猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)是一种接触传染性肠道病毒病，以仔猪的水样腹泻、高死亡率和发病率为特征^[1-2]。PED的病原猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)是一种单股正链RNA病毒，基因组大小约28 kb，编码16个非结构蛋白(non-structural protein, nsp)，4个结构蛋白(S、E、M和N) 和1个辅助蛋白ORF3^[3]。在结构蛋白中，S蛋白根据功能划分为S1和S2，S1结构域有助于受体识别、引发肠致病性和免疫原性，因为它包含显性中和表位。S2结构域锚定在病毒膜上，触发膜融合^[4]。S1蛋白中的中和表位分别为COE(499—638 aa)、SS2 (748—755 aa)和SS6(764—771 aa)，(1 368—1 374 aa) 位于S2结构域中^[5-7]。除此之外，S1蛋白的N端(34—230 aa) 含有比较重要的抗原表位，可以诱导保护性反应，负责与细胞表面唾液酸受体结合^[8]。此外，S蛋白是PEDV的一个主要的毒力基因^[9-10]，也是分析PEDV遗传变异和分子流行病学的重要靶标^[11]，这使得S蛋白成为研发疫苗和诊断试剂的候选者。

20世纪90年代，一群比利时学生尝试纯化单峰骆驼血清中的蛋白，无意中发现了除传统抗体之外，还有一种缺少轻链，仅由重链组成的抗体，这种抗体后来被称为重链抗体^[12]。随后，在羊驼和鲨鱼等动物外周血中也发现了这种特殊抗体的存在。其重链可变区组成的单域抗体称为VHH (variable domains of Camellidae heavy chain-only antibodies，VHH)。VHH的形状为扁长型，类似于橄榄球状，相对分子质量约为15 ku，直径约为2.5 nm，高约4 nm，VHH是已知最小的具有完整抗原结合位点的抗体，因此被称为纳米抗体(nanobody，Nb)^[13]。与常规抗体相比，Nb稳定性高，可溶性好、亲和力强、免疫原性小及易在大肠杆菌中表达和纯化，且具有高表达产量等特点^[14-15]。因此，这使得Nb被应用到许多医学、生物技术、诊断和治疗中^[16-17]。

目前，还没有报道针对PEDV S蛋白纳米抗体用于PED的治疗和诊断中，本研究拟通过噬菌体展示技术筛选出PEDV S1蛋白的特异性纳米抗体，为PED的治疗、诊断及研究PEDV的致病机制奠定基础。

1 材料与方法 1.1 材料

E. coli Trans5α和E.coli BL21(DE3)感受态细胞均购自上海唯地生物技术有限公司；pCANTAB 5E噬菌体载体购自美国GE公司；HRP-Goat@Mouse IgG抗体和Anti-His Mouse mAb均购自于Jackson immuoresearch公司。Ficoll-Paque PLUS淋巴细胞分离液购自Greiner bio-one公司；辅助噬菌体M13K07和限制性内切酶购自美国NEB公司；RNAiso Plus、PrimeScript RT reagent Kit和Prime STAR HS DNA polymerase购自日本TaKaRa公司；质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自北京全式金生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重组S1蛋白原核表达载体的构建 　　用RNAiso Plus从PEDV(GenBank序列号: No MT787025)阳性的组织病料中提取RNA，用反转录试剂盒将RNA反转成cDNA, 用表 1引物以cDNA为模板扩增S1基因(66—1 515 bp)，通过BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点克隆到pET32a载体中，得到质粒pET32a-S1, 测序正确后, 用于后续试验。使用EasyPure Plasmid MiniPrep Kit进行pET32a-S1的质粒提取，检测质粒浓度，置于-20 ℃保存。

1.2.2 重组S1蛋白的表达与纯化 　　将pET32a-S1质粒阳转到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，挑取阳性克隆到LB培养基中，于37 ℃恒温摇床中220 r·min^-1震荡培养过夜，按照1∶100的比例接种于大的摇瓶中，培养至对数期，加入IPTG贮存液(1 mol·L^-1)至终浓度为1 mmol·L^-1，诱导5 h后收菌，SDS-PAGE鉴定蛋白是否表达。对诱导后的菌体138 kW超声3 s，暂停3 s，共超声40 min，收集上清和沉淀进行蛋白可溶性分析。用Ni-NTA纯化S1蛋白。

1.2.3 动物免疫 　　5 mg纯化的PEDVS1蛋白同弗氏完全佐剂和不完全佐剂乳化后免疫阿拉善双峰驼。免疫间隔为2周，4次后，采用间接ELISA测定骆驼血清中特异性PEDV S1抗体滴度，随后采集骆驼外周抗凝血，并分离淋巴细胞。间接ELISA的具体操作步骤：使用PBS作为包被缓冲液，将截短PEDV S蛋白稀释至10 μg·mL^-1，100 μL·孔^-1，加入酶标板，4 ℃条件包被过夜；次日，用PBS’T洗板4次，200 μL·孔^-1加入2.5%脱脂奶粉，37 ℃恒温孵育1 h；弃去封闭液，用PBS’T洗板4次，对骆驼血清样品使用封闭液进行倍比稀释，各稀释比例100 μL·孔^-1，置于37 ℃恒温孵育1 h；弃去倍比稀释的骆驼血清样品，PBS’T洗板4次，使用封闭液1∶2 000稀释Rabbit @ Camel IgG多克隆抗体，100 μL·孔^-1，37 ℃恒温孵育1 h；弃去抗血清，PBS’T洗板4次，100 μL·孔^-1加入稀释至工作浓度的Goat @ Mouse IgG HRP标记抗体，37 ℃恒温孵育1 h。弃去酶标二抗，用PBS’T洗板4次，100 μL·孔^-1加入TMB显色底物，37 ℃避光恒温孵育15 min；50 μL·孔^-1加入3 mol·L^-1 H₂SO₄，使用分光光度计测量OD_{450 nm}。

1.2.4 噬菌体展示文库的构建 　　提取外周血淋巴细胞RNA并反转录成cDNA. 采用巢式PCR扩增VHH基因，用表 2中CALL-1和CALL-2引物扩增出大小约700 bp的片段; 随后，用表 2中VHH-F和VHH-R进行第二轮的扩增，大小约400 bp, 对第二轮的产物回收, 对回收产物和pCANTAB 5E载体同时进行双酶切，酶切位点为PstⅠ和NotⅠ；随后将载体与目的片段连接并电转入E. coli TG1感受态细胞中，将转化的感受态细胞在37 ℃ 120 r·min^-1恒温培养40~60 min。吸取200 μL培养物用于所构建文库质量的鉴定，将剩余培养物1.5 mL·板^-1均匀涂布至LB/AMP-GLU方形培养皿，37 ℃恒温箱中培养6~8 h。刮下培养皿内菌落到2~3 mL LB/AMP-GLU培养基，保存备用。

1.2.5 文库容量和多样性测定 　　将上述步骤中取出的200 μL培养物10倍梯度稀释，并涂布到AMP-GLU LB平板，37 ℃恒温培养过夜。统计转化子数量。挑取96个单菌落并菌液PCR鉴定阳性率，对阳性克隆测序；使用MegAlign软件对VHH序列进行比对，分析文库的序列多样性。

1.2.6 VHH噬菌体抗体展示文库的救援 　　取“1.2.4”步骤中构建的VHH噬菌体抗体展示文库，加入100 mL 2×YT/AMP-GLU培养基，37 ℃剧烈震荡培养至对数生长期。加入20 MOI辅助噬菌体M13KO7，37 ℃ 200 r·min^-1震荡培养1~2 h，收集菌体沉淀。沉淀重悬后继续震荡培养12 h。离心，收集上清，加入1/5体积预冷的PEG/NaCl溶液，冰中孵育10~12 h。离心后用PBS重悬后即为重组噬菌体。

1.2.7 PEDV S1特异性重组噬菌体的淘选 　　用PEDV S1蛋白包板，100 ng·孔^-1，同时设置对照孔，4 ℃包被过夜。弃包被液，2.5%脱脂奶粉封闭，37 ℃孵育1 h；10¹²pfu·mL^-1加入步骤“1.2.6”救援的重组噬菌体，37 ℃孵育1 h。弃噬菌体溶液，洗板后加入0.1 mol·L^-1的三乙胺，室温静置10 min，收集洗脱液，立即加入相同体积的1 mol·L^-1 Tris-HCl (pH7.4)，随后对所洗脱的重组噬菌体进行滴度的测定。取20 mL培养至对数期的TG1，加入洗脱的噬菌体溶液，37 ℃静置侵染60 min后加入80 mL 2×YT/AMP-GLU培养基，37 ℃ 200 r·min^-1，震荡培养至对数期，按照上述步骤加入20 MOI辅助噬菌体进行救援后进行二轮淘选；按照上述步骤，对重组噬菌体总共进行3轮固相淘选。

1.2.8 PEDV S1特异性重组噬菌体富集 　　以PEDV S1包板过夜。封闭后将重组噬菌体溶液使用封闭液按1∶10稀释，37 ℃孵育1 h；弃去噬菌体溶液，PBS’T洗板4次，加入HRP标记Mouse @ M13噬菌体抗体，37 ℃孵育1 h。弃去抗体，PBS’T洗涤4次，加入TMB显色底物，37 ℃孵育15 min。50 μL·孔^-1加入3 mol·L^-1 H₂SO₄终止显色，测量OD_{450 nm}。

1.2.9 重组纳米抗体的表达 　　取第3轮淘选后的重组噬菌体溶液，重组噬菌体溶液十倍梯度稀释后，加到对数期的TG1，37 ℃感染60 min，涂布于LB/AMP-GLU，过夜培养；挑取单菌落到LB/AMP-GLU中，培养过夜；从各菌落培养物中取出50 μL分别转接于2 mL TB培养基中，对应编号置于24孔培养板，培养至对数期；加入终浓度为1 mmol·L^-1 IPTG，过夜诱导表达。

1.2.10 重组纳米抗体粗提物的制备 　　收集步骤“1.2.9”中的24孔板中培养液于1.5 mL EP管中，离心收集菌体沉淀，加入PBS重悬菌体并－20 ℃冻融。离心后，上清即为纳米抗体粗提物。

1.2.11 重组纳米抗体粗提物的检测 　　将经过纯化的截短PEDV S1重组蛋白用PBS缓冲液稀释至100 μg·mL^-1，100 μL·孔^-1，4 ℃包被过夜，同时设置相同数量的对照孔，包被等量的PEDV N重组蛋白；进行封闭后，用PBS’T洗涤4次，加入使用封闭液按1∶1稀释的纳米抗体粗提物，100 μL·孔^-1，37 ℃恒温孵育1 h；弃去粗提物溶液，用PBS’T洗板4次，加入使用封闭液按1∶2 000稀释至工作浓度的Anti-E-tag标签抗体，100 μL·孔^-1，37 ℃恒温孵育1 h；弃掉Anti-E-tag标签抗体，用PBS’T洗涤4次，100 μL·孔^-1加入使用封闭液稀释至工作浓度的HRP标记Goat@Rabbit IgG抗体，37 ℃恒温孵育1 h；随后进行显色，进行使用分光光度计测量OD_{450 nm}。

1.2.12 PEDV S1特异性纳米抗体的序列分析 　　将上述ELISA鉴定为阳性的克隆测序。用MegAlign软件比对测序结果，并根据纳米抗体高变区分类。

1.2.13 PEDV S1蛋白纳米抗体的特异性和结合力测定 　　使用同期对骆驼免疫的2种蛋白，猪圆环病毒Cap蛋白和猪伪狂犬病病毒gE蛋白作为对照。将截短PEDV S蛋白、猪圆环病毒Cap蛋白和猪伪狂犬病病毒gE蛋白包被于同一个ELISA酶标板，利用“1.2.11”步骤检测所筛选PEDV S蛋白纳米抗体的特异性。对不同的纳米抗体粗提物10倍倍比稀释，用同样的方法测定纳米抗体的结合力。

1.2.14 纳米抗体活性的鉴定 　　将生长状态良好的Vero细胞以一定密度铺入含有24孔爬片细胞板中和正常的12孔细胞培养板中，24 h后接入0.1 MO1 PEDV；接毒后24 h，一方面进行间接免疫荧光检测；每孔加入200 μL 4%多聚甲醛，置于37 ℃恒温箱中固定15 min；弃掉固定液后，每孔加入200 μL 0.25% triton X-100, 15 min后取出。用1×PBS (K⁺)洗涤3次，加入1%BSA封闭30 min；加入原核表达的纳米抗体Nb3，37 ℃孵育1 h；洗涤后加入His抗体，37 ℃孵育1 h；洗涤后加入荧光二抗，孵育1 h；洗涤后加入DAPI，染色10 min，使用细胞成像Leica microscope进行拍照。另一方面进行Western blot: 收集12细胞培养板中正常Vero细胞和PEDV感染的Vero细胞。利用NP40裂解细胞，取10 μL进行SDS-PAGE；随后转印至PVDF膜，用5%脱脂奶粉封闭2 h，用Nb3室温孵育1 h，PBS’T洗涤4次后，加入His抗体室温孵育1 h，PBS’T洗涤4次后，用HRP标记的Goat anti-Mouse IgG (H+L) 二抗进行室温孵育1 h，PBS’T洗涤4次后，将PVDF膜置于ECL发光液中后，放入化学发光成像仪内进行成像。

2 结果 2.1 pET32a-PEDV-S1原核表达载体的构建

提取PEDV阳性组织的RNA，反转录成cDNA，以此为模板，PCR扩增产物位于1 000 ~2 000 bp，与预期目的片段大小(1 452 bp)相符(图 1A)，目的条带回收后与载体pET-32a同时双酶切(图 1B)，连接转化，挑取单菌落进行PCR鉴定，结果如图 1C, 将阳性克隆送公司测序，综上结果表明，成功构建pET32a-PEDV-S1原核表达载体。

2.2 PEDV S1蛋白的表达与纯化

将测序正确的pET32a-PEDV-S1质粒转到E. coli BL21(DE3)中，以1 mmol·L^-1的IPTG诱导表达后SDS-PAGE检测，在大约70 ku处可见与预期结果一致的条带，而空载诱导后，未出现此条带(图 2A)，且S1重组蛋白以包涵体的形式存在(图 2B)。用Ni-NTA纯化后，得到纯度较好S1重组蛋白(图 2C)。

2.3 双峰驼免疫

用纯化后的截短PEDV S重组蛋白免疫阿拉善双驼峰，在最后一次免疫后第4天，用间接ELISA检测S蛋白抗体效价，结果显示，双驼峰血清中PEDV S抗体效价高达1∶256 000 (图 3)。

2.4 VHH噬菌体展示文库的构建

采集200 mL骆驼外周抗凝血，分离外周血淋巴细胞。提取RNA，反转录成cDNA。通过巢式PCR扩增VHH片段，第一轮回收700 bp左右目的条带(图 4A)，第二轮PCR回收400 bp左右条带(图 4B)。将VHH片段构建至pCANTAB 5E载体中，电转化至TG1感受态得到噬菌体展示文库，该文库库容约为2.1×10⁷，阳性率约为85%(图 4C)。

2.5 PEDV S1蛋白特异性纳米抗体的筛选

对噬菌体展示文库进行救援后，经过3轮淘选后，富集率可以达到1 673(图 5A)。将第3轮淘选后的重组噬菌体侵染对数期TGI细胞，涂布至LB/AMP-GLU平板，挑取96个单菌落，共挑取2轮，进行粗提，通过ELISA鉴定粗提物与PEDV S蛋白的反应性，结果如5B，随机选取的96个单克隆中有23个为阳性克隆，对阳性克隆进行测序分析，鉴定出了6个序列不同的纳米抗体，并依次命名为Nb1~Nb6(图 5C)。

2.6 PEDV S蛋白纳米抗体特异性及结合力的测定

以猪圆环病毒Cap重组蛋白和猪伪狂犬病病毒gE重组蛋白作为对照，检测筛选出的6株纳米抗体的特异性。结果显示，6株纳米抗体均不存在交叉反应(图 6A)。与此同时，通过ELISA进一步确定了6株纳米抗体对PEDV S重组蛋白的结合能力，结果显示，Nb3具有最高的结合能力(图 6B)

2.7 Nb3与PEDV结合活性鉴定

通过Western blot和IFA验证纳米抗体Nb3与PEDV的结合，用原核表达的纳米抗体Nb3验证其是否能够结合感染细胞中的PEDV，以未接毒细胞作为对照，结果如图 7，Nb3同PEDV具有良好的结合活性。

3 讨论

2010年10月，PED在中国大面积暴发，这次疫病的暴发以7日龄以内的哺乳仔猪极高发病率和死亡率为主要特征，2周龄以上的猪出现不同程度的腹泻和厌食等症状，并预示着高毒力PEDV变异毒株的出现^[19]，由此可见，PEDV是一种破坏力较大的肠道冠状病毒^[19-21]，目前，尚无针对PEDV的有效疫苗，因此，治疗与诊断对防控PED具有重大意义。

抗体能够中和病毒，起到一定的治疗作用，但同时也具有一定的风险，比如产生ADE现象^[22]。纳米抗体优越的生物学特性能够克服常规抗体的不足，很适合疫病的治疗^[23-24]。Bao等^[25]通过利用截短的PEDV S蛋白免疫骆驼后筛选出1株S蛋白特异性的纳米抗体S7, 但S7对PEDV没有中和效果。Yang等^[15]筛选出靶向PEDV M蛋白的4株特异性的单域抗体，但对PEDV同样没有中和活性。虽然没有中和活性，但这些纳米抗体均可被用于PEDV诊断。

纳米抗体被广泛用于病原诊断中^[26-29]，比如新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)^{[17, 27]}、猪细小病毒(porcine parvovirus, PPV)^[28]、猪流感病毒(swine influenza virus, SIV)^[29]和寨卡病毒(Zika virus)^[26]。纳米抗体也被用于PEDV的诊断中，我们课题组已经建立了基于PEDV N蛋白纳米抗体的快速检测PEDV的方法^[30]。本研究表达截短的PEDV S1(22—505 aa)蛋白，该区域不含有中和表位，但能够影响病毒的复制^[8]。利用截短的S1蛋白免疫骆驼后构建了多样性良好的VHH噬菌体展示文库。经鉴定，该文库库容量为2.1×10⁷，随机挑选96个单菌落，阳性率达到85%, 对其中的阳性单克隆进行测序，验证了该文库具有良好的多样性。进一步对文库进行了救援和3轮特异性淘选富集，并最终筛选出6株氨基酸序列不相同的纳米抗体，6株纳米抗体与猪圆环病毒Cap蛋白、猪伪狂犬病病毒gE蛋白均不存在交叉反应。随后，验证结合力最高的纳米抗体Nb3与PEDV具有良好的结合活性。

4 结论

成功表达并纯化PEDV S1蛋白，免疫双峰驼后，构建多样性良好的噬菌体展示文库，并利用噬菌体展示技术成功筛选出6株特异性结合PEDV S1蛋白的纳米抗体。所筛选的特异性纳米抗体为PEDV的诊断和纳米抗体药物的研发提供了参考。