炎性小体主要是由模式识别受体、凋亡相关斑点样蛋白ASC(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD)、炎性Caspase(含半胱氨酸蛋白水解酶)组成的功能性多蛋白复合物[1-2]。炎性小体激活后，活化的Caspase激活切割pro-IL-1β和pro-IL-18转化为活性IL-1β和IL-18，并且切割全长gasdermin D(hGSDMD-FL)使其裂解为GSDMD-C端(GSDMD-p20)和GSDMD-N端片段(GSDMD-p30)，有活性的GSDMD-N端片段在细胞膜内侧打孔，形成10~20 nm孔径的膜孔，最终导致炎症细胞死亡，称为细胞焦亡[3-4]。细胞焦亡是一种全新的细胞死亡方式[5-6]，是由Gasdermin家族蛋白(主要是gasdermin D, GSDMD)介导的、以细胞膜形成孔洞、破裂以及细胞内容物大量释放为特征[7]。炎性Caspase，主要包括Caspase-1和Caspase-4/5/11，分别在经典和非经典炎性小体中发挥作用[8-9]。经典的细胞焦亡是由活化后的炎症性半胱氨酸氨酶-1(Caspase-1)切割GSDMD所介导，通过特异性切割GSDMD形成GSDMD-N端(GSDMD-p30)，导致细胞膜穿孔并同时促进LDH的释放，最终引起细胞焦亡[10]。非经典细胞焦亡是脂多糖(LPS)入侵至细胞胞质中，进而活化Caspase-4/5 (人)、Caspase-11 (鼠)，然后激活状态的Caspase-4/5/11直接裂解GSDMD为GSDMD-C端和GSDMD-N端片段，活性GSDMD-N端促进细胞产生焦亡现象[11]。非经典细胞焦亡与多种疾病的发生发展密切相关，进一步研究Gasdermin D介导的非经典细胞焦亡的调控机制将对疾病的预防治疗、新药物的研发提供理论依据。本研究成功构建了非经典细胞焦亡的体外模型，为后续其激活机制和药物研究提供可靠的模型。
1 材料与方法 1.1 材料1.1.1 质粒、细胞株及菌株 pCMV-N-MYC、p3XFLAG-CMV-7.1和pcDNA3.1-MYC-C真核表达载体和人胚肾细胞HEK293T细胞株均由本实验室保存；Trans5α化学感受态细胞购自北京全式金生物技术(TransGen Biotech) 有限公司。
1.1.2 主要试剂 RNA提取试剂盒(RN001)购于上海奕杉生物科技有限公司；PCR试剂盒(2×Rapid Taq master mix P222)、反转录试剂盒(R312-01)、无缝克隆试剂盒(ClonExpress® II One Step Cloning Kit, C112) 和DNA marker (7E321K9)购于南京诺唯赞生物科技有限公司；PCR产物纯化试剂盒(B518141-0100)购于上海生工生物工程股份有限公司；质粒小提中量提取试剂盒(DP118)购于天根(TIANGEN) 公司；限制性内切酶SalⅠ、NotⅠ、HindⅢ、EcoRⅠ和ApaⅠ购于NEB (New England Biolabs)；VigoFect转染试剂(201E)购于北京威格拉斯生物技术有限公司；anti-FLAG (F1804)和anti-MYC抗体(C3956)购自Sigma公司；anti-GAPDH抗体(sc-365062)购于Santa Cruz Biotechnology公司；HRP标记的山羊抗兔IgG (abs200002) 和羊抗鼠(abs20039 ss)购于Absin公司；QuickBlockTM Western封闭液(P0252)、QuickBlockTM Western一抗稀释液(P0256FT)购于上海碧云天生物技术有限公司；LDH检测试剂盒(G1780)购自Promega公司；PI (碘化丙啶)检测试剂盒(51-66211E)购于BD Pharmingen公司。
1.2 方法1.2.1 细胞总RNA提取及cDNA合成 使用RNA提取试剂盒提取人外周血的单核细胞系THP-1细胞总RNA后，使用PrimeScript RT reagent Kit配制体系，按照说明书的程序在PCR仪内进行反转录合成cDNA。
1.2.2 引物设计 通过NCBI数据库找到Caspase-4(基因序列号: NM_001225.4)、hGSDMD-FL(基因序列号: NM_024736.7)和hGSDMD-p30(基因序列号: NM_024736.7)的编码序列，使用SnapGene和CE Design V1.04软件设计相应引物。无缝克隆引物设计原则：在插入片段正反向扩增引物的5′端加入线性化载体两末端同源序列，使扩增后的插入片段5′和3′最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应一致的同源序列(15~20 bp，不包括酶切位点)。完成引物设计后由上海生工生物工程股份有限公司合成。各个基因片段的引物设计如表 1所示。
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表 1 基因片段引物序列 Table 1 Primer sequences |
1.2.3 PCR扩增 各目的片段以合成的cDNA为模板，采用PCR方法扩增Caspase-4、hGSDMD-FL和hGSDMD-p30基因，反应体系(50 μL)如下：2×Phanta Max Master Mix 25 μL，cDNA模板1~5 μL (不超过PCR反应总体积的1/10)，上下游引物各2 μL，补足ddH2O至50 μL。PCR反应程序: 95 ℃预变性3 min；95 ℃变性15 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸2 min，35个循环；72 ℃延伸5 min。反应完毕后，通过1.5%琼脂糖凝胶电泳验证PCR扩增产物。
1.2.4 质粒构建 制备线性化载体，将空载体分别选择合适的酶切位点，对载体进行线性化。其中p3XFLAG-CMV-7.1空载体使用SalⅠ和NotⅠ进行双酶切，pCMV-N-MYC空载体使用HindⅢ和EcoRⅠ进行双酶切，pcDNA3.1-MYC-C空载体使用HindⅢ和ApaⅠ进行双酶切。酶切完成后，回收各个片段及PCR产物，用ClonExpress® II One Step Cloning Kit进行重组反应，将DNA片段插入到线性化载体中。取10 μL重组产物加到100 μL Trans5α化学感受态细胞中，在热激和冷激后，加入500 μL无抗生素的培养基放入37 ℃摇床200转复苏1 h，取100 μL复苏了的菌液涂布在含氨苄抗生素的培养基上，37 ℃培养箱培养18 h后，挑取单克隆菌落摇菌，12~18 h后用天根提取试剂盒提取质粒，分别进行双酶切电泳验证质粒构建是否成功。将酶切成功的重组质粒送至生工生物工程股份有限公司测序，将测序正确的质粒分别命名为pCMV-MYC-Caspase-4、p3XFLAG-CMV-hGSDMD-FL、pcDNA3.1-hGSDMD-p30-MYC。
1.2.5 HEK293T细胞转染 HEK293T细胞(6~8)×104个·孔-1接种于24孔板内，待细胞贴壁长至密度为40%~60%后进行转染。转染前1 h，更换新鲜的完全培养液，置37 ℃，5% CO2的培养箱中培养。每孔转染方法：0.5 μL VigoFect与24.5 μL生理盐水混合，混匀后室温孵育5 min；重组质粒与生理盐水混合至总体积25 μL；将稀释的VigoFect逐滴加入稀释的DNA溶液中，轻轻混匀后将所得的转染工作液共50 μL在室温放置15 min，然后逐滴加到500 μL细胞培养液中，轻轻混匀细胞培养液，置37 ℃ 5% CO2条件下培养。转染后6 h更换为新鲜的含10%胎牛血清的DMEM培养液。转染24 h后，收取细胞上清液和细胞蛋白进行相应的检测。
1.2.6 蛋白表达验证 待HEK293T细胞转染24 h后, 弃掉细胞培养基，用PBS洗3遍，加入含1 mmol·L-1 PMSF的RIPA裂解液提取细胞总蛋白，通过BCA法蛋白定量后，加入上样缓冲液混合后100 ℃水浴10 min，取变性蛋白20 μL上样，通过10% SDS-PAGE电泳分离，先80 V后120 V恒压电泳后，蛋白电泳产物转印至0.45 μm的PVDF膜上，300 mA恒流电转90 min, QuickBlockTM Western封闭液封闭30 min，分别加入Flag一抗、MYC一抗和GAPDH一抗置于4 ℃孵育过夜。次日，配制TBST溶液洗3次，每次8 min，分别加入HRP标记的山羊抗兔和山羊抗鼠的二抗，置于摇床上孵育1 h。孵育结束后再用TBST溶液洗3次，每次8 min。ECL发光，在光化学成像仪内进行成像显色，检测目的蛋白电泳条带。
1.2.7 质粒共转染HEK293T细胞 (6~8)×104个·孔-1接种于24孔板内，待细胞贴壁长至40%~60%为宜；两种质粒共转染时所用的量分别如下：pCMV-MYC-Caspase-4 600 ng、p3XFLAG-CMV-hGSDMD-FL 600 ng。转染24 h后离心取上清，CytoTox 96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay检测LDH的释放情况。
1.2.8 PI(碘化丙啶)染色步骤 HEK293T细胞转染24 h后弃掉细胞培养基，用500 μL预冷的1×PBS洗2遍弃上清，加入200 μL PI染色试剂(工作浓度2.5 μg·mL-1)避光孵育15 min后，再用500 μL预冷的1×PBS洗2遍，最后用荧光倒置显微镜观察PI染色情况。
1.2.9 数据分析 数据采用GraphPad Prism 7.0软件进行分析，计量组比较采用t检验；**.P＜0.01；***.P＜0.001。
2 结果 2.1 Caspase-4、hGSDMD-FL和hGSDMD-p30基因扩增以合成的cDNA为模板，PCR扩增Caspase-4、hGSDMD-FL和hGSDMD-P30基因，经琼脂糖凝胶电泳可见扩增产物大小和预期大小一致(图 1)。
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M. DL2000 DNA相对分子质量标准；1.Caspase-4；2. hGSDMD-FL；3.hGSDMD-p30基因 M. DL2000 DNA marker; 1.Caspase-4; 2. hGSDMD-FL; 3.hGSDMD-p30 gene 图 1 PCR扩增结果 Fig. 1 Electrophoresis pattern of PCR amplification products |
重组产物分别转化至Trans5α化学感受态细胞内，挑取单克隆菌落培养后提取质粒，分别进行质粒双酶切验证：①重组质粒pCMV-MYC-Caspase-4 (图 2A)使用SalⅠ和NotⅠ进行双酶切，pCMV-MYC-Caspase-4酶切后大小分别为3 776和1 134 bp；②重组质粒p3XFLAG-CMV-hGSDMD-FL (图 2B)使用HindⅢ和EcoRⅠ双酶切，p3XFLAG-CMV-hGSDMD- FL酶切后大小分别为4 709和1 455 bp；③重组质粒pcDNA3.1-hGSDMD-p30-MYC (图 2C)使用HindⅢ和ApaⅠ双酶切，pcDNA3.1-hGSDMD-p30-MYC双酶切后大小分别为5 380和825 bp。酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳检测结果如图 2D，结果表明各个重组质粒通过酶切后均和预期大小一致，通过生工测序结果进一步证明了各个重组质粒均构建成功。
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A. pCMV-MYC-Caspase-4表达质粒结构示意图; B. p3XFLAG-CMV-hGSDMD-FL表达质粒结构示意图; C. pcDNA3.1-hGSDMD-p30-MYC表达质粒结构示意图; D.重组质粒酶切电泳鉴定图(M. DL5000 DNA相对分子质量标准；1.pCMV-MYC-Caspase-4；2. p3XFLAG-CMV-hGSDMD-FL；3.pcDNA3.1-hGSDMD-p30-MYC) A. Schematic diagram of pCMV-MYC-Caspase-4; B. Schematic diagram of p3XFLAG-CMV-hGSDMD-FL; C. Schematic diagram of pcDNA3.1-hGSDMD-p30-MYC; D. Electrophoresis pattern of expression plasmid(M. DL2000 DNA marker; 1.pCMV-MYC-Caspase-4; 2. p3XFLAG-CMV-hGSDMD-FL; 3.pcDNA3.1-hGSDMD-p30-MYC) 图 2 各表达质粒的构建与鉴定 Fig. 2 Electrophoresis pattern of expression plasmids digestion identification |
将构建成功的pCMV-MYC-Caspase-4、p3XFLAG-CMV-hGSDMD-FL及pcDNA3.1-hGSDMD-p30-MYC重组质粒分别转染到HEK293T细胞中，转染24 h后收取细胞蛋白，通过Western blot验证各重组质粒是否构建成功。各融合蛋白的大小分别为：pCMV-MYC-Caspase-4 45.7 ku，p3XFLAG- CMV-hGSDMD-FL 55.6 ku，pcDNA3.1-hGSDMD-p30-MYC 32.0 ku。结果如图 3所示。证明重组质粒pCMV-MYC-Caspase-4、p3XFLAG-CMV-hGSDMD-FL均在HEK293T细胞内成功表达。但是，无法检测到GSDMD-p30的表达，这是该蛋白可能对宿主细胞产生毒性作用[12]所致。
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图 3 Western blot检测各融合蛋白在293T细胞中的表达 Fig. 3 Recombinant vectors in HEK293T cells detected by Western blot |
为了在HEK293T细胞中构建非经典炎症小体激活介导的细胞焦亡模型，根据研究报道，细胞焦亡可通过检测细胞上清LDH的释放、荧光观察PI染色情况、GSDMD有无被切割为有活性的N端p30片段等手段确定。将p3XFLAG-GSDMD-FL(600 ng)、MYC-Caspase-4(600 ng)这2个构建成功的重组质粒共转染于HEK293T细胞中，通过检测上清中LDH的分泌情况、Western blot检测Gasdermin-D(GSDMD)切割水平及荧光观察PI染色情况确定非经典细胞焦亡模型是否构建成功。结果可见，Caspase-4与N端标签的GSDMD全长共转染或者单独转染C端标签的GSDMD-p30均可导致LDH的显著上升(**. P < 0.01; ***. P < 0.001)，而单独转染GSDMD全长或者Caspase-4组无明显变化(图 4)，荧光显微镜观察共转染组可见明显的PI染色(图 5)，通过Western blot检测发现Caspase-4可以将全长的GSDMD切割为N端的p30片段，这与LDH和PI的结果相一致(图 4)。此外，GSDMD-N端p30阳性对照和共转染的结果类似，细胞均表现出了显著的焦亡现象(图 4)。因此，以上结果均表明，成功构建了非经典细胞焦亡体外模型。
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图 4 各质粒转染后LDH的释放量及WB验证表达情况 Fig. 4 Production of LDH and the expression of proteins measured by Western blot |
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图 5 各质粒转染后PI染色情况 Fig. 5 PI staining observed by fluorescence microscope |
细胞焦亡是一种依赖于Caspase-1和Caspase-4/5/11并且具有促炎性质的程序性细胞死亡，是机体在清除病原感染和受到内源危险信号刺激时的重要免疫防御反应[13-14]。
2015年，邵峰课题组通过CRISPR/Cas9方法进行全基因组筛选，确定了GSDMD蛋白是所有炎性Caspase的直接底物，是细胞焦亡的真正执行者[8]。同期Nature的另外一项独立研究通过化学诱变的小鼠突变体筛选，发现非典型炎性小体信号传导是通过人Caspase-4/5(小鼠Caspase-11)裂解gasdermin D，最终都导致切割后的N端GSDMD在细胞膜内部打孔，导致细胞肿胀和焦亡[9, 15]。与典型细胞焦亡相比，最近发现的非典型细胞焦亡在其机制和病理生理意义上仍缺乏研究。
在验证蛋白表达过程中，作者的研究表明重组质粒pCMV-MYC-Caspase-4、p3XFLAG-CMV-hGSDMD-FL均能在HEK293T细胞内成功表达，研究报道GSDMD-p30引发显著的细胞死亡[8-9]，与Lei等[12]的研究一致，作者通过多次试验也无法检测到GSDMD-p30的表达，这可能与GSDMD-p30结构域对宿主细胞产生的剧烈毒性作用[12]有关。
4 结论本研究通过构建能够诱导非经典细胞焦亡的重组质粒，经Western blot验证无误后共转染至HEK293T细胞中，通过检测LDH的释放，GSDMD全长片段是否被切割以及PI染色的情况表明成功在体外构建了非经典细胞焦亡模型，为今后细胞焦亡机制的深入研究奠定了基础。
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