2. 渭南市临渭区动物疫控中心, 渭南 714000;
3. 浙江金大康动物保健品有限公司, 金华 321016
, QIU Cunyi1, FENG Yixue1, HAN Likang2,3, DU Lianzhao1, WANG Qianqian1, MA Xin1, LI Ruixiang2,3
, WANG Xinglong1
2. Linwei District Animal Disease Prevention and Control Center, Weinan 714000, China;
3. Zhejiang Jindakang Animal Health Products Co. Ltd., Jinhua 321016, China
猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)，又称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)感染猪后引起的一种严重危害养猪业的传染病。PRRSV造成以流产、早产、产死胎或木乃伊胎为特征的母猪繁殖障碍性疾病和仔猪、育肥猪呼吸系统疾病。1996年，我国首次分离到该毒株，正式确定了PRRS在我国的传播[1-2]。2006年暴发的高致病性蓝耳病(HP-PRRS)，其致病性相对经典PRRSV有了显著升高[3]，近年来，国内又在流行类NADC-30毒株，给防控带来巨大压力[4]。PRRSV有两种基因型，PRRSV-I型(Lelysted virus，LV)为欧洲型毒株，PRRSV-II型(VR-2332)为美洲型毒株[5-6]。虽然欧洲型和美洲型毒株感染猪后引起的临床症状相似，但二者抗原性差异较大，核苷酸相似度为55%~70%，氨基酸相似度为50%~80% [7-9]。目前，生产上主要用弱毒活疫苗或灭活疫苗预防PRRS，多数情况下免疫无法为野毒株提供充分保护，弱毒活疫苗还存在返强风险[10-11]。积极寻求PRRS新的防控方案是近年来动物疫病防控领域研究的热点。许多研究发现，中药及其多糖类化合物具有很好的抗病毒效果[12]，参虎败毒颗粒是由黄芩、虎杖、白头翁、苦参、板蓝根等中药组成，具有清热解毒、扶正祛邪、利湿退黄、抗菌抗病毒作用[13]，推测参虎败毒颗粒可能对PRRSV具有较好抑制效果。因此，有必要对参虎败毒颗粒抗PRRSV的作用进行研究，为其临床应用和后期高效抗PRRSV复方中药的开发寻找依据。
1 材料与方法 1.1 中药及试剂参虎败毒颗粒复方中药由浙江金大康动物保健品有限公司提供；反转录试剂盒购自北京康润诚业生物科技有限公司；猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA检测试剂盒购自北京金诺百泰生物技术有限公司。
1.2 毒株及试验动物PRRSV JXA1毒株(104.7 TCID50·mL-1)由西北农林科技大学兽医传染病实验室提供，动物选用20头35日龄健康、体重相近的PRRSV病原、抗体阴性断奶仔猪，由勉县良种繁育场提供。
1.3 PRRSV检测引物根据GenBank发表的序列，设计针对PRRSV ORF6、ORF7和猪β-actin片段引物及探针，PRRSV ORF6与探针检测病毒血症，PRRSV ORF7与β-actin检测组织病毒载量(表 1)。
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表 1 PCR引物和探针序列 Table 1 The sequence of primers and probe for PCR detection |
1.4.1 试验动物分组与处理 将20头仔猪随机平均分为A、B、C、D共4个组。A组仔猪接种PRRSV前3 d饲料中添加药物；B组接种PRRSV当天饲料中添加药物；C组仔猪只接种PRRSV不添加药物；D组仔猪为阴性对照组，各组单独饲养管理。A、B、C组仔猪在试验第3天肌肉注射PRRSV JXA1毒株2.0 mL。
每日观察各组仔猪临床症状并测定体温，攻毒后14 d各组随机选取1头仔猪处死，进行眼观肺部病理变化检查和组织病理学检查，并检测肺的病毒载量。攻毒后1、3、5、7、14、21、28、35 d采抗凝和非抗凝血，进行PRRSV抗体和病毒血症检测。动物分组及处理方案见表 2。
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表 2 试验动物分组及处理方案 Table 2 Animal grouping and treatment |
1.4.2 病理组织切片制作 肺组织样品经固定、脱水、透明、浸蜡、包埋后，制作组织切片并进行HE染色[14]，显微镜下观察组织病理变化并拍照。
1.5 统计分析用SPSS 20.0软件对各组数据进行统计分析，以邓肯氏法进行多重比较，P＜0.01表示差异极显著(**)，P＜0.05表示差异显著(*)，P＞0.05表示差异不显著。
1.6 动物使用伦理遵照《陕西省实验动物管理办法》(陕西省人民政府令第150号)和西北农林科技大学实验动物管理处置办法进行实验动物操作，符合动物福利要求。
2 结果 2.1 仔猪体温变化A、B组攻毒后第6天体温升高至40 ℃，持续至第11和12天恢复正常，高热分别持续5和6 d；C组攻毒后第5天体温升高至40 ℃，持续至第14天，高热持续时间超过9 d；D组仔猪体温正常(图 1)。
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图 1 仔猪直肠温度变化 Fig. 1 Rectal temperature changes in piglets |
攻毒14 d，各组随机选1头仔猪处死，眼观病变主要集中在肺部，A组仔猪肺略显苍白，边缘有少许实病，肺叶轻度皱缩(图 2a)。B组仔猪肺暗红色，有部分出血点，边缘及肺叶出血，小面积实变，肺叶少许皱缩(图 2b)。C组仔猪肺颜色更深，实变更为明显，肺表面有出血点，出现明显皱缩和凹凸不平(图 2c)。D组仔猪肺粉红色、饱满、无皱缩(图 2d)。
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a. A组仔猪肺；b. B组仔猪肺；c. C组仔猪肺；d. D组仔猪肺 a. Lung from the piglet in group A; b. Lung from the piglet in group B; c. Lung from the piglet in group C; d. Lung from the piglet in group D 图 2 各组仔猪肺组织眼观病理变化 Fig. 2 Gross lesions in lungs from the piglets in different groups |
分别在10倍物镜下观察仔猪肺泡腔和肺泡壁(图 3a~d)；在40倍物镜下观察仔猪支气管管腔及官腔周围淋巴细胞浸润情况(图 3e~h)。A组可观察到少量肺泡结构破坏，肺泡壁稍增厚(图 3a)；支气管上皮细胞肿大、增生，管腔内有炎性渗出物和脱落的细胞以及少量巨噬细胞，细支气管周围大量有淋巴细胞和巨噬细胞浸润(图 3e)。B组少量肺泡结构破坏，肺泡壁增厚，厚薄不均匀(图 3b)；支气管上皮细胞肿大、增生，管腔内有炎性渗出物和脱落的细胞以及少量巨噬细胞，细支气管周围有大量淋巴细胞和巨噬细胞浸润(图 3f)。C组肺泡结构大量破坏，肺泡壁有大量淋巴细胞浸润，肺泡壁增厚导致肺泡狭窄(图 3c)；支气管上皮细胞肿大、增生，管腔内有炎性渗出物和脱落的细胞以及大量巨噬细胞，细支气管周围有大量淋巴细胞和巨噬细胞浸润(图 3g)。D组肺泡结构清晰，无明显病变(图 3d)；支气管上皮细胞无明显病变，管腔内无渗出物(图 3h)。
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a、e. A组仔猪肺组织病理学变化；b、f. B组仔猪肺组织病理学变化；c、g. C组仔猪肺组织病理学变化；d、h. D组仔猪肺组织病理学变化 a, e. Micro-lesions in lungs from piglet in group A; b, f. Micro-lesions in lungs from piglet in group B; c, g. Micro-lesions in lungs from piglet in group C; d, h. Micro-lesions in lung from piglets in group D 图 3 各组仔猪肺组织病理学变化 Fig. 3 Micro-lesions in lungs from piglets in each group |
为观察参虎败毒颗粒组织毒性和PRRSV对免疫器官的影响，取各组仔猪脾和淋巴结制作组织病理学切片。其中A组连续用药17 d，B组连续用药14 d。结果发现，各组脾和淋巴结组织结构未受到明显影响，各组脾组织中脾小结结构清晰，无明显病变(图 4a~d)；各组淋巴结无明显病变，生发中心结构清晰，淋巴细胞数量没有明显变化(图 4e~h)。
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a~d. A~D组仔猪脾组织病理学变化；e~h. A~D组仔猪淋巴结组织病理学变化 a-d. Micro-lesions in spleens of the piglets from Group A-D; e-h. Micro-lesions in lymph nodes of the piglets from Group A-D 图 4 各组仔猪脾和淋巴结组织病理学变化(10×) Fig. 4 Micro-lesions in spleens and lymph nodes of the piglets from different groups (10×) |
RT-qPCR检测攻毒后1、3、5、7、14、21和28 d仔猪全血样品，当Ct > 35时判定为阴性，A组仔猪21 d PRRSV检出比例为2/4，28 d降为0/4；B组仔猪21 d检出比例为4/4，28 d降为0/4；C组仔猪21 d检出比例为4/4，28 d降为3/4；D组全程检出比例均为0/4 (表 3)。
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表 3 仔猪血液中PRRSV检出比例 Table 3 PRRSV detection rate in blood of piglets |
A、B组部分猪在21和28 d时PRRSV检测为阴性，因此，仅对1、3、5、7和14 d仔猪全血病毒载量进行定量分析。结果如图 5所示，A、B、C组仔猪病毒载量均在第5天达到峰值，随后逐渐下降。A组在攻毒后第3、5、7、14天病毒载量均极显著低于C组(P＜0.01)。B组在攻毒后第3和5天病毒载量极显著低于C组(P＜0.01)，在攻毒后第7和14天病毒载量显著低于C组(P＜0.05)。
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a. 仔猪PRRSV病毒载量；b. RT-qPCR标准曲线(y=-3.195x+39.801，R2=0.998)。ns表示差异不显著，下同 a.PRRSV viral load in piglets; b. Standard curve of RT-qPCR (y=-3.195x+39.801, R2=0.998). ns represents non-significant difference, same as below 图 5 RT-qPCR检测全血样品中PRRSV载量 Fig. 5 RT-qPCR analyze viral loads in blood samples |
RT-qPCR检测攻毒后14 d A、B、C组仔猪肺组织PRRSV载量，β-actin为内参，将病毒载量最少的组作为参照。结果显示，C组病毒载量显著高于A组(P＜0.05)，A、B组差异不明显(P＞0.05，图 6)。
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图 6 各组仔猪肺组织PRRSV载量 Fig. 6 Viral loads in lungs from the piglets in different groups |
A、B、C组仔猪PRRSV抗体均在第14天转阳，A、B组在第21天抗体S/P值达到峰值，随后下降(图 7a、b)，C组在攻毒后28 d抗体S/P值达到峰值(图 7c)。A组仔猪抗体(S/P平均值1.061) 低于B组(S/P平均值1.913)和C组(S/P平均值1.744)(图 7d)，但差异不显著，A组抗体离散度小于其他两组。
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a.A组抗体S/P值；b. B组抗体S/P值；c. C组抗体S/P值；d. 各组相对抗体S/P值 a. S/P value of group A; b. S/P value of group B; c. S/P value of group C; d. Relative S/P value in each group 图 7 PRRSV抗体产生情况 Fig. 7 The production of PRRSV antibodies |
参虎败毒颗粒组方起源于古方七清败毒颗粒，主要成分为黄芩、虎杖、白头翁、苦参、板蓝根、大青叶和绵马贯众。黄芩具有清热燥湿，泻火解毒的作用，其多糖成分主要包括黄芩苷、黄芩素等[15]。黄芩苷与黄芩素均能不同程度地干扰和抑制病毒的复制增殖[16]，体外抗PRRSV中药单体筛选试验中，黄芩苷在最大安全浓度(18 μmol·L-1)时对PRRSV具有较好的抑制作用和直接杀灭作用，但在低浓度(9 μmol·L-1)时抗PRRSV作用不明显[17]，而以黄芩为主要成分的栀子四黄散饲喂感染PRRSV的猪，发现其具有减轻临床症状的作用，也可促进IgG、IFN-γ的产生和抑制IL-10的升高[18]。虎杖具有清热祛湿，退热止痛的作用，其主要活性成分包括白藜芦醇和大黄素等，白藜芦醇对许多DNA和RNA病毒具有抑制作用和免疫调节作用[19-20]，中药体外抗PRRSV结果发现，虎杖具有显著的抗PRRSV作用，其抑制率可达90%以上[21]。白头翁具有清热解毒，凉血止痢的作用，白头翁多糖成分主要为白头翁皂苷、白头翁素和三萜酸等[22]，体外抗PRRSV试验结果表明，白头翁粗提取物对PRRSV感染Marc-145细胞具有显著的抑制作用、直接杀灭作用和阻断作用[23]。苦参具有清热利湿，抗菌消炎的作用，苦参碱是其主要活性成分，有研究显示，苦参碱提前作用于Marc-145细胞后接毒可显著降低细胞CD163和CD151的表达，但单独使用苦参碱作用于细胞时不会抑制CD163和CD151的表达[24]，另有研究表明，苦参碱可能在细胞感染PRRSV后不同时间点抑制不同的细胞受体而发挥抗病毒作用[25]。板蓝根的功效是清热解毒、凉血止咳，其主要活性成分板蓝根多糖具有较好的抗病毒效果和免疫增强作用[26]，体外抗病毒试验结果表明，板蓝根多糖对PRRSV具有较强的阻断作用和抑制作用，但在低浓度时对PRRSV无直接杀灭作用[27-28]，另有研究表明，通过饲喂板蓝根提取物可显著抑制PRRSV弱毒疫苗免疫后猪体内病毒核酸载量，且病毒核酸载量在试验过程中呈下降趋势[29]。
本研究中，提前和感染同时药物处理的两组仔猪在攻毒后12 d体温恢复至正常，而无药物处理感染组体温在14 d仍高于40 ℃，并且肺部眼观和组织病理变化结果都显示，饲喂参虎败毒颗粒可显著减轻PRRSV对肺的损伤，该结果与解慧梅等[18]使用栀子四黄散治疗感染PRRSV仔猪的结果相似。药物处理可减轻PRRSV感染引起的临床症状，本试验中设置了提前药物处理组，结果显示，提前预防用药效果更好，提示中药制剂可能对PRRSV的预防作用强于治疗作用。饲喂参虎败毒颗粒的两组仔猪在攻毒后14 d内均可极显著或显著抑制猪体内PRRSV载量，促进PRRSV的清除，该结果和王惠[30]研究的板蓝根配合不同中药制剂可降低PRRSV载量结果一致，且提前预防用药效果优于接毒同时用药，这可能与仔猪感染PRRSV前含有一定的血药浓度有关。PRRSV抗体S/P值结果显示，3组仔猪血清PRRSV抗体阳性率均在攻毒后14 d达到100%，但饲喂参虎败毒颗粒的两组仔猪PRRSV抗体峰值提前，提前药物处理组抗体S/P值低于无药物处理感染组(病毒对照组)，与林昌华等[31-32]提前饲喂月桂酸降低PRRSV抗体水平的结果相似，不同的是，饲喂月桂酸后PRRSV抗体峰值与对照组保持一致，而本试验中饲喂参虎败毒颗粒后可使PRRSV抗体峰值提前，这可能与药物的免疫调节作用有关，需进一步研究。
JXA1毒株为高致病PRRSV毒株，但试验过程中未造成感染仔猪死亡，可能与接种剂量(2 mL×104.7 TCID50·mL-1)偏少、病毒多次细胞传代(30代)导致毒力下降或试验仔猪日龄偏大有关(35日龄)，但攻毒仍然造成了明显的肺组织病理损伤，药物处理组和感染组存在明显的眼观和组织病理变化差异，可以证明药物确实能够抑制PRRSV的致病变作用，对试验预期效果影响不大。
4 结论综上所述，参虎败毒颗粒可显著减轻PRRSV感染造成的肺损伤、降低病毒血症、促进病毒清除，且预防性用药效果更好，提示参虎败毒颗粒可作为预防和治疗PRRSV的药物。另外，参虎败毒颗粒可以缩短PRRSV病毒血症持续时间，提示可以在接种PRRSV弱毒疫苗后使用，以减少疫苗毒猪体带毒时间，降低弱毒疫苗变异返强风险。本研究证明了参虎败毒颗粒具有很好的体内抗PRRSV的作用，为PRRSV临床防控用药提供了重要的理论支撑，同时为更加高效的抗PRRSV复方中药的研究提供参考数据。
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