2. Pirbright研究所, Pirbright GU24 0 NF
2. Pirbright Institute, Pirbright GU24 0 NF, UK
口蹄疫病毒(FMDV)属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属，主要感染牛、羊、猪等偶蹄动物。在成年动物中，FMDV感染上皮组织[1-2]，引起口腔、蹄部和乳房上皮发生水疱性疹，而在胎儿和幼畜中，FMDV还可感染心肌和骨骼肌等非上皮组织[3-6]，引起心肌炎进而导致幼畜死亡[7-8]。目前对FMDV随着易感动物的发育而改变组织嗜性的分子机制仍不清楚。整联蛋白(integrin)是一类由α和β亚基以共价结合而形成的膜蛋白家族, 在已经发现的24种整联蛋白中，FMDV野毒株可利用其中的αvβ1、αvβ3、αvβ6和αvβ8等4种整联蛋白作为受体侵入细胞[9-14]。利用共聚焦显微镜和实时逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)对牛组织αvβ6的表达分布与感染位点的分析发现，在牛舌、蹄叉间等上皮组织FMDV仅在αvβ6阳性的上皮细胞中复制，引起水疱性病变，表明整联蛋白在病毒感染的组织嗜性中发挥着关键作用[15]。研究易感动物不同发育阶段中整联蛋白αvβ1、αvβ3、αvβ6和αvβ8的细胞组织表达变化，将有助于了解FMDV随着易感动物的发育而改变组织嗜性变化的分子机制。目前，对FMDV受体整联蛋白在易感动物不同发育阶段中的组织表达变化还没有相关的研究报道。因此，本研究利用RT-qPCR技术，对45、75和110 d绵羊胎儿、新生羔羊和成年母绵羊组织中整联蛋白亚单位αv、β3、β6和β8 mRNA的表达水平进行定量检测，首次获得相关整联蛋白mRNA在绵羊不同发育阶段组织中分布的定量数据，探讨了相关整联蛋白在绵羊胎儿、新生羔羊和成年绵羊组织中的变化与FMD发病机制的相关性。
1 材料与方法 1.1 试验材料组织样品：心、骨骼肌、蹄冠、舌上皮、软腭和扁桃体等样品来自课题组之前已报道的绵羊试验[2-4], 其中包括新生羔羊8只和妊娠绵羊24只(妊娠45 d母羊6只，胎儿11个; 妊娠75 d母羊12只，胎儿20个和妊娠110 d母羊6只，胎儿7个)，通过蹄冠皮内接种途径感染怀孕母羊和新生羔羊，每只动物接种0.5 mL的FMDV O UKG 34/2001病毒培养液(105.9TCID50·只-1)。分别在感染后第0、2、4、7、17、18天，各宰杀2只动物，采集以下组织样品：蹄冠、颈淋巴结、肠、心、肾、肝、肺、下颌淋巴结、骨骼肌、皮肤、脾、舌上皮、软腭和扁桃体等组织样品。采集的组织样品置于RNAlater (英国Ambion)，-20 ℃保存备用。对所采集的组织样品，经FMDV Real-time RT-PCR方法检测[16]，分为FMDV RNA阳性样品(感染样品组)和FMDV RNA阴性样品(非感染样品组)。在FMDV感染绵羊的组织样品中，110 d的胎儿组织样品均为FMDV RNA阴性，而FMDV感染的45和75 d的胎儿和新生羔羊的心、骨骼肌、蹄冠、舌上皮、软腭、扁桃体中的FMDV RNA含量最高。而感染母羊的软腭、扁桃体、蹄冠中的病毒RNA含量最高。相关详细的绵羊试验和检测结果见Ryan等的报道[3-5]。
1.2 试验方法1.2.1 Real-time RT-PCR方法 按Ryan等[3]报道的方法提取组织RNA。绵羊整联蛋白亚单位αv、β3、β6和β8以及3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的探针和引物由Pirbright研究所King博士提供，其引物是针对猪、牛和羊αv、β3、β6和β8整联蛋白亚单位的保守区域并跨越预测的内含子/外显子连接而设计的[17]。在定量检测时，使用标准RNA曲线量化每个整联蛋白mRNA拷贝数[17]。通过用含有猪整联蛋白cDNA克隆片段的质粒为模板(pGEM-T Easy，Promega，UK)进行体外转录(Megascript，英国Ambion)获得相应整联蛋白RNA标准品，并用分光光度计(NanoDrop ND-1000，NanoDrop Technologies，UK)定量[17]。按Quan等[16]建立的FMDV Real-time RT-PCR方法检测组织中的病毒RNA载量。
1.2.2 数据统计分析 为了确定在分析绵羊不同发育阶段组织中整联蛋白转录水平时，是否能将感染组织样品组的数据包含在未感染组织样品组的数据中，进行方差分析(ANOVA)以评估每个发育阶段中感染状态与组织整合素之间相关作用的显著性。ANOVA检验的无效假设是感染状态和每个组织整合素亚单位mRNA水平之间的关系没有差异，方差分析中不包括零值，而且将整合素mRNA水平以GAPDH mRNA的表达为对照进行标准化。数据的统计分析是在雷丁大学统计服务中心帮助下使用Mintab版本14(Minitab Ltd，英国)进行。P < 0.05表明感染样品组和未感染样品组的P值有统计学意义。如果FMDV RNA阳性样品(感染样品组)和FMDV RNA阴性样品(非感染样品组)之间未观察到显著差异，则将两组数据一起纳入定量分析。
2 结果 2.1 FMDV感染不会导致组织中整联蛋白转录水平上调由于组织样品采自FMDV感染试验使用的绵羊[2-4]，首先分析FMDV感染是否会影响每个发育阶段αv、β3、β6和β8转录表达。为此，根据RT-PCR分析结果[3-5]，将样品分成FMDV RNA阳性样品(感染样品组)和FMDV RNA阴性样品(非感染样品组)两组。在45 d胎儿的被检组织中FMDV RNA阳性样品71份和FMDV RNA阴性样品21份，在75 d胎儿的被检组织中FMDV RNA阳性样品98份和FMDV RNA阴性样品140份；在羔羊的被检组织中FMDV RNA阳性样品112份和FMDV RNA阴性样品28份；在成年母羊的被检组织中FMDV RNA阳性样品30份和FMDV RNA阴性样品10份[3-5]。110 d的胎儿组织样品均为FMDV RNA阴性。利用Real-time RT-PCR方法分别对感染样品组和非感染样品组中αv、β3、β6和β8转录表达进行定量检测，结果见表 1。在大多数情况下，感染样品组(FMDV RNA阳性样品)中的整合素水平略低。对感染和非感染样品组之间的αv、β3、β6和β8 mRNA表达水平进而对感染和非感染样品组之间的αv、β3、β6和β8 mRNA表达水平进行方差分析发现，在感染样品组和非感染样品组之间，45 d胎儿αv、β3、β6和β8的P值分别为0.794、0.697、0.395、0.302；75 d胎儿的分别为0.994、0.367、0.011、0.942；羔羊的分别为0.971、0.912、0.126、0.985；母羊的分别为0.491、0.100、0.089、0.791。结果表明，在每个发育阶段的感染和非感染样品组之间αv、β3、β6和β8的转录表达差异不显著(P>0.05)，除了75 d的感染和非感染样品组的胎儿之间的β6 mRNA表达差异明显(P < 0.05)。同时，还发现整联蛋白亚单位mRNA表达水平与感染时间之间无相关性。这些数据表明FMDV感染不会导致胎儿、新生羔羊和母羊中αv、β3、β6和β8的转录水平上调。因此，在分析绵羊不同发育阶段组织中整联蛋白水平时，除了75 d胎儿的感染样品组β6 mRNA数据不用外，在计算和比较各发育阶段组织中βv、β3、β6和β8平均值时，不再对感染样品组和非感染样品组进行单独分析。
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表 1 感染样品组与非感染样品组整联蛋白亚单位mRNA平均水平(x ±s) Table 1 Average levels of integrin subunit mRNA in infected and non-infected tissues(x ±s) |
以前的研究表明FMDV感染的45和75 d的胎儿和新生羔羊的心、骨骼肌、蹄冠、舌上皮、软腭、扁桃体中的FMDV RNA含量最高，而感染母羊的软腭、扁桃体、蹄冠中的病毒RNA含量最高，是FMDV主要的感染组织位点[3-5]。因此，本研究集中分析心、骨骼肌、蹄冠、舌上皮、软腭、扁桃体组织在不同发育阶段中的整联蛋白转录水平。如图 1和表 2所示，在被检组织中整联蛋白水平随发育阶段变化而不同，αv mRNA在45 d胎儿心肌组织、75 d胎儿、110 d胎儿以及羔羊的蹄冠上皮组织和成年母羊扁桃体组织中的表达水平最高；β3 mRNA在45 d胎儿心肌组织、75 d胎儿骨骼肌组织、110 d胎儿舌上皮组织、羔羊和成年母羊扁桃体组织中的表达水平最高；β6 mRNA在45 d胎儿软腭组织、75 d扁桃体组织、110 d胎儿舌上皮组织、羔羊和成年母羊软腭组织的表达水平最高；β8 mRNA在45 d胎儿心肌组织、75 d蹄冠上皮组织、110 d胎儿舌上皮组织、羔羊扁桃体组织和成年母羊蹄冠上皮组织的表达水平最高。
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整联蛋白亚单位mRNA水平以每毫克组织中的mRNA拷贝数计(取常用对数) Integrin subunit mRNA levels were expressed as the common logarithm of mRNA copy number per milligram of tissue 图 1 妊娠45、75和110 d的胎儿、成年母羊和新生羔羊的蹄冠、心、骨骼肌、软腭、舌头和扁桃体样本中整联蛋白亚单位mRNA水平 Fig. 1 Integrin subunit mRNA levels in coronary band, heart, muscle, soft palate, tongue and tonsil samples from foetuses at day 45, 75 and 110 of gestation, adult ewes and neonatal lambs |
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表 2 绵羊胎儿、新生羔羊和成年母羊组织中整联蛋白亚单位mRNA平均水平范围(x ±s) Table 2 The range of average integrin subunit mRNA levels in tissues from fetuses, neonatal lambs and adult ewes(x±s) |
目前认为在FMDV上皮组织嗜性中发挥重要作用的整联蛋白是αvβ6。比较分析发现，成年母羊、羔羊和胎儿的蹄冠和舌上皮组织中都有较高β6 mRNA水平表达，每毫克蹄冠上皮和舌上皮组织的β6 mRNA分别在102.1~104.5拷贝和102.7~105.0拷贝之间，其间差异不显著(图 1)；与其对应的成年母羊、羔羊和胎儿上皮组织之间的平均最高FMDV RNA载量无显著差异，每毫克蹄冠和舌上皮组织中病毒RNA含量分别在109.9~106.6拷贝和108.8~105.2拷贝之间。有关病毒载量检测见前期发表的论文[3-5]。β6 mRNA在绵羊各发育阶段的上皮组织中均有较高水平表达，与FMDV可感染绵羊不同发育阶段上皮组织的特性相符合，进一步表明，上皮细胞特异性表达的αvβ6在FMDV侵染上皮组织中发挥关键作用。
在胎儿和新生羔羊中FMDV还能感染心、骨骼肌组织。对心组织中β6 mRNA水平的比较分析发现，45和75 d胎儿中几乎检测不到的β6 mRNA表达(分别为100.3和100.2拷贝·mg-1)(图 1)，表明FMDV感染胎儿心组织可能不是由αvβ6介导的。进一步分析发现，45、75 d胎儿和羔羊心组织中的β3 mRNA较高(分别为104.7、104.6和103.5拷贝·mg-1)，而成年母羊心组织中的含量最低(为102.8拷贝·mg-1)(图 1)；与其对应的45、75 d胎儿、羔羊和成年母羊组织中的平均最高FMDV RNA载量变化基本一致(分别为105.9、107.4、105.75和102.8拷贝·mg-1)，同时，不同发育阶段心组织都有较高β8 mRNA水平表达，其间差异不显著，表明αvβ3可能在FMDV心肌组织嗜性中发挥作用。在肌肉组织中，75 d胎儿和羔羊的β3和β8 mRNA较高(β3 mRNA分别为104.7和103.3拷贝·mg-1; β8 mRNA分别为103.9和103.5拷贝·mg-1)，而成年母羊中的含量最低(β3 mRNA为102.6拷贝·mg-1; β8 mRNA为101.5拷贝·mg-1)，与其对应的75 d胎儿、羔羊和成年母羊组织中的最高FMDV RNA平均载量变化基本一致(分别为108.6、105.6和104.8拷贝·mg-1)，表明αvβ3或αvβ8可能在FMDV心肌组织嗜性中发挥作用。
3 讨论FMDV具有较严格的组织嗜性，在成年动物主要感染上皮组织[1]，但在胎儿和幼畜中还可感染心肌和骨骼肌等非上皮组织[7-8]。病毒组织嗜性与病毒受体密切相关。整联蛋白由α和β亚基结合形成的异源二聚体, 包括由18种不同的α亚基和8种β亚基形成的24种αβ复合物，已发现FMDV野毒株可利用αvβ1、αvβ3、αvβ6和αvβ8等4种整联蛋白作为受体侵入细胞[18], 对FMDV受体整联蛋白的研究基本是在体外细胞模型上展开的，尚不明确各种整联蛋白受体与FMDV感染的组织嗜性有何相关性。αvβ6是上皮细胞特异性表达的整联蛋白，对牛舌、蹄等上皮组织αvβ6的表达分布与FMDV感染位点相关性的分析发现，FMDV感染位点均为αvβ6阳性上皮细胞，证实αvβ6在FMDV的上皮组织嗜性发挥着关键作用[15]。本试验显示，整联蛋白水平随发育阶段变化而不同，在成年绵羊和羔羊的蹄冠上皮组织和舌上皮组织中，β6 mRNA水平略低于胎儿的，但仍然有较高的表达水平，而且其间差异不大。因此，在绵羊不同发育阶段上皮组织中β6 mRNA均有较高水平的表达，与FMDV可感染绵羊不同发育阶段上皮组织的特性相符合，在成年母羊、羔羊和胎儿的上皮组织中都有较高水平的FMDV RNA的载量[3-5]，进一步提示，上皮细胞特异性表达的αvβ6在体内的FMDV上皮组织嗜性中发挥重要作用。在胎儿和新生羔羊中FMDV除了感染蹄冠、舌等上皮组织，还感染心、骨骼肌组织[3-6]，引起心肌炎进而导致幼畜死亡，表现出与在成年绵羊中的不同嗜性特征。前期研究利用PCR和ISH技术，在胎儿和新生羔羊的心组织和骨骼肌细胞中检测到高水平的FMDV RNA含量[3]，但FMDV利用哪种整联蛋白作为受体侵入心和骨骼肌细胞仍不清楚。本试验显示，45和75 d胎儿心组织中几乎检测不到β6 mRNA的表达，而胎儿和羔羊心脏组织中却有较高水平β3 mRNA表达，并显著高于成年母羊心组织中的，与其对应的儿和羔羊组织中的FMDV RNA载量也显著高于成年母羊的。同时，不同发育阶段心组织都有较高β8 mRNA水平表达，其间差异不显著，这些结果提示，在FMDV心组织嗜性发挥关键作用的整联蛋白，可能不是上皮细胞特异性表达的αvβ6，而是αvβ3决定FMDV对胎儿心肌的组织嗜性。骨骼肌组织中β3和β8 mRNA的表达水平，75 d胎儿和羔羊的最高，成年母羊的最低，与其对应的胎儿、羔羊FMDV RNA平均载量明显高于成年母羊的，两者变化基本一致，胎儿骨骼肌细胞对FMDV非常敏感，其次是羔羊骨骼肌细胞，而成年绵羊骨骼肌细胞对FMDV不敏感。因此，本试验发现的不同发育阶段肌肉组织中β3或β8位mRNA的水平变化与FMDV肌肉组织嗜性随发育阶段变化而改变相吻合[3-5]，提示αvβ3或αvβ8可能在FMDV心肌组织嗜性中发挥作用。
本研究是通过实时定量RT-PCR进行定量测定整联蛋白亚单位mRNA水平的，没有分析蛋白质的表达水平。根据Brown等[19]利用RT-PCR和免疫细胞化学检测成年绵羊组织中的αvβ6水平的结果，发现组织中β6 mRNA的表达与αvβ6免疫细胞化学阳性染色的结果相匹配。Monaghan等[15]通过比较β3和β6 mRNA实时qRT-PCR Ct值发现，在β6 mRNA水平高于β3 mRNA水平的组织部位，免疫荧光显示αvβ6染色阳性。相反，在β3和β6 mRNA水平同样低的部位(如腹侧软腭和背侧软腭)，免疫荧光检测到很少或没有整联蛋白。因此mRNA水平与蛋白质表达是相关的。尽管有报道称αvβ6在人体皮肤的伤口愈合和炎症过程中表达上调[20]，但本研究表明MDV感染不影响在绵羊每个发育阶段组织中αv、β3、β6和β8的转录表达。Monaghan等[15]在牛蹄间皮肤口蹄疫病变边缘也未观察到明显的αvβ6或αvβ3的变化。
4 结论利用qRT-PCR技术对绵羊胎儿、新生羔羊和成年绵羊组织中整联蛋白亚单位αv、β3、β6和β8 mRNA的表达水平进行了定量检测，首次获得这些整联蛋白mRNA在绵羊体内分布的定量数据，将有助于更好地了解整联蛋白在FMDV感染组织嗜性中可能起作用的相互作用机制。
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编辑 白永平