2. 国家民族事务委员会青藏高原动物疫病防控创新团队, 成都 610041;
3. 四川省甘孜藏族自治州畜牧业科学研究所, 康定 626000;
4. 四川省甘孜藏族自治州动物疫病预防控制中心, 康定 626000
2. The Animal Disease Prevention and Control Innovation Team in Qinghai-Tibet Plateau of State Ethnic Affairs Commission, Chengdu 610041, China;
3. Animal Husbandry Science Institute of Ganzi Tibetan Autonomous Prefecture, Sichuan Province, Kangding 626000, China;
4. Center for Animal Disease Control and Prevention, Ganzi Tibetan Autonomous Prefecture, Sichuan Province, Kangding 626000, China
戊型肝炎(hepatitis E，HE)是由戊型肝炎病毒(hepatitis E Virus，HEV)引起的一种人和多种动物患病的人兽共患病，一般经粪口途径传播。人HE在发展中国家和地区发病率达80%以上，致死率为1%左右，怀孕期为6~8月的孕妇死亡率可达20%[1]。目前在我国HE仍以散发形式流行[2]。过去认为HE流行地区主要分布在发展中国家[3-4]，但是近年来在美国、法国、新西兰、澳大利亚等发达国家亦有散发病例报道[5-6]。人们在猪、羊、老鼠等动物中相继检测到戊肝病毒[7-9]。
HEV是一种正链单股RNA病毒，属于肝炎病毒科正嗜肝病毒属[10]。编码区由3个部分重叠的开放式阅读框(ORF1、ORF2和ORF3)组成。由于该病毒能感染多种动物宿主，跨物种感染很常见，因此HEV的基因组表现出显著的多样性。基于这种序列多样性，被分为至少8种基因型(1-8)[11-13]。1型和2型HEV仅感染人类，在发展中国家，由于饮用污染的饮用水而呈地方性流行[14-15]，基因型3和4主要感染人和各种动物，5型和6型主要感野猪，新发现的7型流行病学分布还不明确，而8型是2016年在我国双峰骆驼中发现的另一种新的基因型[11]；这些类型的HEV可通过人畜共患病传播，在世界范围内引起感染[16]。在我国，基因4型HEV(HEV-4)是主要流行基因型，参与人畜共患传播[17]，目前已在人和动物中鉴定出9种HEV-4的亚型(HEV-4a至HEV-4i)[18]。猪戊型肝炎可感染人及猪、黑猩猩等多种动物，猪作为仅能感染G3和G4的感染模型，通常表现为隐性，可引起人的高病死率，为一种重要的人兽共患传染病，因此推测猪源HEV可能是引起人感染戊型肝炎的重要源头，所以对其流行及传播进行监测具有重要意义。
藏猪是我国唯一生活在青藏高原东南部重要的地方特色猪种，生活在海拔3 000 m以上的高山或河谷地区[19]，具有适应高海拔恶劣气候环境和抗病等特点。藏猪养殖以放牧为主，养殖环境卫生条件较差，能与人以及其他动物紧密接触，共用水源或食物，这种养殖模式有利于HEV的流行，也有利于其跨宿主传播。为了调查四川地区藏猪戊型肝炎病毒的流行情况和遗传演化，本研究对2018—2020年采集自四川省甘孜藏族自治州和阿坝藏族自治州的22个藏猪场332份藏猪粪便样本进行HEV检测，并对其进行基因分型后，从每年的毒株中挑出1株典型株进行全基因组扩增以及遗传进化分析。
1 材料与方法 1.1 主要试剂KOD OneTM PCR Master Mix Blue和Quick Taq HS DyeMix购自东洋纺(上海)生物科技有限公司；Trizol总RNA提取试剂、反转录试剂盒和DL2000 DNA Marker购自TaKaRa生物技术有限公司；凝胶成像仪购自上海天能科技有限公司；TGL-16冷冻离心机购自四川蜀科仪器有限公司；PCR仪购自杭州博日科技有限公司。
1.2 病料的采集与处理病料为2018—2020年采集自四川省甘孜藏族自治州和阿坝藏族自治州的22个藏猪场332份藏猪粪便样本，其中健康样本105份，腹泻样本227份，样本于-80 ℃保存。按1∶5加入PBS震荡混匀，反复冻融3次后，10 000 r·min-1离心5 min，取上清液冻存于-80 ℃备用。
1.3 引物的设计与合成参考文献[20]报道HEV的通用检测引物为套式PCR引物，扩增产物大小为644 bp，参考文献[21]发表的HEV全基因扩增的引物序列(表 1)对3份阳性毒株进行全基因组的扩增，引物由北京擎科新业生物有限公司合成。
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表 1 HEV全基因扩增引物信息 Table 1 Information of HEV whole gene amplification primers |
用Trizol法抽提样本中总RNA。按照反转录试剂盒说明书制备cDNA。反应体系：总RNA 4 μL，5×Buffer 2 μL，oligo (dT) 0.5 μL，反转录酶0.5 μL，RNase-Free Water 3 μL；反转录程序：37 ℃ 15 min，85 ℃ 15 s，16 ℃保存。将反转录获得的cDNA放置-20 ℃保存备用。
1.5 藏猪腹泻样本中HEV阳性率的调查以步骤1.3中合成的HEV检测引物对cDNA样本进行PCR检测，PCR反应体系：Quick Taq HS DyeMix 5 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 3 μL。反应程序：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循环35次，72 ℃延伸8 min，16 ℃保存。
1.6 HEV阳性样本基因分型用DNAStar等分子生物学软件，将阳性样本扩增出的ORF2片段进行拼接，将拼接结果分别与GenBank不同血清型HEV毒株的ORF2进行序列比对，借助线上工具iTOL(http://itol.embl.de/)绘制圆形进化树，分析其遗传进化关系，最终确定所有阳性样本的基因型。
1.7 HEV分歧时间估算以贝叶斯进化分析软件(BEAST v1.8.0)的BEAUti程序设置序列的采样时间、氨基酸置换模型、分子钟模型、马尔科夫链长和先验参数。以BEAST程序运算，通过MCMC方法进行树的重复抽样，获得具有最大后验概率的进化树。通过TreeAnnotator程序设置Burnin值。以FigTree v1.4.4软件对进化树进行修饰和分歧时间的标定，分析病毒序列的演化过程。
1.8 HEV全基因组序列的扩增用RT-PCR法对3株典型HEV毒株阳性样本全基因进行分段扩增，KOD OneTM PCR Master Mix Blue 12.5 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反应条件：98 ℃ 10 s、62.4 ℃/63.1 ℃/59.4 ℃/61.7 ℃/65 ℃/53.7 ℃ 5 s、68 ℃ 10 s，循环35次。PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。根据凝胶回收试剂盒说明书进行回收纯化，按照pMDT19-T Vector Cloning Kit说明书进行连接，并转化DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆送北京擎科新业生物有限公司进行测序。
1.9 HEV重组分析为了分析不同来源的HEV毒株之间的遗传关系和重组关系，以RDP4软件的Chimaera、MaxChi、RDP、GENECONV、SiScan和3Seq方法对3株扩增全基因组毒株进行重组分析，利用SimPlot程序对每个簇分别进行相似性分析，对重组区和非重组区构建独立的进化树以验证重组。
2 结果 2.1 藏猪HEV的检出率利用HEV检测引物[20]，以RT-PCR方法对22个规模化猪场的332份粪便样本进行检测。结果显示：在粪便样本中，HEV核酸阳性率为20.48%(68/332，95%CI=16.3%~25.2%)；22个规模藏猪场中，HEV猪场阳性率为77.27%(17/22, 95%CI=54.6%~92.2%)，健康样本阳性率为2.86%(3/105，95%CI=0.6%~8.1%))，腹泻样本阳性率为28.63%(65/227，95%CI=22.8%~35.0%)，结果表明, HEV在四川藏猪中存在且流行。68个阳性样本中，65份阳性来自腹泻样本，3份来自健康样本，表明HEV可能与腹泻有关，有待进一步研究。
2.2 藏猪HEV阳性样本ORF2片段分析及分歧时间计算通过MEGA对本研究中的68条测序藏猪源HEV序列与23条分型参考序列进行ORF2片段比对，并通过线上工具iTOL(http://itol.embl.de/)绘制圆形进化树(图 1)。结果显示，68个序列彼此之间核苷酸序列相似性为69.6%~100.0%，与之前报道的1~4型HEV分离株核苷酸序列相似性为75.1%~90.2%，与4型HEV的相似性最高(82.5%~90.2%)。根据目前的亚型分型标准，系统进化分析显示, 68株阳性样本均为G4型，其中4a型HEV毒株在四川地区藏猪HEV传播中占有明显优势。
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 .4a型； .4b型；●.4 d型；★.4j型；◆.G4型
. 4a type; 4b type; ●. 4 d type; ★.4j type; ◆. G4 type
图 1 阳性毒株ORF2遗传进化树
Fig. 1
Genetic evolutionary tree of ORF2 of positive strains
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为进一步研究HEV的进化过程，通过BEAST v1.8.0软件对87条(其中包括本研究中分别从22个猪场各挑选1株典型毒株的ORF2部分片段)确定采样时间的HEV ORF2部分片段进行分歧时间的估算。采用贝叶斯马尔可夫链－蒙特卡罗(MCMC)算法进行分析，通过BEAUti输出模型的拓扑结构、分支长度和核苷酸替换模型等参数进行重复抽样，得到贝叶斯进化树(图 2)。结果表明, D7-2018分歧时间最早为1999年，K10-2018分歧时间为2008年，其余20支毒株均晚于2010年之后产生分歧，可以观察到17株病毒的分歧时间除D7-2018外，均晚于世界各地HEV毒株的分歧时间，说明四川藏猪HEV可能是由其他地区猪群传染的。
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横坐标为时间刻度，结点处示病毒分化的时间点。●为本研究毒株 The abscissa is the time scale, and the time point of virus differentiation at the node. ●. The strain in this study 图 2 HEV序列的贝叶斯进化树 Fig. 2 Bayesian evolutionary tree of HEV sequences |
为获得藏猪HEV分离株进化关系更精确的信息，从3年采集的所有样本中，每年挑选1株典型毒株共3株进行全基因的扩增，并成功获得了3株毒株的全基因序列。将全基因序列命名并上传至GenBank，分别命名为SWU/31-12/2018、SWU/301/2019和SWU/A/2020。SWU/31-12/2018序列长度为7 208 bp，GC含量为55.15%，登录号为MK410046；SWU/30/2019序列长度为7 244 bp，GC含量为54.13%，登录号为MW365405；SWU/A/2020序列长度为7 215 bp，GC含量为54.12%，登录号为MW365406，3株全基因的相似性为89.5%~93.1%。68株阳性样本均将ORF2序列测序结果提交至GenBank，登录号为MK410054~MK410091、MW365407~MW365436。将本研究中3条全基因与GenBank数据库中其他26条HEV全基因序列构建全基因进化树(图 3)，结果表明，3株HEV均属于G4型，且与人的HEV毒株亲缘关系最近。
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●.本研究扩增的3条HEV全基因序列 ●.Three amplified complete gene sequences of HEV 图 3 HEV全基因进化树 Fig. 3 Evolutionary tree HEV complete genome |
通过RDP4和SimPlot软件对3条HEV序列全基因组进行重组分析，结果显示, SWU/301/2019的多聚蛋白ORF1片段(图 4A)存在重组，选取重组序列SWU/301/2019、亲本序列SWU/B6/2018和次要亲本SWU/31-12/2018，利用SimPlot软件进行相似性分析(图 4B)。以断点位置为界，将SWU/301/2019序列划分为重组区域(3 746—4 655 bp)和两个非重组区域(1—3 745 bp，4 656—3′末端)。通过MEGA 7.0软件的Neighbor-Joining法对SWU/301/2019三个区域的核苷酸序列(图 4C1、C2、C3) 分别构建进化树，基于重组区域构建的进化树与非重组区域显示出不一致的遗传系统发育关系，进一步支持了SWU/301/2019的重组事件。
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A. RDP4重组分析结果；B. SimPlot相似性分析结果；C1、C3. SWU/301/2019非重组区域构建进化树；C2. SWU/301/2019重组区域构建进化树 A is the result of RDP4 recombination analysis; B is the result of SimPlot similarity analysis; C1 and C3 are the evolutionary tree constructed for SWU/301/2019 non-recombinant region; C2 is the evolutionary tree constructed for SWU/301/2019 recombinant region 图 4 HEV全基因组重组分析 Fig. 4 Analysis of genome-wide recombination in HEV |
HEV引起的戊型肝炎是一种自限性疾病，作为人兽共患疾病之一，已在世界范围内造成了严重的公共卫生问题[17-18]。在高原地区，所有动物均以散养为主，且与人类生活区域无严格的界限，共用水源与食物，使HEV的流行和传播加剧，同时也更有利于其跨种间传播[22-23]。尽管已有研究表明HEV是高原一种重要的地方性疾病，但对于其流行率的分析有限，分子水平的遗传进化分析较少[24]。
本研究藏猪粪便中HEV阳性率为20.48%(68/332，95%CI=16.3%~25.2%)，意大利一项研究表明，猪腹泻样本中HEV阳性率显著高于健康样本阳性率[26]，与本研究68份阳性粪便中腹泻样本HEV阳性率显著高于健康样本相契合，表明HEV的流行可能与腹泻有关。本研究藏猪HEV阳性率为20.48%，显著高于2018年对四川猪HEV阳性率进行的报道[27]，同时也显著高于藏猪血清[24]以及胆汁[25]中HEV感染率的调查，说明在高原地区藏猪感染HEV的情况相当普遍，且以粪便传播为主，提示人们要重视高原藏猪HEV的防控及流行情况。
HEV最早被认为只感染人类，引起自限性肝炎，免疫功能低下个体可能发生慢性HEV感染[29], 随后被证实为人畜共患疾病[10]，HEV-4型为主要的人畜共患基因型，近年来，也有研究证明HEV-4型为我国主要流行基因型，但4型亚型的流行在不同地方也有明显差异，如我国南部人和猪以HEV-4b亚型为主，而我国东部以HEV-4a亚型为主[30]，本研究中来自四川藏猪的68株HEV均为4型，且主要为4a型，与该研究结果不一致，可能是由于地域差异。已有研究表明人HEV-4毒株的基因组序列与从同一地理区域获得的猪HEV-4毒株的基因组序列密切相关[15, 31]，而从22个猪场采集的样本结果显示主要为4a型，说明该基因型主要由其他地区传给藏猪，该病原已在当地藏猪群中形成流行。为进一步分析其遗传演化，本研究通过BEAST v1.8.0软件对87条(其中包括本研究中分别从22个猪场各挑选1株典型毒株的ORF2部分片段)确定采样时间的HEV ORF2部分片段进行分歧时间的估算结果分析显示，四川藏猪的HEV4型毒株进化晚于世界各地毒株，说明藏猪HEV可能是由其他地区猪传染的，这种现象的形成可能是由于藏猪之间的交配导致猪群之间发生交叉感染。
HEV的重组事件鲜有报道，但HEV-4a的重组事件却经常出现，并且在病毒进化中发挥了重要作用，已有研究证明人和猪HEV毒株之间可能发生重组，存在双重组事件，在HEV的ORF2区域内可能发生重组事件[32], 另一项研究也表明，病毒在编码非结构和结构蛋白的基因组连接处重组，创建新的病毒家族，导致人畜共患新型病原的产生(HEV、星状病毒)[33]。本研究共获得了3株HEV全基因组，在四川藏猪中鉴定出1株重组HEV-4a毒株：SWU/301/2019。SWU/301/2019重组发生在ORF1区域内，说明HEV ORF1区域也有可能发生重组，产生新的毒株。该重组事件发生在藏猪和人HEV毒株之间，表明藏猪和人之间传播HEV的潜在风险。
本研究不仅表明了四川藏猪源HEV是由其他地区猪传染给四川地区藏猪，同时还表明了藏猪源的HEV毒株在不断进化，毒力有逐渐增强倾向。感染人和动物的HEV 4型毒株为当地主要流行毒株具有潜在的暴发风险，因此应重视HEV的流行，加强对四川藏猪HEV的监测。
4 结论本研究对采自四川甘孜藏族自治州和阿坝藏族自治州的22个猪场332份藏猪粪便样本进行HEV检测；并对全部样本进行了ORF2分型以及3份典型阳性样本进行了全基因组序列扩增分析；通过重组分析发现SWU/301/2019和SWU/31-12/2018有重组现象；遗传进化分析发现藏猪HEV可能是由其他地区感染猪群传染的。
| [1] |
BALAYAN M S, ANDJAPARIDZE A G, SAVINSKAYA S S, et al. Evidence for a virus in non-A, non-B hepatitis transmitted via the fecal-oral route[J]. Intervirology, 1983, 20(1): 23-31. DOI:10.1159/000149370 |
| [2] |
HUANG R T, LI X Y, XIA X B, et al. Antibody detection and sequence analysis of sporadic HEV in Xiamen region[J]. World J Gastroenterol, 1999, 5(3): 270-272. DOI:10.3748/wjg.v5.i3.270 |
| [3] |
AGGARWAL R, KRAWCZYNSKI K. Hepatitis E: an overview and recent advances in clinical and laboratory research[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2000, 15(1): 9-20. DOI:10.1046/j.1440-1746.2000.02006.x |
| [4] |
KASEM A, AZEEM K, VL ČKOVÁ J, et al. Epidemiology of hepatitis E virus infection[J]. Epidemiol Mikrobiol Imunol, 2019, 68(4): 176-182. |
| [5] |
TAKAHASHI K, IWATA K, WATANABE N, et al. Full-genome nucleotide sequence of a hepatitis E virus strain that may be indigenous to Japan[J]. Virology, 2001, 287(1): 9-12. DOI:10.1006/viro.2001.1017 |
| [6] |
CLEMENTE-CASARES P, PINA S, BUTI M, et al. Hepatitis E virus epidemiology in industrialized countries[J]. Emerg Infect Dis, 2003, 9(4): 448-454. DOI:10.3201/eid0904.020351 |
| [7] |
CLAYSON E T, INNIS B L, MYINT K S, et al. Detection of hepatitis E virus infections among domestic swine in the Kathmandu Valley of Nepal[J]. Am J Trop Med Hyg, 1995, 53(3): 228-232. DOI:10.4269/ajtmh.1995.53.228 |
| [8] |
KABRANE-LAZIZI Y, FINE J B, ELM J, et al. Evidence for widespread infection of wild rats with hepatitis E virus in the United States[J]. Am J Trop Med Hyg, 1999, 61(2): 331-335. DOI:10.4269/ajtmh.1999.61.331 |
| [9] |
USMANOV R K, BALAIAN M S, DVO Ι ˇ NIKOVA O V, et al. Eksperimental'naia infektsiia iagniat virusom gepatita E[An experimental infection in lambs by the hepatitis E virus][J]. Vopr Virusol, 1994, 39(4): 165-168. |
| [10] |
MENG X J. Zoonotic and foodborne transmission of hepatitis E virus[J]. Semin Liver Dis, 2013, 33(1): 41-49. DOI:10.1055/s-0033-1338113 |
| [11] |
AL-SADEQ D W, MAJDALAWIEH A F, MESLEH A G, et al. Laboratory challenges in the diagnosis of hepatitis E virus[J]. J Med Microbiol, 2018, 67(4): 466-480. DOI:10.1099/jmm.0.000706 |
| [12] |
SMITH D B, SIMMONDS P, IZOPET J, et al. Proposed reference sequences for hepatitis E virus subtypes[J]. J Gen Virol, 2016, 97(3): 537-542. DOI:10.1099/jgv.0.000393 |
| [13] |
WOO P C Y, LAU S K P, TENG J L, et al. New Hepatitis E virus genotype in bactrian camels, Xinjiang, China, 2013[J]. Emerg Infect Dis, 2016, 22(12): 2219-2221. DOI:10.3201/eid2212.160979 |
| [14] |
LEE G H, TAN B H, TEO E C Y, et al. Chronic infection with camelid Hepatitis E virus in a liver transplant recipient who regularly consumes camel meat and Milk[J]. Gastroenterology, 2016, 150(2): 355-357. DOI:10.1053/j.gastro.2015.10.048 |
| [15] |
LIU P, LI L J, WANG L, et al. Phylogenetic analysis of 626 hepatitis E virus (HEV) isolates from humans and animals in China (1986-2011) showing genotype diversity and zoonotic transmission[J]. Infect Genet Evol, 2012, 12(2): 428-434. DOI:10.1016/j.meegid.2012.01.017 |
| [16] |
LU Y H, QIAN H Z, HU A Q, et al. Duration of viraemia in Chinese acute sporadic hepatitis E[J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2014, 33(5): 755-759. DOI:10.1007/s10096-013-2007-5 |
| [17] |
KAMAR N, IZOPET J, PAVIO N, et al. Hepatitis E virus infection[J]. Nat Rev Dis Primers, 2017, 3: 17086. DOI:10.1038/nrdp.2017.86 |
| [18] |
LI H X, WU J Y, SHENG Y M, et al. Prevalence of hepatitis E virus (HEV) infection in various pig farms from Shaanxi Province, China: First detection of HEV RNA in pig semen[J]. Transbound Emerg Dis, 2019, 66(1): 72-82. DOI:10.1111/tbed.12966 |
| [19] |
LI K, ZHANG L H, ZHANG H, et al. Epidemiological investigation and risk factors of Echinococcus granulosus in yaks (Bos grunniens), Tibetan pigs and Tibetans on Qinghai Tibetan plateau[J]. Acta Trop, 2017, 173: 147-152. DOI:10.1016/j.actatropica.2017.06.019 |
| [20] |
李峰, 孟继鸿, 董晨, 等. 戊型肝炎病毒通用性PCR引物的设计及其基因分型的研究[J]. 病毒学报, 2009, 25(1): 9-16. LI F, MENG J H, DONG C, et al. Design and application of a set of universal PCR primers for genotyping of Hepatitis E virus[J]. Chinese Journal of Virology, 2009, 25(1): 9-16. DOI:10.3321/j.issn:1000-8721.2009.01.002 (in Chinese) |
| [21] |
ZHOU K L, ZHOU Q, YANG D J, et al. Hepatitis E virus in Tibetan pigs on the Qinghai-Tibetan Plateau: detection, molecular characterization and infection of BALB/c mice[J]. Arch Virol, 2019, 164(12): 2943-2951. DOI:10.1007/s00705-019-04410-x |
| [22] |
曹茂开, 刘赴平, 姜双应, 等. 陕西、青海、新疆三省(区)部分人群庚型肝炎病毒血清学调查[J]. 中华实验和临床病毒学杂志, 2002, 16(4): 345-347. CAO M K, LIU F P, JIANG S Y, et al. Seroepidemiologic survey of hepatitis G virus in selected population of Shanxi, Qinghai and Xinjiang Provinces (region) of China[J]. Chinese Journal of Experimental and Clinical Virology, 2002, 16(4): 345-347. DOI:10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2002.04.012 (in Chinese) |
| [23] |
于婧, 曲娟娟, 于敏, 等. 青海地区人畜戊型肝炎病毒抗体的ELISA检测[J]. 中国兽医杂志, 2009, 45(2): 71-72. YU J, QU J J, YU M, et al. ELISA detection of human and animal hepatitis E virus antibody in Qinghai area[J]. Chinese Journal of Veterinary Medicine, 2009, 45(2): 71-72. DOI:10.3969/j.issn.0529-6005.2009.02.040 (in Chinese) |
| [24] |
TOOLE M J, CLARIDGE F, ANDERSON D A, et al. Hepatitis E virus infection as a marker for contaminated community drinking water sources in Tibetan villages[J]. Am J Trop Med Hyg, 2006, 74(2): 250-254. DOI:10.4269/ajtmh.2006.74.250 |
| [25] |
贡嘎, 王一飞, 益西措姆, 等. 中国西藏部分地区猪戊型肝炎病毒流行病学调查[J]. 生物工程学报, 2018, 34(9): 1453-1459. GONGGA, WANG Y F, YIXICUOMU, et al. Epidemiological investigation of hepatitis E virus infection in Tibetan swine population[J]. Chinese Journal of Biotechnology, 2018, 34(9): 1453-1459. (in Chinese) |
| [26] |
ZHANG L H, HUANG S C, LI K, et al. Molecular detection of indigenous Hepatitis E virus (HEV) from Tibetan Pigs in Tibet, China[J]. Food Environ Virol, 2018, 10(4): 373-377. DOI:10.1007/s12560-018-9352-6 |
| [27] |
MONINI M, DI BARTOLO I, IANIRO G, et al. Detection and molecular characterization of zoonotic viruses in swine fecal samples in Italian pig herds[J]. Arch Virol, 2015, 160(10): 2547-2556. DOI:10.1007/s00705-015-2538-4 |
| [28] |
LI Y Y, XU Z W, LI X J, et al. Epidemiological survey and sequence information analysis of swine hepatitis E virus in Sichuan, China[J]. Epidemiol Infect, 2018, 147: e49. |
| [29] |
NAKANO T, TAKAHASHI K, TAKAHASHI M, et al. Investigating the origin and global dispersal history of hepatitis E virus genotype 4 using phylogeographical analysis[J]. Liver Int, 2016, 36(1): 31-41. DOI:10.1111/liv.12880 |
| [30] |
PURCELL R H, EMERSON S U. Hepatitis E: an emerging awareness of an old disease[J]. J Hepatol, 2008, 48(3): 494-503. DOI:10.1016/j.jhep.2007.12.008 |
| [31] |
刘敏, 李丽娟, 肖文. 中国戊型肝炎病毒基因型及其亚型的地理分布[J]. 中国人兽共患病学报, 2016, 32(2): 182-187. LIU M, LI L J, XIAO W. Geographical distribution of hepatitis E virus genotypes and subtypes in China[J]. Chinese Journal of Zoonoses, 2016, 32(2): 182-187. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.02.017 (in Chinese) |
| [32] |
CHAN M C W, KWOK K, HUNG T N, et al. Molecular epidemiology and strain comparison between Hepatitis E Viruses in human sera and pig livers during 2014 to 2016 in Hong Kong[J]. J Clin Microbiol, 2017, 55(5): 1408-1415. DOI:10.1128/JCM.02020-16 |
| [33] |
WANG H, ZHANG W, NI B, et al. Recombination analysis reveals a double recombination event in hepatitis E virus[J]. Virol J, 2010, 7: 129. DOI:10.1186/1743-422X-7-129 |
| [34] |
KELLY A G, NETZLER N E, WHITE P A. Ancient recombination events and the origins of hepatitis E virus[J]. BMC Evol Biol, 2016, 16(1): 210. DOI:10.1186/s12862-016-0785-y |
(编辑 白永平)