和hipAB调控EcN菌株生物被膜和持留细菌的形成与DNA合成、SOS应激反应和严紧反应相关[42]；当抑制hipAB表达后显著降低 gyrA的表达量，提示HipAB在调控EcN菌株生物被膜形成中具有正向作用，通过增加DNA的合成而促使生物被膜形成能力增强，hipAB基因缺失同样上调严紧反应基因，促使生物被膜形成能力下降[42]。当细菌暴露在亚抑菌浓度的环丙沙星下，recA基因缺失可以降低22%~80%的E.coli生物被膜形成量，而hipAB和ccdAB转录被抑制后能够上调recA基因的表达量[43]。同时缺失ccdAB和hipAB基因导致F1C菌毛合成相关基因focA表达下降[42]，而有报道F1C菌毛在E. coli的生物被膜形成中是必需的[44]。在无抗生素压力下缺失E. coli BW25113菌株hipBA显著降低生物被膜形成量，用Dnase I对BW25113野生菌株处理导致生物被膜形成显著下降，而对hipA缺失株生物被膜的处理影响很小；HipA失活使生物被膜形成中的eDNA水平下降，而额外添加BW25113菌株基因组DNA可以促进野生型和hipA缺失株的生物被膜形成；野生型与hipA缺失株相比发生了严重的细菌细胞溶解[45]，在大肠杆菌中HipA毒素蛋白通过EF-Tu的磷酸化作用而剪切RNA，抑制蛋白翻译过程[46]。
在铜绿假单胞菌T-A系统HigBA中，higA缺失和higB过表达的细菌生物被膜形成能力下降，表明铜绿假单胞菌毒素蛋白HigB参与了细菌生物被膜形成的调控[47]，HigB可以降低细菌胞内c-di-GMP的水平，而c-di-GMP具有抑制生物被膜形成的作用，通过对c-di-GMP已知的代谢基因的表达水平进行分析，发现3个c-di-GMP水解基因被HigB上调，分别为PA2133、PA2200和PA3825基因，通过对这3个基因分别缺失或同时缺失可以减少HigB对生物被膜形成的调控作用[48]。将铜绿假单胞菌在第一阶段形成的生物被膜暴露于环丙沙星中导致 higA和higB基因在整个试验过程中超表达，生物被膜长期处在抗生素暴露条件下可能使HigA发生降解，或者HigB对于生物被膜的持续存在没有发挥作用[49]，并且缺失hicAB基因不影响铜绿假单胞菌的生物被膜形成和毒力[50]。
在金黄色葡萄球菌Ⅱ型T-A系统MazEF中，mazF毒素的过度表达会抑制生物被膜的形成，mazF基因缺失在显著增加生物被膜形成的同时，降低了生物被膜对抗生素的耐受性，而mazF基因表达可以抑制生物被膜形成，但提高了生物被膜对抗生素耐受性，在急性感染转变为慢性感染中发挥了关键作用[51]，通过对临床分离的金黄色葡萄球菌菌株对甲氧西林的耐药性和生物被膜形成与mazEF的基因表达相关性分析表明，mazEF的表达与否与生物被膜形成没有显著的相关性[52]。在金黄色葡萄球菌中，yoeB及其同源基因yoeB1和yoeB2缺失，降低细菌生物被膜的形成，而野生型菌株具有更高的胞间黏附素生成量，而对野生型菌株采用Dnase I处理降低了生物被膜的形成，而对yoeB1和yoeB2基因缺失株没有影响[53]。
肺炎链球菌T-A系统yefM-yoeB的缺失导致细菌生物被膜厚度显著减小[54]，然而缺失yoeB并不影响生物被膜生长，但缺失yefM-yoeB的操纵子表现出生物被膜形成增加，表明YefM-YoeB的T-A系统参与了生物被膜的形成[54]。E. piscicida中的Ⅱ型毒素抗毒素系统YefM-YoeB在生物被膜形成中的作用与肺炎链球菌中不一致[54]，YefM-YoeB缺失与野生菌TX01相比增强了细菌的耐高温能力、生物被膜形成能力，yefM-yoeB缺失菌株的生物被膜形成能力显著高于野生菌株和yoeB缺失菌株，表现为生物被膜厚度和密度显着增加，而yoeB缺失菌株表现出与野生菌株相似的水平[55]，因此YefM-YoeB在不同病原菌种的功能和作用机制是不同的，并敦促人们研究和揭示这些T-A系统的功能和作用机制。
目前，虽对Ⅱ型T-A系统在细菌生物被膜形成的研究较多，但不同的Ⅱ型T-A系统在细菌生物被膜形成中的作用不同，并且具有不同的分子调控机制，对于其深层次的调控机制尚不清楚，这对开发具有广谱、有效的生物被膜抑制剂或其他清除技术带来了巨大的挑战。
2.3 Ⅲ型T-A系统在细菌生物被膜形成中的作用在Ⅲ型T-A系统中，毒素分子是蛋白质，而抗毒素分子是RNA，ToxI-ToxN是第一个被发现的Ⅲ型T-A系统，RNA抗毒素分子直接与毒素蛋白相互作用而发挥活性[56]，目前，还未见有Ⅲ型T-A系统参与细菌生物被膜形成的相关研究和报道。
2.4 Ⅳ型T-A系统在细菌生物被膜形成中的作用在Ⅳ型T-A系统中毒素与抗毒素分子都是蛋白质，抗毒素蛋白直接竞争性结合毒素蛋白在细胞的靶位点而发挥功能，YeeU-YeeV(又名CbtA/CbeA)是第一个在E. coli中被发现的Ⅳ型T-A系统[57-58]。在大肠杆菌K-12中，Ⅳ型抗毒素基因yafW、yfjZ、cbeA分别缺失或同时缺失均能够使细菌生物被膜形成能力在早期增加2倍~4倍，然而分别缺失相对应的毒素基因ykfI、ypjF、cbtA或同时缺失仅对生物被膜的形成具有轻微的增加作用[57]。目前对Ⅳ型T-A系统在细菌生物被膜形成中作用和分子机制亟待进一步研究和解析。
2.5 Ⅴ型T-A系统在细菌生物被膜形成中的作用Ⅴ型T-A系统的毒素和抗毒素分子均为蛋白质，但抗毒素不是与毒素直接结合，而是抗毒素蛋白分子具有酶活性以降解毒素mRNA而发挥作用，GhoT-GhoS是第一个被发现的Ⅴ型T-A系统，毒素蛋白GhoT的表达可导致细菌死亡或造成细菌持留感染形成，抗毒素蛋白GhoS作为一种序列特异性的核酸内切酶切割ghoT mRNA而阻止ghoT翻译，此外GhoT-GhoS还受不同应激条件的调控[38]。在LB培养基30和37 ℃培养8 h时，ghoT缺失降低细菌生物被膜形成能力4倍以上，而缺失ghoS显著增加生物被膜形成能力6倍以上[38]。在应激条件下，Ⅱ型T-A系统的毒素分子MqsR降解Ⅴ型T-A系统的抗毒素ghoS的mRNA以促进ghoT mRNA翻译产生具有活性的毒素分子从而调节细菌生理活动过程，GhoT-GhoS是第一个发现的被另一个T-A系统调节的T-A系统[59]。因此T-A系统之间存在的相互调控作用致使T-A系统调控生物被膜形成的机制复杂化，这给研究T-A系统参与生物被膜形成中的作用和分子机理增加了很多难点。
2.6 Ⅵ型T-A系统在细菌生物被膜形成中的作用第一个Ⅵ型T-A系统socAB是在革兰阴性菌Caulobacter vibroides中发现的[60]，毒素蛋白SocB强有力地结合到DNA聚合酶的β-sliding clamp上阻止DNA复制延伸，而抗毒素SocA作为蛋白水解适配器蛋白质结合到毒素SocB发挥蛋白酶对SocB介导的降解作用[60-61]，目前，尚未见Ⅵ型T-A系统参与细菌生物被膜形成的相关研究及报道。
2.7 Ⅶ型T-A系统在细菌生物被膜形成中的作用Ⅶ型T-A系统是最近新分类的一类T-A系统，毒素分子和抗毒素均为蛋白质，由抗毒素分子对毒素分子进行酶促修饰而发挥作用，这种酶促修饰作用是通过毒素和抗毒素两个分子的短暂相互作用而实现，不同于Ⅱ型T-A系统的紧密结合作用[62]。第一个Ⅶ型T-A系统hha-tomB在小肠结肠炎耶尔森菌[63]和E. coli中被发现[64]，Hha毒素分子是一个溶血素表达调节蛋白，通过增加细菌分散作用导致生物被膜形成下降，而抗毒素TomB在生物被膜形成中是一个毒素过表达调节子，在氧存在的条件下使毒素Hha失去活性；抗毒素TomB的活性是氧依赖性的，促进Hha单个保守的半胱氨酸Cys18发生氧化作用转变为SOx H种类的分子(包括sulfenic RSOH、sulfinic RSO2 H和sulfonic acid RSO3 H)，因此Hha-TomB作为氧感应分子参与到了细菌生物被膜的形成[13, 63]。在大肠杆菌中, Hha可以结合稀有密码子tRANs(argU、ileX、ileY和proL)抑制稀有密码子tRNAs的转录作用从而抑制菌毛基因fimA和ihfAD的转录导致菌毛生成的作用下降而显著降低细菌生物被膜的形成；Hha对稀有密码子的转录抑制作用还能够激活噬菌体裂解基因rzpD、yfjZ、appY和alpA，并且可以引起ClpP/ClpX蛋白酶降解抗毒素而激活毒素，这两种作用还可以导致细菌发生溶菌和生物被膜崩解[64]。因此T-A系统对于生物被膜形成的影响是多方面的，不仅在早期影响细菌黏附作用而降低生物被膜形成能力，还可通过对成熟的生物被膜产生分散作用而致使生物被膜发生崩解，降低细菌对于不利环境或消毒剂和抗生素的耐受性从而加速对生物被膜细菌的清除作用。
2.8 Ⅷ型T-A系统在细菌生物被膜形成中的作用Ⅷ型T-A系统也是近年来新发现的一类T-A系统，毒素和抗毒素分子均为小RNA，其位于相同位点DNA序列的不同DNA单链上，抗毒素小RNA通过反向结合毒素小RNA而阻止毒素小RNA发挥作用。sdsR-ryeA是第一个被鉴定的Ⅷ型T-A系统[65]，毒素分子SdsR可以将不同mRNA作为靶分子进行基因表达的调控，在大肠杆菌和沙门菌中分别通过抑制mutS、tolC和crp、stpA、ompD、tolC的转录而发挥作用[66-67]，而在大肠杆菌中，缺失外膜蛋白TolC导致细菌对渗透压环境的应激改变，从而导致curli菌毛和生物被膜形成能力下降[68]，在沙门菌中，通过外排泵抑制剂抑制TolC的功能或缺失TolC，均可导致细菌生物被膜形成能力下降[69]，因此虽无sdsR-ryeA直接参与细菌生物被膜形成的报道，但sdsR-ryeA可能会通过TolC间接参与并调控细菌生物被膜的形成。
3 小结细菌生物被膜广泛存在于自然界中，严重威胁人和动物的健康以及食品安全。细菌T-A系统也广泛存在于细菌的基因组和质粒中，在细菌的生物被膜形成中发挥调控作用，有的T-A系统可以直接影响生物被膜的形成，而有的T-A系统间接影响细菌生物被膜的形成，但大部分T-A系统影响细菌生物被膜形成的分子机制尚不明确，仍需要更进一步的研究。此外，新类型的T-A系统不断被发现，其在细菌生理活动和生物被膜形成中的作用和机制需要进一步明确。因此，通过对T-A系统影响细菌生物被膜形成的作用及分子机制的研究，开发具有针对性或特异性的消毒剂和其他药物或生物被膜清除和防制技术，对于减轻细菌生物被膜的威胁具有重要的理论意义和应用价值。
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(编辑 孟培)