2. 中国农业大学动物科技学院, 北京 100193
2. College of Animal Science and Technology, China Agricultural University, Beijing 100193, China
近年来，动脉粥样硬化、冠心病等心脑血管疾病的发病率和死亡率不断上升，而过高的血清胆固醇水平被认为是诱发心脑血管疾病的主要因素之一，血清总胆固醇水平直接影响人体健康[1]。鸡蛋是常见的动物性蛋白类食物，研究表明，正常摄入鸡蛋不会影响人体的血清胆固醇水平，但是由于鸡蛋黄中胆固醇含量较高，对于高血脂、高胆固醇人群，仍需要严格控制鸡蛋的摄入量[2]，因此，开发低胆固醇鸡蛋具有较大应用价值。近年来，微生态制剂在蛋鸡养殖中的应用愈加广泛，但功能效果不尽相同。陈继发等[3]在蛋鸡基础饲粮中添加枯草芽孢杆菌和蒙脱石显著提高了蛋鸡的产蛋率和日产蛋量；龙爱琳等[4]在蛋鸡基础饲粮中添加植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌显著提高了蛋壳平均厚度和蛋黄相对重；Mohan等[5]报道，蛋鸡饲粮中添加嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌和双歧杆菌的复合益生菌显著降低了蛋黄胆固醇含量。本实验室前期从藏灵菇中筛选出一株具有较强耐受胃肠道逆环境能力的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)KL1，经肉鸡动物试验证明具有降低血清胆固醇的作用[6-7]。
本研究旨在开发一种功能全面的微生态制剂，不仅能够有效提升蛋鸡生产性能，而且能产出高值化的低胆固醇鸡蛋。本研究深入探讨了KL1微生态制剂对蛋鸡生产性能、蛋品质及鸡蛋中胆固醇含量的影响，为该微生态制剂在蛋鸡养殖和功能性食品开发中的应用提供实践指导。
1 材料与方法 1.1 菌株由本课题组从藏灵菇中筛选的高产胆盐水解酶的专利菌株副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)KL1，菌株保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No. 11533。
1.2 试验动物120只30周龄健康状态良好且产蛋率接近的农大3号矮小蛋鸡由中国农业大学动物科技学院动物遗传育种实验室提供。
1.3 基础饲粮蛋鸡的基础饲粮组成及主要营养水平见表 1，由北京中农盛达科技有限公司提供。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets(air-dry basis) |
培养基(改良MRS培养基[8-9])：葡萄糖20.0 g、胰蛋白胨6.25 g、水解酪蛋白胨6.25 g、牛肉膏10.0 g、酵母浸粉5.0 g、柠檬酸三铵2.0 g、乙酸钠5.0 g、磷酸氢二钾1.53 g、硫酸镁0.58 g、硫酸锰0.19 g、吐温-80 1.0 mL、水1 L，pH 6.5，115 ℃灭菌20 min，固体培养基则加入1.5%的琼脂。
取副干酪乳杆菌KL1甘油保藏菌种，经活化、扩大培养、高密度发酵、离心浓缩和冻干后得到KL1微生态制剂。以改良MRS琼脂培养基倾注平板培养法测定冻干菌粉的活菌数为5.4×1010 CFU·g-1，10倍递增稀释至试验所需浓度。
1.5 蛋鸡的饲养管理与分组采用三层阶梯式蛋鸡笼养鸡舍，每日人工光照16 h，纵向负压通风，乳头式饮水器，人工喂料捡蛋。试验鸡随机分为低、中、高剂量试验组和对照组，每组设5个重复，每个重复有蛋鸡6只。对照组只饲喂基础饲粮，试验组在基础饲粮中分别添加低、中、高剂量菌剂，摄入活菌数分别为105、106、107 CFU·(只·d)-1, 当日混匀后加入蛋鸡料槽中[10]。饲喂添加微生态制剂饲料的时间为每天09:00，提前12 h将料槽清空禁食，确保试验鸡早晨尽快将含菌饲料摄入，避免菌体在饲料中繁殖，以保证每日菌剂摄入量一致。连续饲喂10周。
1.6 测定指标及方法1.6.1 生产性能指标 试验第10周，以每重复组1周为单位结料与称重，计算每只鸡平均日耗料量和产蛋期饲料转化比，以天为单位统计每只鸡每天的产蛋数、产蛋重量，并计算每日饲养日产蛋率及平均蛋重。
1.6.2 鸡蛋品质测定 试验第10周末，每个重复采集3枚(每组15枚)当日新鲜鸡蛋样品，用于蛋品质测定。
蛋重用BT2202S电子天平秤量，单位g，精确到0.01 g；蛋形指数=纵径/横径×100%，用蛋形指数测定器(日本富士平工业株式会社)分别测量蛋的纵径和最大横径，精确到0.1 cm；蛋壳强度用EF0422蛋壳强度测定仪(以色列ORKA食品科技有限公司)测定，精确到0.001 kg·cm-2；蛋壳厚度用ETG-1061A蛋壳厚度测量仪(日本Robotmation公司)测定蛋壳钝端、中部、锐端的蛋壳厚度，求平均值，精确到0.01 mm；蛋白高度、蛋黄色泽、哈氏单位用EMT-7300新一代多功能蛋品质分析仪(日本Robotmation公司)测定；蛋壳相对重=蛋壳重/蛋重×100%；蛋黄相对重=蛋黄重/蛋重×100%，用蛋黄分离器将蛋清和蛋黄完全分离，收集蛋黄称重。
1.6.3 蛋鸡血清指标测定 试验第10周末，每个重复随机抽取2只试验鸡进行翅下静脉采血，每只采血2 mL，室温静置凝固后离心，取血清至离心管中，冷藏保存备用。
各组样品的血清钙(Ca)、血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)指标委托北京中同蓝博临床检验所有限公司进行检测。
1.6.4 蛋黄中胆固醇含量测定 利用CLASS-VP高效液相色谱仪(日本岛津)、ODS-100Z 4.6*150色谱柱(上海生物科技有限公司)进行测定，以浓度为0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 g·L-1的胆固醇标准溶液制定标准曲线，进行线性回归，得到回归方程：y = 2 973 833.64 x，R2= 0.999 5。将检测值峰面积x带入回归方程，求得蛋黄样品制备液的胆固醇浓度[11]。
1.7 统计方法数据采用SPSS 19.0软件进行单因子方差分析，邓肯氏法进行多重比较检验，以P < 0.01(差异极显著)，P < 0.05(差异显著)作为差异显著性判断标准，数据结果用“平均值±标准差”的形式表示。
2 结果 2.1 副干酪乳杆菌KL1微生态制剂对蛋鸡生产性能的影响由表 2可知，试验第10周，与对照组相比，低剂量组的产蛋重量、饲料转化比和饲养日产蛋率均有小幅度提高(P>0.05)；中剂量组的产蛋重量、饲养日产蛋率分别显著提高了4.44%(P < 0.05)和2.87%(P < 0.05)，饲料转化比显著降低了5.16%(P < 0.05)；而高剂量组的平均日耗料量显著下降(P < 0.05)，产蛋重量(P < 0.01)、产蛋数(P < 0.05)及饲养日产蛋率(P < 0.01)与对照组相比也显著或极显著降低；而各试验组与对照组相比平均蛋重均无显著差异(P>0.05)。由此可见，在蛋鸡饲粮中添加不同剂量的副干酪乳杆菌KL1微生态制剂对其生产性能的影响有一定差异，中剂量组效果最佳。
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表 2 试验第10周蛋鸡生产性能(x±s, n=5) Table 2 The production performance of laying hens in the 10th week of the experiment(x±s, n=5) |
由表 3可知，饲喂试验第10周，各试验组间的蛋形指数、蛋壳相对重、蛋白高度、哈氏单位和蛋黄色泽较对照组无显著差异(P>0.05)。与对照组相比，低、中剂量组的蛋壳强度分别显著提高了10.81%(P < 0.05)和12.07%(P < 0.05)，高剂量组极显著提高了21.95%(P < 0.01)；低、中、高剂量组的蛋壳厚度分别提高了3.13%(P>0.05)、9.38%(P < 0.05)、9.38%(P < 0.05)；各试验组蛋黄相对重分别极显著提高了5.03%(P < 0.01)、5.25%(P < 0.01)、5.21%(P < 0.01)。由此可见，副干酪乳杆菌KL1能有效提高蛋壳强度、蛋壳厚度和蛋黄相对重，其中，高剂量的KL1微生态制剂效果最好。
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表 3 副干酪乳杆菌KL1微生态制剂对蛋鸡蛋品质的影响(x±s, n=15) Table 3 Effect of Lactobacillus paracasei KL1 preparation on egg quality(x±s, n=15) |
由表 4可知，饲喂试验第10周，与对照组相比，低、中、高剂量组蛋黄胆固醇含量分别极显著降低了5.69%(P < 0.01)、9.42%(P < 0.01)、9.80%(P < 0.01)；各试验组血清钙水平分别显著提高了8.47%(P < 0.05)、9.55%(P < 0.05)、9.24%(P < 0.05)；各试验组血清总胆固醇含量分别极显著降低了30.57%(P < 0.01)、32.90%(P < 0.01)、32.90%(P < 0.01)；各试验组蛋鸡血清甘油三酯含量均极显著降低，分别降低了34.04%(P < 0.01)、36.55%(P < 0.01)、39.17%(P < 0.01)；中、高剂量组血清高密度脂蛋白胆固醇含量分别显著和极显著提高了12.50%(P < 0.05)和19.44%(P < 0.01)；高剂量组蛋鸡血清低密度脂蛋白胆固醇含量显著降低了23.73%(P < 0.05)。由此可见，副干酪乳杆菌KL1在降低蛋黄胆固醇、血清总胆固醇、血清甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇含量，提升血清钙水平及高密度脂蛋白胆固醇含量方面表现出良好效果，其中，高剂量的KL1微生态制剂效果最好，中剂量组次之。
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表 4 副干酪乳杆菌KL1微生态制剂对蛋黄和血清胆固醇的影响(x±s，n=10) Table 4 Effect of Lactobacillus paracasei KL1 preparation on the yolk and serum cholesterol of the egg(x±s, n=10) |
在禽畜饲料中添加微生态制剂不仅可以改善饲料的适口性，还可以有效增强动物机体消化能力，提高饲料转化率，进而促进家禽增重，改善肠道菌群平衡，增强动物机体的免疫力和抗病力，降低死亡率，提高产品品质[12-14]。邓文等[15]研究表明，在蛋鸡饲粮中添加地衣芽孢杆菌能提高蛋鸡平均日耗料量，进而提高蛋鸡饲养日产蛋率，但是，平均日耗料量过高会导致多余的能量在蛋鸡输卵管壁产生脂肪堆积，影响蛋的形成[16]；彭豫东等[17]将干酪乳杆菌和酿酒酵母菌混合，制成微生态制剂添加到蛋鸡饲粮中，显著提高了蛋鸡饲养日产蛋率和平均蛋重，产蛋期饲料转化比也显著下降；张利环等[18]将干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌和双歧杆菌分别按比例混合并于牛乳中发酵后添加在肉雏鸡饮用水中，试验组饲料转化比显著提高。而本研究通过10周的饲养试验，中剂量组与对照组相比，蛋鸡饲养日产蛋率有显著提高，产蛋期饲料转化比亦有显著降低，表明在基础饲粮中添加副干酪乳杆菌KL1微生态制剂可以有效地促进蛋鸡产蛋性能，促进机体对饲料营养成分的消化利用[19-20]，进而降低饲料转化比，与前人研究相一致[21-24]。在基础饲粮中添加低、中、高剂量的KL1微生态制剂均能极显著降低蛋鸡血清胆固醇和甘油三酯的含量，可有效缓解蛋鸡输卵管壁脂肪堆积，可能是饲养日产蛋率升高的重要原因之一。而高剂量组的饲养日产蛋率和产蛋重量有所下降，可能是由于KL1微生态制剂的添加剂量较高，大幅降低了血清中胆固醇和甘油三酯的含量，减少了蛋黄胆固醇等物质的沉积，阻碍了蛋黄的形成，进而造成饲养日产蛋率下降。高剂量组平均日耗料量显著降低，可能是过高剂量微生态制剂的添加影响了鸡只的自由采食，后续将继续探究在饮水线中添加微生态制剂的效果。
3.2 副干酪乳杆菌KL1微生态制剂对蛋壳质量与鸡蛋营养价值的影响蛋壳质量是评定蛋品质的重要依据之一，包括蛋壳厚度、蛋壳强度和蛋壳相对重等多项指标，在鸡蛋运输和销售过程中，良好的蛋壳质量可减少其破损率，从而降低经济损失[25-26]。前人研究表明，在蛋鸡饲料中添加枯草芽孢杆菌制成的微生态制剂，可显著提高鸡蛋蛋壳厚度、蛋壳强度和蛋壳相对重，显著降低破软蛋率，有效提高蛋壳质量[27]。Mohan等[28]发现，在蛋鸡日粮中添加微生态制剂会使蛋壳厚度增加，减少薄壳蛋，这可能是因为微生态制剂促进了对钙等矿物元素的吸收利用。本研究中，各试验组的血清钙水平均有显著提升，且中、高剂量组的蛋壳厚度和蛋壳强度与对照组相比有显著提高，与前人研究一致。KL1微生态制剂在肠道中代谢产生乳酸，可降低肠道pH，促进钙的消化利用，进而提高了血清钙水平，而血清钙的含量决定了蛋壳的脆性、厚度等性状，所以在基础饲粮中添加KL1微生态制剂也能有效提高蛋鸡蛋壳质量。
蛋黄是鸡蛋营养物质的主要载体。蛋黄相对重是衡量鸡蛋营养价值的一项重要指标，蛋黄相对重越大，代表鸡蛋营养水平越高。白子金等[29]试验表明，蛋鸡饲料中添加复合微生态制剂可降低鸡蛋的蛋白比率，提高蛋黄比率，并可改善蛋壳厚度和蛋形指数，对鸡蛋的哈氏单位和蛋黄色泽也表现出良好的改善效果。本研究中，各试验组的蛋黄相对重均有极显著提高，与前人研究相符，表明副干酪乳杆菌KL1微生态制剂能有效提高鸡蛋的营养价值。
3.3 副干酪乳杆菌KL1微生态制剂对血清和蛋黄胆固醇水平的影响近年来，国内外用于研究降低胆固醇的益生菌菌种主要有乳杆菌属(如干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌等)和双歧杆菌属等，由这些菌种制成的微生态制剂具有降低血清胆固醇等多种生理功能[30-31]。郑学斌等[32]研究发现，饲喂添加了枯草芽孢杆菌、乳酸菌及其代谢产物等产酶益生素的蛋鸡，其产的鸡蛋中脂肪含量明显降低，且试验组鸡蛋中胆固醇含量也比空白对照组显著降低了34.86%，蛋白含量显著提高了22.06%。Mohan等[33]和王翔宇[34]的研究结果与此相似。本研究中，添加饲喂副干酪乳杆菌KL1微生态制剂的试验组与对照组相比，蛋鸡血清胆固醇含量均显著降低，且鸡蛋蛋黄中胆固醇含量极显著降低，表明该微生态制剂也具有良好的降胆固醇功效。产生这种效果的原因除了菌体本身的同化吸收作用外[35-36]，副干酪乳杆菌KL1菌株分泌的高活力胆盐水解酶在肝肠循环中能够将结合态胆盐降解为游离胆酸，而游离胆酸与胆固醇结合形成沉淀复合物后可排出体外，从而降低了蛋鸡血清胆固醇的含量[37-38]。此外，中、高剂量组的蛋鸡血清中HDL的含量显著上升，可有效促进胆固醇在机体中的逆向运转，从而达到降低血清胆固醇含量的效果[39]。逆向运转是指周围细胞胆固醇转移到肝后的转化与清除过程，机体细胞中的胆固醇在HDL分子中不断聚集并内酯化为胆固醇酯，通过血液循环到达肝，最终被清除出体外。
蛋鸡血清中的胆固醇大部分被转运到卵巢的卵母细胞，在卵母细胞溶酶体的作用下降解为游离胆固醇，最终沉积在蛋黄中，所以蛋黄胆固醇含量会随着蛋鸡血清中胆固醇含量的降低而减少[40]。由此可见，在基础饲粮中添加副干酪乳杆菌KL1微生态制剂可以降低蛋鸡血清胆固醇含量，从而降低蛋黄胆固醇水平。
4 结论综上所述，在饲粮中添加副干酪乳杆菌KL1微生态制剂可显著提高蛋鸡生产能力和蛋壳品质，降低鸡蛋中胆固醇含量。在降低血清及蛋黄胆固醇含量方面，高剂量组效果最佳，中剂量组次之；而提高蛋鸡生产能力和蛋壳品质方面，中剂量组效果最佳。总体来看，中等剂量106CFU·(只·d)-1的副干酪乳杆菌KL1微生态制剂效果最佳，在低胆固醇鸡蛋的生产中具有良好的应用价值。
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