2. 华南农业大学动物科学学院 国家生猪种业工程技术研究中心 广东省农业动物基因组学与分子育种重点实验室, 广州 510642
2. Guangdong Provincial Key Lab of Agro-Animal Genomics and Molecular Breeding, National Engineering Research Center for Breeding Swine Industry, College of Animal Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China
在人类基因组的30亿个碱基对中，仅有1.9%的核酸序列用于蛋白质编码，其余均为非编码的RNA(noncoding RNA，ncRNA)[1-3]。ncRNA在生物体内广泛存在，是一类由基因组转录产生但不编码蛋白质的RNA分子，并以RNA结构形式发挥其生物学功能，按照长度分为长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)和小片段编码RNA(包括miRNA和siRNA等)。lncRNA是近年来研究比较多的ncRNA之一，其转录本长度在200 bp~200 kb之间[4]，缺失或仅含有很短的开放阅读框(open reading frame，ORF)[5-7]，不具备编码蛋白质的功能。lncRNA曾一度被认为是转录中的“噪音”，不具有生物学功能[8-9]。近年来的研究表明，lncRNA以RNA的形式发挥结构作用，在表观遗传、转录和转录后调控等层面上调控基因的表达水平[2, 5, 10-13]。然而，最新的研究发现lncRNA可以编码产生小分子多肽，具备编码能力[6, 14]。Anderson等[15]证实，骨骼肌特异表达的lncRNA编码一个包含46个氨基酸的微肽(myoregulin)，生成具有生物功能的小蛋白。然而，并不是所有的lncRNAs都会编码小蛋白，本研究关注的lncRNA-Tubb4b是否具备编码能力仍需进一步的研究。
长链非编码RNA和微管在哺乳动物早期胚胎发育和精子发生过程中起重要的作用[16-19]，前期研究发现lncRNA-Tubb4b与Tubb4b存在靶标关系，可能会影响小鼠雌雄原核迁移过程[18]。本研究将lncRNA-Tubb4b克隆到真核表达载体pcDNA3.1中，在N端添加起始密码子ATG，C端添加3种编码模式的“T”碱基和Flag标签，转染小鼠精原细胞后利用Western blot技术研究lncRNA-Tubb4b是否具备蛋白编码能力。随后，构建lncRNA-Tubb4b过表达载体并合成lncRNA-Tubb4b的siRNA，通过脂质体转染和实时荧光定量PCR等技术初步探讨lncRNA-Tubb4b对微管基因Tubb4b的调节作用。
1 材料与方法 1.1 试验材料本试验所用的阳性对照组细胞为课题组前期制备[20]，而本试验所用的试剂来源如下：细胞总RNA提取试剂盒(DP430)(离心柱型)和Pro-light HRP化学发光检测试剂(PA112-01)购于Tiangen公司，D2110-03 HiPure Gel Pure DNA Micro Kit(凝胶DNA微量回收试剂盒)购于Magen公司，PhantaⓇ Super-Fidelity DNA Polymerase(P505)高保真DNA聚合酶、AceQ Universal SYBRⓇ qPCR Master Mix(Q511)和E.coli-DH5a感受态购于南京诺唯赞公司，T4 DNA Ligase(D2011A)载体连接试剂盒、内切酶EcoR I和BamH I等购于TaKaRa公司，全蛋白提取试剂盒和BCA蛋白含量检测试剂盒购于凯基生物有限公司，细胞刮、羊抗鼠二抗和脱脂奶粉购于佳研生物公司，β-actin(鼠源)一抗和FLAG单克隆抗体(鼠源)购于Millipore公司，细胞培养所用的试剂均购于GIBCO公司，分子克隆所用的其他试剂购于广州鼎国生物技术有限公司，引物合成和载体测序由广州艾基生物公司完成，其中引物序列如表 1所示。
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表 1 载体构建和实时荧光定量PCR引物 Table 1 The primers sequence of vector construction and real-time fluorescent quantitative PCR |
试验中所用的溶液主要成分如下：细胞完全培养液中含有DMEM(Dulbecco’s modified Eagle medium)、体积分数为10%的胎牛血清(FBS，Fetal Bovine Serum)和4 mmol· L-1L-谷氨酰胺；LB液体培养基中含有1 g酵母提取物、2 g蛋白胨、20 g NaCl和200 mL纯净水(LA液体培养基是在LB培养基上添加20 mg氨苄青霉素，LA固体培养基是在LA液体培养基配方上添加1.5 g琼脂粉)；电泳缓冲液中含有3.03 g Tris、18.77 g甘氨酸、1 g SDS和1 000 mL蒸馏水；转移缓冲液中含有5.8 g Tris、2.9 g甘氨酸、0.37 g SDS、200 mL的甲醇和800 mL的蒸馏水。
1.2 试验方法1.2.1 小鼠精原细胞cDNA的合成 首先，提前将4×105个·mL-1的细胞接种到6孔板中，细胞密度达到90%时按照细胞总RNA提取试剂盒的操作指南获得小鼠精原细胞RNA；然后，在200 μL的RNase-free离心管中添加5.0 μL的5×gDNA Eraser Buffer、2.5 μL的gDNA Eraser、2.5 μg的小鼠精原细胞RNA和适量的RNase free dH2O(补至总体系25.0 μL)，42 ℃反应2 min后去除基因组DNA；最后，在上述离心管中添加10.0 μL的5×PrimeScriptBuffer2(for Real Time)、10.0 μL的RT Primer Mix、2.5 μL的PrimeScript RT Enzyme Mix I和2.5 μL的RNase Free dH2O，轻柔混匀后在PCR仪中50 ℃反应15 min、85 ℃反应5 s后置于－20 ℃冰箱中保存备用。
1.2.2 pcDNA3.1(-)-lncRNA-Tubb4b载体的构建 首先，使用Primer 5.0软件设计lncRNA-Tubb4b特异性扩增引物，并在下游引物分别添加0/1/2个碱基“T”后连接flag序列的5′端，以小鼠精原细胞cDNA为模板扩增lncRNA-Tubb4b序列(引物见表 1)，按照95 ℃ 5 min、95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 20 s和72 ℃ 7 min的步骤进行反应，中间3步循环37次后再进行最后一步(以pcw-cas9质粒为模板，用同样的方法扩增3×flag序列)；然后，按照凝胶DNA微量回收试剂盒的操作回收以上片段，并分别以lncRNA-Tubb4b(3组，分别包含0/1/2个碱基“T”)和Flag DNA片段共同作为模板，lncRNA-Tubb4b上游和3×Flag下游为引物，重叠lncRNA-Tubb4b和Flag序列，并回收相关片段；接着，分别使用EcoR I和BamH I同时对pcDNA 3.1(-)和lncRNA-Tubb4b-/T/TT-Flag片段进行酶切后，回收后分别使用T4连接酶在16 ℃下进行过夜连接，体系(10 μL)如下：1 μL 10×T4 DNA Ligase Buffer、75~150 ng DNA片段、25~50 ng载体DNA、1 μL T4 DNA Ligase和若干ddH2O(补至10 μL)。
随后，将连接的载体进行分子克隆，通过转化、涂板和单菌落挑选等步骤获得单克隆菌落，并将其接种于含300 μL LA培养液的2 mL离心管中，在37 ℃摇床(220 r·min-1)中扩大培养3~4 h；接下来，以1 μL的菌液为模板对单克隆菌落进行PCR鉴定，并通过琼脂糖凝胶电泳检测挑选正确的菌落进行测序；最后，利用Blast进行序列比对分析，并将测序正确的重组载体分别进行扩大培养，按照无内毒素质粒DNA小量提取试剂盒的操作提取质粒后同时使用EcoR I和BamH I对3组重组质粒进行酶切，琼脂糖凝胶电泳验证载体构建结果。
1.2.3 重组载体的脂质体转染 首先，提前1 d将小鼠精原细胞按2.5×105个·mL-1的密度接种到6孔板中，细胞密度达到70%~80%时进行转染；然后，按照lipo 3000的操作分别取8个复孔(两组，分别用于RNA和蛋白抽提)转入4.5 μg的pcDNA3.1-EGFP、pcDNA3.1-lncRNA-Tubb4b-Flag、pcDNA 3.1-lncRNA-Tubb4b -T-Flag和pcDNA 3.1-lncRNA-Tubb4b-TT-Flag质粒至小鼠精原细胞中，并置于含5% CO2的37 ℃细胞培养箱中培养；最后，在转染5~6 h后更换2 mL新鲜的完全培养液继续培养，转染48 h后收集细胞进行定量检测和蛋白检测试验，试验重复3次。
1.2.4 实时荧光定量PCR检测 首先，抽提上述脂质体转染后的小鼠精原细胞的RNA，分别合成40 μL的cDNA作为实时荧光定量PCR的模板；然后，以Gapdh基因为内参引物、lncRNA-Tubb4b定量为检测引物(引物序列见表 1)，按照95 ℃ 5 min、95 ℃ 10 s、60 ℃ 10 s、72 ℃ 30 s和72 ℃ 7 min的步骤进行反应，其中95 ℃ 10 s至72 ℃ 30 s这个反应过程需要循环40次；最后，采用△△Ct法比较各细胞中lncRNA-Tubb4b的转染情况(△△Ct=△Ct(试验组)-△Ct(对照组)，相对表达量=2-△△Ct)。
1.2.5 Western blot蛋白检测方法 首先，将上述脂质体转染后的小鼠精原细胞用冷PBS洗两遍后，按照全蛋白提取试剂盒的操作提取各个样品的蛋白液；然后，利用BCA蛋白含量检测试剂盒测定各蛋白样品在562 nm下的吸光值，并计算出相应的蛋白含量(μg)和样品的实际浓度(μg·μL-1)；接着，用SDS上样缓冲液将每组蛋白的浓度用PBS调到1 μg·μL-1后，置于沸水中煮5~10 min使蛋白变性；接下来，分别配制10%的分离胶和4%的浓缩胶，待浓缩胶凝固后，每孔分别加入20 μg处理过的蛋白液，并按照浓缩胶70 V恒压40 min、分离胶90 V恒压2 h进行电泳；电泳完成后，将胶置于滤纸和PVDF膜间在80 V恒压下低温转膜1 h来进行蛋白印迹，并在封闭液中室温封闭1 h；随后，将鼠源的FLAG抗体(1:1 000)用TBST稀释后，4 ℃过夜孵育；隔天，将杂交膜用TBST洗两次后，添加抗鼠的IgG(1:10 000)后室温避光孵育1 h，并用TBST洗两次；最后，根据Pro-light HRP化学发光检测试剂说明书上的操作进行化学发光反应，凝胶成像系统进行成像显影。
1.2.6 lncRNA-Tubb4b过表达和siRNA干扰试验 提前将小鼠精原细胞接种到六孔板中，置于37 ℃饱和度为5% CO2的细胞培养箱中培养；待细胞密度达到70%~80%时，按照上述“脂质体转染”的方法将pcDNA 3.1(-)-EGFP和pcDNA 3.1(-)-lncRNA-Tubb4b过表达载体或每孔50 nmol·L-1的lncRNA-Tubb4b siRNA(GCAGGTGTGCTTCACCAAA)和对照siRNA分别转染小鼠精原细胞。48 h后收集细胞，按照“小鼠精原细胞cDNA的合成”的方法进行反转录，获得模板cDNA。随后，运用实时荧光定量PCR技术检测lncRNA-Tubb4b和Tubb4b基因的表达(引物序列见表 1)。
1.2.7 统计分析 所有试验均重复3次以上，统计数据用“平均值±标准误(S.E.)”表示，应用SPSS 17.0对试验数据进行单因素方差分析，当P＞0.05时，差异不显著；当0.01＜P ≤ 0.05时，差异显著；当0.001＜P ≤ 0.01时，差异极显著；当P ≤ 0.001时，数据在0.001水平上具备极显著性差异。
2 结果 2.1 lncRNA-Tubb4b的编码能力预测与验证载体构建通过ORF Finder软件预测lncRNA潜在的ORF发现，lncRNA-Tubb4b有5个ORF(图 1A)，可能编码微肽。为了研究lncRNA-Tubb4b是否具备蛋白编码能力，在其前面添加ATG序列，后面加入Flag标签；并以添加0、1和2个“T”尾的方式，把lncRNA-Tubb4b潜在的编码情况都罗列出来(图 1B)。通过PCR克隆把723 bp的lncRNA-Tubb4b片段和90 bp左右的Flag片段分别扩增后拼接成3段810 bp左右的lncRNA-Tubb4b-Flag片段(图 1C和1D)。随后，将获得的片段连接到pcDNA3.1(-)载体中，并通过EcoR I和BamH I双酶切(图 1E)和测序验证载体构建成功。
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A.网站预测的lncRNA-Tubb4b潜在的ORF；B. lncRNA-Flag存在的3种编码模式；C. Flag、T-Flag、TT-Flag和lncRNA-Tubb4b(对应图中的标记1、2、3和4)的片段扩增；D. Flag、T-Flag和TT-Flag片段分别与lncRNA-Tubb4b片段融合(对应图中的标记1、2和3)的结果；E. pcDNA 3.1(-)-lncRNA-Tubb4b-0/T/TT-Flag载体(对应图中的标记1、2和3)双酶切验证结果(EcoR I和BamH I) A. Predicted potential ORF of lncRNA-Tubb4b; B.3 coding modes of lncRNA-Flag; C. The fragment amplification of Flag, T-Flag, TT-Flag and lncRNA-Tubb4b (corresponding to the labels of 1, 2, 3 and 4); D. The lncRNA-Tubb4b fragments was fused with the fragments of Flag, T-Flag and TT-Flag, respectively (corresponding to the labels of 1, 2 and 3); E. The double enzyme digestion (EcoR I and BamH I) results of pcDNA 3.1(-)-lncRNA-Tubb4b-0/T/TT-Flag vector (corresponding to the labels of 1, 2 and 3) 图 1 pcDNA 3.1(-)-lncRNA-Tubb4b编码蛋白验证载体构建 Fig. 1 Construction of pcDNA 3.1(-)-lncRNA-Tubb4b vector |
将验证后的pcDNA3.1(-)-lncRNA-Tubb4b-0/T/TT-Flag载体和pcDNA3.1(-)载体分别转染小鼠精原细胞，通过实时荧光定量PCR检测发现, 转染pcDNA3.1(-)-lncRNA-Tubb4b-0/T/TT-Flag的小鼠精原细胞中高表达lncRNA-Tubb4b片段(图 2A)。接着，以稳定表达Flag-Cas9的小鼠精原细胞蛋白为阳性对照，通过Western blot检测发现3种潜在编码情况的lncRNA-Tubb4b-Flag均不表达FLAG蛋白(图 2B)，而作为内参的β-actin蛋白在各个细胞中表达水平是相当的(图 2C)。由此可见，lncRNA-Tubb4b不具备蛋白编码的能力。
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A.转染pcDNA 3.1(-)-lncRNA-Tubb4b-0/T/TT-Flag的lncRNA-Tubb4b定量检测结果；B.FLAG蛋白的Western blot鉴定；C.β-actin内参蛋白的Western blot鉴定。1、2、3和4分别代表转染Flag-Cas9、lncRNA-Tubb4b-Flag、lncRNA-Tubb4b-T-Flag和lncRNA-Tubb4b-TT-Flag的小鼠精原细胞的蛋白样品 A. Quantitative results of lncRNA-Tubb4b transfected with pcDNA 3.1(-)-lncRNA-Tubb4b-0/T/TT-Flag; B. Western blot identification of FLAG; C. Western blot identification of β-actin. The number of 1, 2, 3 and 4 in figure B and C represent the protein of mouse spermatogonia transfected with Flag-Cas9, lncRNA-Tubb4b-Flag, lncRNA-Tubb4b-T-Flag and lncRNA-Tubb4b-TT-Flag, respectively 图 2 lncRNA-Tubb4b蛋白编码能力验证 Fig. 2 The verification of lncRNA-Tubb4b protein coding ability |
以转染pcDNA 3.1(-)-EGFP载体(NC)为对照，在小鼠精原细胞中过表达lncRNA-Tubb4b后发现，对照组的小鼠精原细胞表达荧光蛋白(图 3A、B和C)，表明载体成功转入到目标细胞中，瞬时转染结果有效。通过荧光定量PCR检测发现，相对于对照组，试验组成功过表达lncRNA-Tubb4b(图 3D)。而且，过表达lncRNA-Tubb4b后极显著(P＜0.01)降低小鼠精原细胞中Tubb4b基因的表达(图 3D)。由此可见，lncRNA-Tubb4b对Tubb4b基因存在调控作用。
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A.转染pcDNA 3.1(-)-EGFP的小鼠精原细胞的荧光图片(400×)；B.转染pcDNA 3.1(-)-EGFP的小鼠精原细胞的白光图片(400×)；C.A和B的Merge(400×)；D.过表达lncRNA-Tubb4b的定量分析。*.P < 0.05，**.P < 0.01，***.P < 0.001，下同 A. Fluorescence of mouse spermatogonia transfected with pcDNA 3.1(-)-EGFP (400×); B. White light of mouse spermatogonia transfected with pcDNA 3.1(-)-EGFP (400×); C. Merge of A and B (400×); D. Quantitative analysis of overexpression of lncRNA-Tubb4b. *. P < 0.05, **. P < 0.01, ***. P < 0.001, the same as below 图 3 qRT-PCR检测过表达lncRNA-Tubb4b对Tubb4b的作用 Fig. 3 qRT-PCR detecting the expression of Tubb4b after overexpressing the lncRNA-Tubb4b |
为了进一步研究lncRNA-Tubb4b对Tubb4b的影响，以转染Mock(NC)为对照，在小鼠精原细胞中转染干扰RNA(lncRNA-Tubb4b siRNA)来降低lncRNA-Tubb4b的表达后发现(P＜0.05，图 4A)，会极显著地增高Tubb4b基因的表达(P＜0.01，图 4B)，这也暗示lncRNA-Tubb4b对Tubb4b基因存在调控作用。
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A.lncRNA-Tubb4b的定量结果；B.Tubb4b的定量结果 A. Quantitative results of lncRNA-Tubb4b; B. Quantitative results of Tubb4b 图 4 qRT-PCR检测干扰lncRNA-Tubb4b对Tubb4b的作用 Fig. 4 qRT-PCR detecting of the expression of Tubb4b after interfering lncRNA-Tubb4b |
人类基因组约98%的转录本为缺乏蛋白质编码功能的ncRNA，lncRNA属于ncRNA，主要参与机体重要生命活动(干细胞维持、细胞增殖和分化等)的调控[1-3, 21-23]。自1990年Brannan等[24]在研究小鼠肝发育过程中发现不编码蛋白质H19的印迹基因后，开始了对lncRNA的研究。在之后的研究中，大多数的学者都是偏向于研究不具备编码蛋白的lncRNA，发现其以RNA结构形式发挥生物学功能。然而，近年来的研究指出，部分与mRNA结构相似存在ORF的lncRNA能够编码小于100个氨基酸的功能性多肽，并以微蛋白的形式在动物机体中发挥功能[6, 25-28]。
Anderson等[15]在研究人类和斑马鱼lncRNAs时利用核糖体作图(ribosome profiling)鉴别出数百个ORF，发现其可能生成功能性的小蛋白肽。Cai等[29]通过软件预测lncRNA-Six1存在7个低编码潜能和低保守性的ORF，其中ORF-2会产生7.26 ku的微肽来激活Six1基因，从而促进细胞增殖和肌肉生长。本研究通过ORF Finder软件预测到lncRNA- Tubb4b潜在5个ORF(图 1 A)，并采用与Wang等[30]检测lnc-DC编码能力一样的方法，将lnc- RNA-Tubb4b三种潜在的编码情况设计出来：在lncRNA-Tubb4b的N-末端起始密码子ATG，C-末端分别添加0、1和2个碱基“T”后与Flag标签融合，并克隆到pcDNA3.1真核表达载体中，转染细胞来检测蛋白表达。要是lncRNA-Tubb4b存在蛋白编码能力，在这3种情况下肯定有一种存在FLAG蛋白表达；要是lncRNA-Tubb4b不编码蛋白，那这3种情况下均检测不到FLAG蛋白的表达。
在lncRNA蛋白编码能力的研究中，Lauressergues等[31]在研究前体转录物初级微小RNAs(pri-miRs)时发现，pri-miRNA包含编码调节肽的短开放阅读框序列。紫花苜蓿的pri-miR171b和拟南芥的pri-miR165a可以编码分别产生miPEP171b和miPEP165a的微肽，在影响miR171b和miR165a的积累而导致侧根发育减少和主根生长刺激，最终调节根的发育[31]。本研究将潜在编码的pcDNA 3.1(-)-lncRNA-Tubb4b质粒分别转染小鼠精原细胞后发现，这3种情况下的lnc-RNA-Tubb4b均没有FLAG蛋白的表达，表明lnc- RNA-Tubb4b不具有编码蛋白的能力，不是以微肽的形式发挥作用的。由此可见，小鼠精原细胞中不存在lncRNA-Tubb4b预测的5个ORF，不编码相应的微肽，说明lncRNA-Tubb4b主要以非编码的形式发挥作用的。
不编码蛋白的lncRNA可以在表观遗传、转录及转录后水平上调控基因表达[2-3, 5, 10, 32-33]，主要参与X染色体沉默[34]、基因组印记[35]以及染色质修饰[5, 36]、转录激活等多种重要的调控过程[37-39]，并与人类疾病的发生、发展和防治等都有着密切联系[3, 5, 14, 40]。微管蛋白在早期胚胎和精子发生过程中起到重要的作用[16, 18-19]，前期研究也发现lncRNA-Tubb4b在小鼠早期胚胎和小鼠精原细胞中表达[18]。本研究发现lncRNA-Tubb4b可以调控Tubb4b的表达，降低lncRNA-Tubb4b时会升高Tubb4b的表达，升高lncRNA-Tubb4b时会降低Tubb4b的表达。可见，在小鼠精原细胞过表达和干扰lncRNA-Tubb4b的表达后对Tubb4b存在显著的负调控作用(图 3和图 4)，拓宽了lncRNA-Tubb4b的作用范围，为研究lncRNA-Tubb4b对微管的调控乃至胚胎发育和精子发生过程奠定基础。
4 结论在lncRNA-Tubb4b序列上添加起始密码子ATG、0/1/2个的T尾和Flag标记的情况下均没有检测出FLAG蛋白，表明lncRNA-Tubb4b不具备蛋白质编码能力；而且，在小鼠精原细胞中过表达或干扰lncRNA-Tubb4b的表达时会极显著地降低或升高Tubb4b基因的表达，表明lncRNA-Tubb4b能影响Tubb4b基因的转录。
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(编辑 郭云雁)