2. 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室 实验动物与比较医学创新团队 国家禽类实验动物资源库, 哈尔滨 150069
2. National Poultry Laboratory Animal Resource Bank, Innovative Team for Laboratory Animals and Comparative Medicine, State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology, Harbin Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150069, China
猪主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)也叫猪白细胞抗原(swine lymphocyte antigen, SLA)，它包含3个主要的基因簇(Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类)，其中Ⅱ类基因簇包含较多基因，但只有SLA-DQ和SLA-DR基因具有功能作用且具有高度的多态性[1-3]。SLA Ⅱ类抗原主要表达在专职性抗原提呈细胞表面，主要负责提呈外源性抗原给CD4+辅助性T细胞从而引起机体产生免疫应答[4-5]。SLA Ⅱ类分子功能的实现需要其编码基因按照严格的细胞特异性和定量调控模式进行转录调控，这个复杂的基因表达谱几乎完全由一个主调控因子控制，称为SLA Ⅱ类分子的反式激活因子CIITA(major histocompatibility class Ⅱ transactivator)[6-8]。它通过蛋白的羧基端结合到SLA Ⅱ类分子启动子上的多个转录因子上相互作用，成为这些转录因子的支架，共同发挥对SLA Ⅱ类分子表达的调控作用[9-11]。CIITA于1993年首次被发现，一名患者主要因为CIITA基因的功能缺陷等原因导致不能正常编码MHC Ⅱ类分子，致使该患者无法正常进行免疫调控[12-13]。CIITA属于NOD样受体(NOD-like receptors, NLRs)蛋白家族的一员，其蛋白表达具有组织特异性，仅在胸腺上皮细胞、活化的细胞和专职的抗原提呈细胞中表达，也可进行诱导性表达，在其他一些细胞中，可用IFN-γ来刺激CIITA的表达。据报道，人CIITA的组成可分为N端富含酸性氨基酸区、脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸(P/S/T)的富集区、GTP结合域(GTP-binding domain, GBD)和末端富含亮氨酸的重复结构域(leucine rich repeat, LRR)[14]，每一个区域都有特定的功能，前两者主要起到转录激活功能[15]。猪CIITA组成与人类似，但失去了整个GTP绑定区。此外，猪CIITA在其自然转录过程中可发生可变剪接，这是调节基因表达和产生蛋白质组多样性的重要机制，即通过不同的剪接方式使得一个mRNA前体产生不同mRNA突变体，造成CIITA基因核苷酸插入/缺失，从而使编码的氨基酸序列提前终止或突变，由于这种CIITA基因剪接突变体的存在，使其蛋白功能受到影响，不能正确启动SLA Ⅱ类分子的表达，致使宿主不能发挥正常的抗原提呈功能，从而可能会进一步影响实验猪对疾病表现出的抗性或易感性。实验猪是畜禽疫病防控研究中重要的模式动物，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所保存有遗传背景清晰且已排除了14种病原微生物的SPF(specific pathogen free, SPF)大白猪和长白猪群体[16-18]，且在重大疫病防控研究中起到了至关重要的作用。目前，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所在我国非洲猪瘟疫苗研究中取得了关键性的进展，其中标准化的实验猪也是推进研究工作的重要原因之一。
目前，国内外关于CIITA基因的研究主要集中在人和斑马鱼上，对猪CIITA基因的研究较少，根据Ensemble数据库及相关文献的搜索发现，猪CIITA基因可能存在多种剪接突变体，因此，本研究对SPF大白猪和长白猪CIITA基因进行可变剪接分析，研究CIITA剪接突变体在不同猪组织中的表达情况，为深入探讨猪CIITA基因的生物学功能及培育标准化的实验猪提供遗传学参考依据。
1 材料与方法 1.1 试验动物随机采集中国农业科学院哈尔滨兽医研究所保存5周龄的8头SPF大白猪和7头SPF长白猪的肺组织(许可证号：SCXK(黑)2015-004)，样本迅速放入－80 ℃冰箱保存备用。
1.2 主要仪器与试剂1.2.1 主要试剂 KOD-Plus-Neo购于东洋纺(上海)生物科技有限公司；pEASY-Blunt载体购于北京全式金生物技术有限公司；PrimeScriptTM Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ、胶回收试剂盒购于大连TaKaRa公司；RNA提取试剂盒购于博日科技有限公司。
1.2.2 主要仪器 DYY-6C型稳压电泳仪(六一仪器厂, 北京)；全自动凝胶成像分析系统(Alpha Innotech, 美国)；梯度PCR仪(Bio-Rad, 美国)；实时荧光定量PCR仪(QuantStudioTM5)。
1.3 试验方法1.3.1 肺组织总RNA的提取和cDNA的合成 取0.1 g肺组织加入少量液氮进行研磨，研磨充分后，用博日RNA提取试剂盒提取总RNA，经紫外分光光度计测量其浓度及纯度，OD260 nm/OD280 nm在1.8~2.0范围内的总RNA用于后续研究。随后，使用特异性引物CIITA-R，用PrimeScriptTM Ⅱ1 st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，宝生物(大连)有限公司)反转录为cDNA。合成的cDNA置于－20 ℃冰箱保存备用。
1.3.2 CIITA的扩增和测序 以已知猪CIITA序列(GenBank登录号：AY084053)为参考序列，用NCBI Primer- BLAST和Primer primer5.0软件设计1对特异性引物CIITA-F/R(表 1)，对cDNA进行扩增，扩增片段包含CDS区，预期扩增大小约1 698 bp。引物由库美生物科技公司合成。PCR反应体系为50 μL：KOD-Plus-Neo(1.0 U·μL-1) 1 μL，10×PCR Buffer 5 μL，dNTPs (2 mmol·L-1) 5 μL，MgSO4(25 mmol·L-1) 3 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，灭菌蒸馏水32 μL。PCR反应条件为：94 ℃预变性2 min；98 ℃变性30 s，63 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min，共35个循环；68 ℃延伸10 min。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段，用紫外分光光度计测定回收DNA的浓度，将其送库美生物科技公司进行测序。测序获得杂合子后，将回收片段与pEASY-Blunt Cloning kit载体连接，转化大肠杆菌DH5α培养，菌液PCR鉴定后，筛选阳性克隆送库美生物技术公司进行测序。
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表 1 引物信息 Table 1 Primer information |
1.3.3 CIITA基因序列的生物信息学分析 利用Chromas 2对测序获得的原始序列进行核对编辑，编辑后序列通过MEGA 7.0建立数据库；MegAlign进行核苷酸与氨基酸比对；采用MEGA 7.0对比人、鼠、牛、斑马鱼、斑点叉尾鮰、恒河猴、绵羊、鸡CIITA基因编码的氨基酸序列(表 2)，分析序列同源性，构建系统发育树；同时用Ensemble (http://asia.ensembl.org/index.html)比较8个猪品种预测的CIITA不同剪切体的核苷酸序列相似性，构建其氨基酸序列进化树，各个品种不同转录本的ID及GenBank登录号见表 3；运用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html) 对蛋白质二级结构进行预测；运用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)对蛋白质三级结构进行预测。
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表 2 不同物种CIITA序列信息 Table 2 CIITA sequence information of different species |
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表 3 不同品种猪CIITA不同转录本的ID及GenBank登录号 Table 3 ID and GenBank accession number of different CIITA transcripts of different pig breeds |
1.3.4 CIITA基因在SPF长白猪不同组织中的表达特性 根据获得的CIITA序列，选取2头携带CIITA-A/CIITA-C和CIITA-B/CIITA-C的SPF长白猪，颈动脉放血致死后，迅速取心、肝、脾、肺、肾、甲状腺、胸腺和脊髓样本，用于总RNA的提取，反转录为cDNA后，利用qRT-PCR方法检测各组织中CIITA剪接突变体的表达情况，引物信息见表 1。反应总体积为20 μL：上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.25 μL，cDNA 1 μL, SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，ROX 0.4 μL，RNAase Free ddH2O补至20 μL。反应程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃1 min，95 ℃ 30 s制作熔解曲线。每个样本重复3次。
1.3.5 数据处理 应用2-ΔΔCT法分析qRT-PCR检测结果，结果以“平均值±标准误”表示。采用SPSS version 19.0软件单因素方差分析比较CIITA基因在不同个体和不同组织中的表达差异，用Duncan’s法进行多重比较；采用独立样本T检验进行分析；p < 0.05表示差异显著；p < 0.01表示差异极显著。
2 结果 2.1 猪CIITA基因可变剪接体的鉴定及特征分析提取SPF大白猪和长白猪肺组织总RNA，反转录为cDNA，PCR扩增后分别获得1 700 bp左右的条带(图 1A)，表明成功获得CIITA基因。分析15头SPF大白猪和长白猪CIITA基因测序结果(图 1B)，部分猪出现杂合子，克隆测序后，共获得了猪CIITA基因CDS区的3种可变剪接体，分别命名为CIITA-A、CIITA-B和CIITA-C，获得GenBank登录号为MN_814329、MN_814330和MN_814331，SPF猪CIITA的基因型见表 4。比较3个剪接突变体的核苷酸(图 2A)和氨基酸序列(图 2B)，结果CIITA-C与参考序列相似性最高，核苷酸同源性为99.6%，氨基酸同源性为99.5%。相对于CIITA-C，CIITA-A和CIITA-B在Exon 11同一位置分别缺失了40和199 bp，致使终止密码子提前，从而导致编码的氨基酸分别缺失253和238个氨基酸残基。
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M. DNA相对分子质量标准；1、2. CIITA基因扩增结果；A图中，框内为猪CIITA基因扩增结果 M. DNA marker; 1, 2. CIITA gene amplification results; the bands in box represents the amplification products of CIITA gene in figure A 图 1 猪CIITA基因的PCR扩增结果(A)和测序结果(B) Fig. 1 PCR amplification results (A) and sequencing results (B) of porcine CIITA gene |
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表 4 SPF大白猪和长白猪CIITA基因剪接突变体存在形式 Table 4 CIITA splicing mutants of SPF Yorkshire and Landrace pigs |
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A. 猪CIITA核苷酸序列比对结果，阴影区域内为缺失片段；B. 猪CIITA氨基酸比对结果 A. The nucleotide sequence alignment result of porcine CIITA, and the shadow regions are the deletion fragments; B. The amino acid alignment result of porcine CIITA 图 2 猪CIITA核苷酸与氨基酸序列比对结果 Fig. 2 Aligning results of porcine CIITA nucleotide and amino acid sequences |
将获得的猪CIITA-C CDS序列与人、小白鼠、牛、斑马鱼、斑点叉尾鮰、恒河猴、绵羊和鸡的CIITA核苷酸和氨基酸序列进行同源性比较，发现SPF大白猪和长白猪与绵羊具有较高的同源性，达到81.1%以上。与斑点叉尾鮰的同源性较小，仅为24.9%。利用MEGA7.0软件使用Neighbor-Joining法对CIITA基因的编码氨基酸序列进行聚类分析，发现对于CIITA，猪与绵羊和牛具有较近的亲缘关系(图 3)。
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图 3 不同物种CIITA基因遗传进化树 Fig. 3 The genetic evolution tree of CIITA gene in different species |
用MEGA7.0软件对8个不同品种猪的CIITA不同转录本的CDS区进行序列比对与遗传进化分析，发现不同猪品种CIITA转录本具有一定的保守性，其同源性为65%~100%。SPF大白猪和长白猪中获得的CIITA-A、CIITA-B和CIITA-C与landrace-206、jinhua-206、pietrain-207、mei-shan-206、rongchang-206、bamei-206、pietrain-206和usmarc-201聚为一支，表明SPF大白猪和长白猪与usmarc、皮特兰、巴美猪、荣昌猪、梅山猪和金华猪亲缘关系较近(图 4)。
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图 4 不同猪品种CIITA不同剪接突变体的遗传进化分析 Fig. 4 Genetic evolution analysis of different splicing mutants of CIITA in different pig breeds |
运用SOPMA在线预测猪CIITA-A、CIITA-B和CIITA-C编码蛋白的二级结构元件，发现3个剪接突变体中α螺旋(alpha helix)、β折叠(beta turn)、无规则卷曲(random coil)和延长片段(extended strand)4种二级结构所占比例比较接近(表 5)。但是利用DNA star软件子程序Protean对CIITA-A、CIITA-B和CIITA-C进行了结构域的预测，发现由于CIITA-A和CIITA-B中终止密码子的提前致使编码蛋白的结构域受到了剪接的影响，均缺失了末端富含亮氨酸的4个重复结构域(LRRs)(图 5)。利用SWISS-MODEL在线预测发现，由于Exon 11部分核苷酸的缺失以及终止密码子的提前，使得蛋白质的三级结构发了明显的改变(图 6)。
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表 5 猪CIITA不同可变剪切体氨基酸序列预测信息 Table 5 The prediction information of amino acid sequences of different variants of CIITA |
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方框区域为CIITA-A与CIITA-B共同缺失部分 The box area is the common missing part of CIITA-A and CIITA-B 图 5 CIITA与两种突变体结构与预测 Fig. 5 The structure and prediction of CIITA and two mutants |
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图 6 猪CIITA蛋白三级结构预测 Fig. 6 The prediction of tertiary structure of CIITA protein |
利用qRT-PCR方法检测猪各组织中CIITA剪接突变体的表达情况，结果发现，CIITA-A、CIITA-B和CIITA-C在各个主要组织中均有表达。在CIITA-A/CIITA-C猪的不同组织样本中(图 7A)，CIITA-A与CIITA-C表达量趋势一致，均在脾中表达量最高，其次是脊髓、肾、肺、甲状腺、肝、胸腺，在心中表达最低。除了肺外，CIITA-C的表达量均高于CIITA-A，在肝中差异极显著(p < 0.001)。在CIITA-B/C猪不同组织样本中(图 7B)，CIITA-B在肺中表达量最高，CIITA-C在脾中表达量最高，同样在心中表达量最低；除了脊髓外，在其他组织中CIITA-B表达量高于CIITA-C，在脾、甲状腺和胸腺中差异显著(p < 0.05)。
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*、**、***分别表示在同一组织中CIITA-A、CIITA-B、CIITA-C的表达量差异达显著(p < 0.05)或极显著(p < 0.01，p < 0.001) *, **, *** indicate the expression of CIITA-A, CIITA-B, CIITA-C in the same tissue was significantly different (p < 0.05), extremely significantly different (p < 0.01, p < 0.001), respectively 图 7 CIITA基因剪接突变体在猪不同组织中的表达 Fig. 7 Expression of splicing mutants of CIITA gene in different tissues of pigs |
MHC Ⅱ类分子提呈经过加工的外来抗原给CD4+T细胞的抗原受体，导致CD4+T细胞激活和分化，从而在诱发免疫应答中起重要的作用[19-22]。CIITA是MHC Ⅱ类分子重要的转录激活因子，其研究价值也变得十分重要[23-24]。CIITA作为非DNA结合转录激活因子，是调控MHC Ⅱ类分子表达最主要的转录分子之一，决定了MHC Ⅱ类分子表达的高低[25-26]。CIITA基因前体mRNA存在选择性剪切，不同的选择性剪切体形式编码不同分子量的蛋白，致使CIITA蛋白具有多样性，从而功能也产生差异，有些剪切体将不能正确启动MHC Ⅱ类分子的表达，使宿主不能发挥正常的抗原提呈功能。CIITA的剪接突变可引起机体产生一系列的症状，例如，裸淋巴细胞综合征(bare lymphocyte syndrome, BLS)主要是由于CIITA基因发生了剪接突变，终止密码子提前，导致后续所编码的蛋白质缩短，不能正常发挥功能，使患者发生感染，并引发一系列的并发症[27]。也有研究表明，人CIITA LRR丙氨酸突变既消除了CIITA的反式激活能力，又消除了具有N端缺失的CIITA突变体的显性阴性表型[28]。此外，目前异种器官移植研究已成为医学热点之一。由于人与猪的基因同源性和遗传特征较为相似，使其成为理想的动物模型，所以现在研究多集中于人与猪之间异种器官移植[29]，突变后的人CIITA(缺少N端的基因序列)可以跨越种间屏障，用该突变体抢先结合猪SLA Ⅱ类分子从而可抑制其转录[30]。对于病原体会通过使用各种策略来避免宿主发出的保护性免疫反应。为了抑制MHC Ⅱ类分子的表达和建立CD4+T细胞的依赖性免疫应答，许多病原体已经开发出干扰CIITA功能或表达的方法。例如人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)，HIV Tat蛋白通过与CIITA竞争结合从而干扰CIITA的正常功能[31]。以上的研究表明，CIITA的剪接突变在自身免疫病与移植反应中起到了十分重要的作用。
CIITA不同剪接突变体与猪品种和群体中个体差异有关，已经预测不同品种猪中均存在CIITA不同剪接突变体，苏丽娟[32]从长白猪中扩增获得了2个CIITA突变体。本研究所用的SPF大白猪和长白猪是中国农业科学院哈尔滨兽医研究所保存的一批优良试验动物，遗传背景清晰，已排除14种病原微生物，与普通级猪相比，SPF猪更容易排除无关变量及试验之外最大化的未知干扰，也可排除病原微生物引起CIITA的诱导性表达。利用RT-PCR扩增和测序共获得了3种CIITA剪接突变体形式，其中CIITA-A和CIITA-B突变体分别缺失了40和199 bp，使终止密码子提前，从而导致编码的氨基酸缩短。缺失40 bp的突变体序列与苏丽娟[32]获得的CIITA8一致。对CIITA蛋白二级结构分析发现，3个剪接突变体中α螺旋、β折叠、无规则卷曲和延长片段所占比例非常接近，进一步分析三级结构发现，缺失核苷酸突变体的蛋白结构也受到了剪接的影响，均缺失了末端富含亮氨酸的4个LRRs，使蛋白质的三级结构发生了明显的改变。现已证明，SLA基因是一个重要的抗病育种分子标记[33]。不同SLA单倍型猪对疫病抗病性不同，因此CIITA作为调控SLA Ⅱ类分子表达的反式激活因子，其剪接突变体的鉴定对抗病育种具有一定的指导意义，剪接突变体编码蛋白结构的缺失不能正确启动SLA Ⅱ类分子的表达，致使宿主不能发挥正常的抗原提呈功能，从而可能会进一步影响试验猪对疾病表现出抗性或易感性，在群体中表现出个体差异，由此可筛选出免疫功能较强的个体，提高猪的抗病力，从而有望培育出抗病力较强的品种或品系[34-35]。
与其他物种的CIITA相比较，发现猪与绵羊和牛具有较近的亲缘关系，而在不同猪品种中进行比较时，发现3种CIITA剪接突变体聚为一支，且SPF大白猪和长白猪与usmarc、皮特兰、巴美猪、荣昌猪、梅山猪和金华猪具有共同的起源。针对单个基因来讲，尤其是对被CIITA调控的SLA基因，权金强等[36]、江新杰等[37]利用来源相同的SPF大白猪和长白猪研究了SLA-1和SLA Ⅱ类分子特征，系统发育树构建结果表明，SPF大白猪和长白猪与Yucatan、韩国本地猪和梅山猪等亲缘关系较近，与本研究具有相似性，都与梅山猪亲缘关系较近。推测某些地方猪种早期培育中可能引入了大白猪或长白猪的血缘，从而表现出较近的亲缘关系。
本研究发现，不同的CIITA剪接突变体在所检测的组织中均有表达，且表达量趋势一致，均在脾或肺中表达量较高，其次是肾、脊髓、甲状腺、肝、胸腺，在心组织中表达最低，这种表达差异主要是由于不同组织主要构成细胞与功能不同引起的，CIITA蛋白可在胸腺上皮细胞中表达，也可在活化的细胞和专职的抗原提呈细胞中表达，因此，在免疫器官中表达相对较高，其他器官中相对较低。但在本研究中，与胸腺相比，不同剪接突变体在肺中的表达量较高。CIITA是SLA Ⅱ类分子的反式激活因子，而SLA Ⅱ类分子主要表达在起抗原提呈作用的专职性抗原提呈细胞，而肺泡中主要含有肺泡巨噬细胞，该细胞属于专职性抗原提呈细胞并会影响其表达量的提高。胸腺属于人体淋巴系统中的重要器官，是T淋巴细胞分化、发育和成熟的场所，由淋巴细胞和网状细胞组成，这可能是CIITA突变体在肺中表达量比胸腺中高的原因之一。此外，剪接突变可能会使功能性CIITA的表达量降低，导致其不能发挥正常功能。根据同一基因的不同转录本表达量可以区分亚型，表达量最高的转录本为主要亚型，表达量相对较低的转录本为次要亚型[38]。在CIITA-A/CIITA-C型个体同一组织中CIITA-C的表达量均高于CIITA-A，甚至在肝中达到极显著，所以在此样本中CIITA-C为主要亚型。在CIITA-B/CIITA-C型个体不同组织中，CIITA-B表达量高于CIITA-C，所以CIITA-B为主要亚型。CIITA剪接突变体在个体内表达稍有差异，表现的主要亚型有所不同，可能会对后续的CIITA在自关联、核质转运和MHC-II基因转活化方面都会表现出一定功能上的影响，其后续影响还有待进一步研究[39-40]。
4 结论本研究从SPF大白猪和长白猪中克隆测序共获得了3个CIITA剪接突变体，其中两个突变体由于终止密码子的提前致使编码CIITA蛋白的结构域受到了剪接的影响，缺失了末端富含亮氨酸的4个重复结构域，蛋白结构发生了明显的改变，而且针对CIITA，猪与绵羊和牛具有较近的亲缘关系，且在不同猪种中具有一定的保守性。CIITA不同剪接突变体在猪不同组织中均有表达，表达量稍有差异，本研究为进一步研究猪CIITA功能及其在动物体内的相关调控机制奠定了理论基础。
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