人们对于骨骼肌的研究可以追溯到十九世纪中期，即显微镜发明后人们才逐渐认识到骨骼肌的结构。不断深入的研究为骨骼肌形成和调控机制的探讨奠定了基础，并遍布生理学、临床医学、农业等多个领域。骨骼肌起源于中胚层，来源于胚胎发育过程中的体节。体节分化成皮肌节和生骨节，分别形成骨骼肌和骨骼。许多因子影响着骨骼肌的发育，比如由周围环境分泌的细胞外信号分子Wnt与Shh，或是在肌源性分化中起关键作用的MRF家族^[1]。畜牧场的首要目标是用最少的投入生产出尽可能多的优质肌肉。过去的几十年里在这方面取得了巨大的进步，这要归功于那些有利于提高瘦肉率的分子调控机制及生长促进剂。它们促进了畜禽的肌肉组成，并使得其健康状况、遗传及营养水平得到改善。最近几年人们对于畜禽肉产品的需求也在日益上涨，肌肉产量的增加主要靠肌细胞体积增大，而肌纤维的类型和数量又直接影响肉质，因此了解肌纤维的发育规律及其分子机制是很有必要的。本文拟以1987—2022年的肌纤维研究文献为材料，对肌纤维的发育过程、类型及基因调控研究进展进行综述，为畜禽育种及肉质改善提供思路。

1 肌纤维的结构与发育过程

骨骼肌的基本组成单位为肌纤维。肌纤维是由成肌细胞融合形成的多核细胞，占肌肉总体积的75%~90%，其长度一般在1~40 mm, 直径一般在10~100 μm。肌纤维的数目在出生前就已经决定，出生后数目不会再发生变化，但其体积和类型会随年龄的增长而发生变化^[2]。

肌纤维由肌原纤维平行排列组成。肌原纤维是与肌纤维长轴平行的圆柱形长棒，直径为1~2 μm，约占肌纤维的60%~70%，每根肌纤维中含有约2 500根肌原纤维^[3]。肌浆为肌纤维的细胞质，其内含有大量的水溶性蛋白质、糖元、ATP和酶，主要发挥储存释放和隔离钙的作用。肌节是肌原纤维的基本单位，也是肌肉收缩和舒张的最小运动单元。它位于肌原纤维两条相邻Z线之间，其含有的肌球蛋白和肌动蛋白对保持骨骼肌的收缩特性非常重要并且也为其他参与信号传导或能量代谢的蛋白的结合提供了支架^[4]。

脊椎动物骨骼肌的形成与发育起源于近轴中胚层。在神经胚阶段的胚胎中，中胚层被细分为4个区域: 脊索中胚层、近轴中胚层、间介中胚层和侧中胚层。脊索中胚层产生脊索，脊索参与神经管的形成和前后轴的建立。近轴中胚层位于神经管的两侧，它在颅区形成颅中胚层，颅中胚层是骨骼、骨骼肌以及面部和颅骨结缔组织的来源^[5]。脊索两侧的背部中胚层生成体节板，随后形成体节。体节分为腹侧体节和背侧体节，腹侧体节分化形成的生骨节会生成脊椎和肋骨的软骨以及骨骼和躯干肌腱；背侧体节会发育为生皮肌节，生皮肌节上可形成背部肌肉、膈肌、四肢肌肉以及卫星细胞。小鼠在胚胎第8天开始形成肌节，鸡从胚胎第2.5天开始形成肌节。随后将产生的祖细胞转变为成肌细胞^[6]。

2 肌纤维的分类与转化规律

哺乳动物的骨骼肌被分为收缩速度缓慢的暗红色肌肉和收缩速度快的浅白色肌肉。基于肌球蛋白ATP酶活性对不同pH孵育敏感性的差异可将肌纤维分为Ⅰ型、ⅡA型和ⅡB型肌纤维。随后Schiaffino等^[7]通过免疫印迹和单克隆抗体确定了ⅡX型肌纤维。其中，MYH7、MYH2、MYH1和MYH4基因分别编码MyHCⅠ型、ⅡA型、ⅡX型和ⅡB型。这4种不同MyHC亚型肌纤维的收缩速度及所使用的能量代谢类型也有所不同，根据氧化代谢能力依次降低及收缩速度依次增大的顺序可分为慢速氧化型(Ⅰ型)、快速氧化型(ⅡA型)、中间型(ⅡX型)和快速酵解型(ⅡB型)。Ⅰ型纤维主要依靠氧化代谢产生ATP，而ⅡX和ⅡB型纤维主要通过糖酵解产生ATP，其中ⅡB型纤维的糖酵解作用最强。ⅡA型纤维表现出介于Ⅰ型和ⅡB型之间的性质。家畜中主要表达4种MyHC异构体，即Ⅰ型、ⅡA型、ⅡX型和ⅡB型^[8]。但在家禽中主要将肌纤维分为Ⅰ型、ⅡA型和ⅡB型^[9]。

不同类型的肌纤维在各种生理特性方面具有显著差异。Ⅰ型纤维一般直径较小，外观较红，更耐疲劳，有更多的线粒体，且产生比Ⅱ型纤维更小的收缩力^[10]。Ⅰ型纤维在冷冻解冻方面也比ⅡA或ⅡX型纤维更稳定^[11]。酵解型肌纤维比例增加通常伴随着肌肉品质的下降，酵解型肌纤维比氧化型肌纤维更易产生PSE肉(苍白、柔软、渗水)^[12]。Mashima等^[13]研究发现，在日本黑牛中高含量的MyHCⅠ会导致肌肉中的游离氨基酸含量升高，而这种游离氨基酸会导致肉的味道更加浓郁。反观口味相对较差的鸭胸肉则全部由快肌纤维组成^[14]。

肌纤维类型在畜禽的生长发育过程中具有相互转化的特性，且这种转化处于动态平衡中。肌纤维可在多种因素(如年龄、激素、环境、分子调控)下发生表型转化以适应外界环境^[15]。畜禽在刚出生时肌纤维中大部分都为氧化型肌纤维，随着生长发育，氧化型肌纤维会逐步转化为酵解型肌纤维^[16]。Chen等^[17]研究发现，膳食补充L-茶氨酸可促进骨骼肌纤维从Ⅱ型向Ⅰ型转变。Yu等^[18]研究表明，FKBP1C可以直接和MYH1B相互作用，提高其蛋白稳定性，从而影响成肌细胞的增殖和分化，并调节骨骼肌纤维类型的转变。牛出生后0~12月内伴随着ⅡA型纤维百分比的减少和ⅡX型纤维百分比的增加，12个月后ⅡX纤维百分比降低，Ⅰ型和ⅡA型纤维的百分比增加^[19]。Jiang和Ge^[20]通过对比公牛和阉公牛的肌纤维性状进行研究发现，雄激素可增加肌纤维的平均横截面积，这种特性与ⅡA型纤维向ⅡX型纤维的转化效率随年龄的增长而减慢有关。在禽类中也有关于肌纤维类型转化的研究，如PRKAG3基因是调控鸡肌纤维类型组成的重要节点基因，它的表达与Ⅰ型肌纤维呈显著负相关^[21]。另外，Sox6在鸡胚发育过程中发挥着重要作用，且能够促进快肌纤维的表达并抑制慢肌纤维的表达^[22]。

3 肌纤维发育调控相关基因 3.1 MRFs家族

生肌调节因子(MRFs)基因家族是肌肉发生过程中的重要基因家族，涉及肌肉前体细胞的增殖、肌纤维的形成以及出生后的肌肉功能^[23]。控制胚胎中骨骼肌细胞确定和分化的转录调节网络的4种核心肌源性调节因子为生肌调节因子5(myogenic factor 5, Myf5)、生肌决定因子(myogenic determining factor, MyoD)、生肌调节因子4(muscle regulatory factor 4, MRF4)和肌细胞生成素(myogenin, MyoG)。1987年Davis等^[24]分离出小鼠的MyoD基因，并将一小部分成肌纤维细胞和其他类型的分化细胞转化为骨骼肌系。1989年，MyoG被确定为一种使成肌细胞进行肌源性分化的序列，它可使肌细胞退出细胞周期并融合形成多核肌纤维^[25]。MyoD和MyoG的序列同源性随后使得Myf5和MRF4被发现。它们都含有一个螺旋-环-螺旋(bHLH)结构域，并可以识别并结合E-box序列^[26]。其中MyoD和Myf5与胚胎期肌细胞的发育有关，而MyoG和MRF4主要参与肌管的融合，并与肌细胞的终末分化有关。Myf5、MyoD和MRF4被认为是肌源性决定因子，引导祖细胞建立骨骼肌谱系。

在MRFs家族中，Myf5在前体细胞中表达最早，在骨骼肌分化中起关键作用。Myf5占据肌肉特异性基因的启动子区域，在肌节的形成过程中与其他MRFs协同表达, 从而促进成纤维细胞转化为成肌细胞。此外，它可以稳定染色质的开放状态，促进转录和MyoG的表达^[27]。Zhao等^[26]研究发现，犊牛中Myf5仅在肌肉中表达，而成年奶牛中Myf5基因在器官和组织中广泛表达。位于基因下游的是MyoG，它与MyoD和MRF4一起激活成肌分化程序。MyoG主要参与调节肌纤维的融合以及肌细胞的分化, 尽管在成年畜禽动物中MyoG的表达较低，但它是调节骨骼肌有氧和无氧代谢之间能量平衡不可分割的因子，从而促进肌肉的稳定性。Ganassi等^[28]研究发现，MyoG可通过促进肌细胞融合来平衡纤维的数量和大小。在增殖的成肌细胞中，MyoD的表达受转录因子FoxO3、Six1/4、Pax3和Pax7的诱导^[29]。CDR1as是一种在山羊胚胎中期肌肉中高度表达的circRNA，Li等^[30]研究发现，MyoD可加快CDR1as的表达从而促进骨骼肌卫星细胞成肌分化。MRF4在肌肉谱系的决定和分化中具有双重作用，表现为双向表达^[29]。在成熟的肌纤维中，MyoD和MyoG的表达下降，而MRF4继续高水平表达，在其中扮演主要的MRFs角色。在体节早期胚胎骨骼肌的形成过程中，肌祖细胞是从皮肌节的边缘衍生出来的，而Myf5和MRF4在祖细胞中起着关键作用^[31]。

3.2 Pax3与Pax7

配对盒(paired box, Pax)基因是一个进化保守的转录因子家族，在发育、组织稳态和疾病中发挥着重要的作用。根据基因组结构、序列相似性和保守性将Pax基因分为4个亚家族，其中与肌纤维发育密切相关的转录因子Pax3和Pax7属于Ⅲ亚家族，他们互为负反馈调控关系。Pax3是胚胎骨骼肌早期形成过程中的主要调节因子，其在近轴中胚层和上皮性体节中都有表达，之后局限于皮肌节。在体节和肢体中，Pax3和Myf5在肌肉发生的第一阶段调控MyoD的表达。在皮肌节和迁移到肢体的细胞中，Pax3的表达先于MyoD^[32]。Der Vartanian等^[33]研究表明，Pax3赋予了骨骼肌干细胞对环境应激反应的功能异质性。De Morree等^[34]研究发现，不同类型肌肉(比如四肢肌肉和横膈肌)之间的肌肉干细胞激活率的差异是由Pax3的水平决定的。而Pax7主要表达于中央皮肌节，在成年后的生长和肌肉再生过程中起主导作用^[35]。在老鼠身上，去除这一因子会导致出生后的早期死亡^[36]。此外Pax7被证明可以抑制细胞凋亡，敲降Pax7会导致卫星细胞和横纹肌肉瘤细胞死亡率增加^[37]。在肌肉损伤时，激活的干细胞表达Pax7和MyoD，随后一部分分化的细胞抑制Pax7的表达并促进MyoG表达，从而形成成肌细胞^[38]。Pax7的乙酰化状态可调节肌肉干细胞的功能和分化潜力从而促进肌肉组织的代谢^[39]。Florkowska等^[40]研究发现，Pax7通过调节Dnmt3b和Apobec2的表达来平衡细胞周期。Pax7如果缺失，卫星细胞和成肌细胞会出现细胞周期的停滞和生肌调节因子的失调^[41]。

Pax3和Pax7在肌发生中表现出部分功能重叠，但Pax3并不能弥补卫星细胞和成熟肌纤维中Pax7的缺失。就像卫星细胞中均有Pax7的表达，但只有一部分卫星细胞表达Pax3，而且通常是和Pax7共表达。表达Pax3的卫星细胞的比例在不同的肌肉中也有所不同^[42]，比如表达Pax3的卫星细胞在前肢和膈肌中频繁出现，但在后肢中并不常见^[43]。

3.3 Wnt和Shh信号通路

Wnt是一个信号分子家族，是一种分泌型生长因子，属于一个保守的富含半胱氨酸的糖蛋白家族，参与胚胎发生、肌肉的形成、成人组织修复和癌症。在与卷曲蛋白(frizzled, Fzd)受体结合后，Wnts通过典型途径激活β-catenin/TCF转录复合物或通过不同的非典型途径发挥作用^[44]。在受伤后，许多Wnt配体(如Wnt3a、Wnt5a、Wnt5b、Wnt7a和Wnt7b)从多种来源(主要是肌纤维和活化的卫星细胞)表达和分泌。Wnt1、Wnt3a和Wnt4由神经管分泌, 而外胚层表达Wnt4、Wnt6和Wnt7a。Wnt在肌纤维的生长发育中发挥作用，Marcelle等^[45]证明了在体节形成后，Wnt1和Wnt3a驱动体节背部皮肌节的形成。Wnt信号也可通过Barx2诱导肌源性基因的表达，刺激卵泡抑素，抑制肌生长抑制素的分泌并将负调控因子Setdb1转移到细胞质中，从而促进成肌细胞的分化和融合^[46]。Wnt蛋白还能够调节MRFs的表达，根据之前的研究表明Wnt1优先激活Myf5从而诱导肌肉的形成，而Wnt6和Wnt7a优先促进MyoD的表达^[47]。Wnt信号在肌纤维类型中也发挥作用，Wnt5可增加慢肌纤维的数量并减少快肌纤维的数量，而Wnt4和Wnt11可促进快肌纤维的生成从而增加其数量^[48]。综上所述，Wnt信号在发育过程中存在驱动肌纤维多样化的内在和外在机制并在肌纤维类型转化中发挥作用。

音猬因子(sonic hedgehog, Shh)是Hedgehog家族的成员，在软骨发生、软骨内成骨和骨骼肌发育过程中起着重要的调节作用。在轴下肌发育过程中，Shh信号维持了肢芽中Myf5和MyoD的表达^[49]。研究发现，对Shh做基因敲除小鼠则不会表达MyoD和Myf5并且也不会形成外轴肌节^[50]。此外，发育中的斑马鱼如果缺乏Shh信号体节会促进Pax3和Pax7的表达，但会阻止后续的肌源性谱系进展^[51]。Shh信号中重要的下游因子Gli在促进有丝分裂中起着重要作用。Voronova等^[52]研究表明，Gli2转录因子不仅能结合MyoD基因元件来调节其转录，还能结合MyoD本身来调节其诱导骨骼肌发育的能力。

以上研究表明，Wnt和Shh信号通路在非特定细胞的肌源性测定中起协同作用。支持这一观点的是在Myf5增强子中发现了Gli结合位点和Tcf/Lef序列，解释了Shh和Wnt信号通路是如何共同激活Myf5^[53]。

3.4 其他相关基因

肌生长抑制素(myostatin, MSTN)，又称生长分化因子8(GDF-8)，是肌细胞增殖的重要调节因子，也是骨骼肌生长的高度负调节因子^[54]。MSTN首先在肌节的体节中表达，随后在发育完全的骨骼肌中表达。如果在胎儿时期缺失功能性MSTN则会通过肌纤维的增生和肥大导致肌肉质量的显著增加^[19]。MSTN可以调节肌纤维类型的组成，在成年动物中Ⅱ型纤维比Ⅰ型纤维含有更高水平的MSTN。有研究表明，在牛中MSTN突变会导致“双肌肉化”表型，即在胎儿时期的肌纤维高度增生，大约是纤维总数的两倍，且增生的纤维是ⅡA型和ⅡX型纤维^[55]。Liu等^[56]研究发现，MSTN在鸽子胸肌中的表达最为丰富，表现为随着日龄的增加而增加且与肌纤维横截面积呈显著正相关。

同源盒转录因子Six家族在脊椎动物中高度保守，共有6个成员(Six1~6)，是躯干和头部骨骼肌中MyoD的上游调控因子，在肌肉的发生过程中起主要作用。Grifone等^[57]研究发现，在Six1/4突变的小鼠在躯体和肢体的肌肉前体细胞中MyoD的表达减少。Myf5在肢芽中的表达也是由Six1通过调控MEF3位点直接控制的。Six1对于快肌纤维的生成也有关键作用，Wu等^[58]研究发现，Six1在Ⅱ型纤维的表达水平显著高于Ⅰ型。配对样同源域转录因子2(paired-like homeodomain transcription factor 2, PITX2)是调节头部和躯干MyoD的另一个调控因子。在肢体和肌节中，PITX2与Myf5、Myf4协同调节MyoD的表达。而在头部和眼外肌中，它作用于Myf5和Myf4的上游^[59]。有研究表明，PITX2和Six1基因与猪的肉品质有关^[60]。Cao等^[61]研究也发现，这两个基因与鸡的胴体体型显著相关。

血清应答因子(serum response factor, SRF)是MADS box转录因子家族的成员，在骨骼肌、心肌和平滑肌的形成中发挥作用。在骨骼肌中，它不是胚胎MyoD表达和肌生成所必需的，但在成年肌肉稳态中起作用。有研究发现，在胚胎发育的过程中，中胚层的形成需要SRF, 从而证明了SRF是一个重要的转录调控因子^[1]。Lahoute等^[62]通过建立SRF基因敲除模型发现，突变小鼠逐渐出现ⅡB型肌纤维特异性萎缩，肌肉脂质堆积、肌节组织紊乱和纤维化等问题, 在肌肉损伤后突变肌肉会表现出再生纤维变小和持续性纤维化，而这些特征都与骨骼肌老化所表现出的特征相同，且SRF在小鼠和人类肌肉中的表达随着年龄而下降。总的来说，SRF突变会加速骨骼肌的衰老过程。

4 展望

综上所述，肌纤维的生长发育、类型的确立及转换机制相当复杂，涉及很多的通路及生物信号，而多数信号基因之间又相互影响。虽然已经探索出了许多因子及其机制，但还有很多等待我们去挖掘。比如在MyoD中，核心增强子和远端调节区如何相互沟通来精确驱动MyoD的表达，相对贡献又是如何？再比如许多研究表明转录因子与表观遗传之间存在相关性，但是哪一个是优先的，它们之间的相互作用还没得到充分的探索。而现有的认知并不能够全面解释这些问题，所以还需加强肌纤维基因及信号通路相关的研究，并将其应用到畜禽育种和生产中，提高肉品质和产肉量，从而促进畜牧业的健康发展。